38微生物表面擦拭方法驗(yàn)證報(bào)告

1、微生物棉簽擦拭取樣方法及檢驗(yàn)方法驗(yàn)證報(bào)告文件編號(hào)：VP-01-06-00-038起草人日期審核人日期批準(zhǔn)人日期重慶麥克福新制藥VP-01-06-00-038共11頁1、概述微生物在適當(dāng)?shù)臏貪穸认乱詺埩粑镏械挠袡C(jī)物為營養(yǎng)可大量繁殖，產(chǎn)生各種代謝物，從而大大增加殘留物的復(fù)雜性和危害程度，對(duì)下批產(chǎn)品造成污染。因此必須對(duì)藥品生產(chǎn)設(shè)備的微生物進(jìn)行嚴(yán)格控制。制藥企業(yè)的生產(chǎn)場所、設(shè)備、用具等在生產(chǎn)結(jié)束后需清潔，根據(jù)GMP勺要求，清潔后應(yīng)對(duì)清潔效果進(jìn)行評(píng)價(jià)，設(shè)備表面微生物限度檢查應(yīng)符合要求，擦拭取樣優(yōu)點(diǎn)是能對(duì)最難清潔部位直接取樣，通過考察有代表性的最難清潔部位的表面微生物限度評(píng)價(jià)設(shè)備的清潔狀況。對(duì)棉簽擦拭取樣

2、方法和檢驗(yàn)方法的可行性進(jìn)行驗(yàn)證，確保清潔方法的有效性，降低藥品交叉污染和微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。2018年08月19日至8月31日，根據(jù)經(jīng)批準(zhǔn)的微生物棉簽擦拭取樣方法及檢驗(yàn)方法驗(yàn)證方案（編號(hào)：VP-01-06-00-037）,驗(yàn)證小組對(duì)微生物棉簽擦拭取樣方法及檢驗(yàn)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，驗(yàn)證過程包括擦拭取樣、菌懸液制備、回收率試驗(yàn)。在驗(yàn)證過程中嚴(yán)格按照驗(yàn)證方案及驗(yàn)證計(jì)劃進(jìn)行了驗(yàn)證，其驗(yàn)證方案在驗(yàn)證過程中沒有修改，驗(yàn)證結(jié)果完整、真實(shí)，驗(yàn)證達(dá)到預(yù)期的效果。2、驗(yàn)證依據(jù)：中華人民共和國藥典2015版四部3、驗(yàn)證目的通過對(duì)清洗消毒后微生物取樣方法的回收率試驗(yàn)，評(píng)價(jià)取樣方法的有效性、代表性和科學(xué)性，并為證明清洗方法有

3、效性提供基本依據(jù)。4、范圍本次驗(yàn)證適合微生物棉簽擦拭法取樣。5、驗(yàn)證小組成員及職責(zé)表1驗(yàn)證小組成員及職責(zé)人員姓名職位職責(zé)組長吳濤QC負(fù)責(zé)人負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案和報(bào)告的審核及實(shí)施過程監(jiān)督。成員彭雪梅QA負(fù)責(zé)驗(yàn)證過程的監(jiān)控和檢查，保證驗(yàn)證方案的實(shí)施譚裴QC1、負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的起草2、負(fù)責(zé)檢驗(yàn)操作，數(shù)據(jù)的收集、記錄的填寫李樹冰QC協(xié)助驗(yàn)證方案及報(bào)告的起草，負(fù)責(zé)對(duì)驗(yàn)證數(shù)據(jù)的復(fù)核。6、驗(yàn)證方案的實(shí)施情況1.1 證前的準(zhǔn)備1.1.1 主要驗(yàn)證用儀器儀表的確認(rèn)1.1.1.1 確認(rèn)方法：查看手提式壓力蒸汽滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、電熱恒溫干燥箱、生物安全柜校驗(yàn)日期，確定是否在有效期內(nèi)；1.1.1.2 可接受

4、標(biāo)準(zhǔn)：確認(rèn)提式壓力蒸汽滅菌鍋、生化培養(yǎng)箱、霉菌培養(yǎng)箱、電熱恒溫干燥箱、生物安全柜已經(jīng)過校驗(yàn)，校驗(yàn)合格。1.1.1.3 設(shè)備檢定情況確認(rèn)結(jié)果表2設(shè)備檢定確認(rèn)表儀器名稱規(guī)格型號(hào)檢定情況檢定部門手提式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-18SIAA生化培養(yǎng)箱SHP-250莓園培喬箱BMJ-250電熱恒溫干燥箱DHG-9141A生物安全柜BHC-800H-A2結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期1.1.2 試驗(yàn)環(huán)境確認(rèn)1.1.2.1 確認(rèn)方法：查看陽性對(duì)照室、生物安全柜的環(huán)境監(jiān)測報(bào)告，確認(rèn)懸浮粒子、風(fēng)速、沉降菌、浮游菌、表面微生物是否符合GM嗖求。1.1.2.2 可接受標(biāo)準(zhǔn)：確認(rèn)懸浮粒子、風(fēng)速、沉降菌、浮游菌、表面微

5、生物符合GM嗖求。1.1.2.3 試驗(yàn)環(huán)境確認(rèn)結(jié)果表3試驗(yàn)環(huán)境的確認(rèn)項(xiàng)目風(fēng)速懸浮粒子沉降菌浮游菌表面微生物陽性檢測室生物安全柜結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期1.1.3 驗(yàn)證用菌種及培養(yǎng)基表4菌種確認(rèn)菌種名稱編號(hào)來源購進(jìn)日期大腸埃希菌CMCC(B)44102中國藥品生物制品檢定研究院金黃色葡穩(wěn)球菌CMCC(B)26003中國藥品生物制品檢定研究院枯草芽抱桿菌CMCC(B)63501中國藥品生物制品檢定研究院白色念珠菌CMCC(B)98001中國藥品生物制品檢定研究院黑曲霉CMCC(B)98003中國藥品生物制品檢定研究院結(jié)論檢查人/日期復(fù)核人/日期表5培養(yǎng)基確認(rèn)6.1.4人員培訓(xùn)培養(yǎng)基、緩沖液名稱

6、干粉批號(hào)配制批號(hào)干粉來源胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)埴胰酪大豆豚液體培養(yǎng)埴沙氏葡錮糖瓊脂培養(yǎng)埴沙氏葡錮糖液體培養(yǎng)埴麥康凱液體培養(yǎng)基麥康凱瓊脂培喬基檢查人/日期復(fù)核人/日期驗(yàn)證操作人員應(yīng)在驗(yàn)證實(shí)施前應(yīng)對(duì)其批準(zhǔn)的驗(yàn)證方案進(jìn)行培訓(xùn)，確保驗(yàn)證人員能依照驗(yàn)證方案正確實(shí)施。培訓(xùn)時(shí)間培訓(xùn)人參加培訓(xùn)人員溯源資料確認(rèn)人/日期復(fù)核人/日期1.2 驗(yàn)證項(xiàng)目和驗(yàn)證方法1.2.1 試驗(yàn)菌株表面微生物擦拭取樣方法及檢驗(yàn)方法驗(yàn)證所用的菌株為大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、白色念珠菌、黑曲霉。試驗(yàn)菌株的傳代次數(shù)不得超過5代，并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。1.2.2 試驗(yàn)菌懸液的制備1.2.2.

7、1 接種金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽抱桿菌新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基中，于3035C培養(yǎng)1824,接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基中，于2025C培養(yǎng)4872h,上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)50100cfu的菌懸液；1.2.2.2 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基上，2025C培養(yǎng)57d,加入35mL0.9%無菌氯化鈉溶液，將抱子洗脫，然后用管口帶有無菌棉花的無菌毛細(xì)吸管吸出抱子懸液至無菌試管內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1mL含菌數(shù)（抱子數(shù)）50100cfu的菌（抱子）懸液。1.2.2.3 上述菌懸液制備后若在室溫下放置，應(yīng)

8、在2小時(shí)之內(nèi)使用。1.3 擦拭取樣法的驗(yàn)證1.3.1 供試組制備1.3.1.1 取50mnrK50mmf銹鋼材質(zhì)的無菌擦片，用已校驗(yàn)的1mL移液管吸取檢定菌懸液1mL均勻涂布于無菌擦片上，并于層流臺(tái)下吹干，取無菌棉簽1支，用無菌的0.9%氯化鈉溶液浸濕，并將其靠在錐形瓶口上擠壓至無多余的浸潤劑滴落。握住棉簽柄，在取樣點(diǎn)處選擇約為25cm2以300角與取樣表面接觸，縱向緩慢并充分擦拭，反轉(zhuǎn)棉簽，同法橫向擦拭（見圖1）,然后將棉簽端用無菌剪刀剪斷置于20mL的0.9%無菌氯化鈉溶液中，充分振搖5min，做好標(biāo)識(shí)，作為供試品溶液。每種菌平行制備兩個(gè)染菌不銹鋼載片。1.3.1.2 取全部供試品溶液，經(jīng)

9、薄膜法過濾后，用pH=7.0氯化鈉-蛋白凍緩沖液50mL沖洗濾膜，將濾膜取出，菌面朝上分別貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平皿及沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，分別于3035C培養(yǎng)72h、2025c培養(yǎng)120h,記錄各平皿上菌落數(shù)。圖1擦拭示意圖1.3.2 菌液組制備吸取菌懸液1mL加入0.9%無菌氯化鈉溶液20mL中，全部經(jīng)薄膜過濾法過濾，用PPH7.0氯化鈉-蛋白凍緩沖液50mL沖洗濾膜，將濾膜取出，菌面朝上分別貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平皿及沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，平行制備2個(gè)平皿，分別于3035C培養(yǎng)72h、2025C培養(yǎng)120h,記錄各平皿上菌落數(shù)。1.3.3 陰性對(duì)照組制備取0.9%無菌氯化

10、鈉溶液20mL代替供試品溶液，其它操作同6.3.1.21.3.4 回收率計(jì)算回收率以3次實(shí)驗(yàn)測試值的平均值計(jì)。1.3.5 可接受標(biāo)準(zhǔn)回收率>70%,RStM20%1.3.6 擦拭取樣法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見附件1）1.3.7 結(jié)論：1.4 微生物限度檢驗(yàn)方法學(xué)驗(yàn)證1.4.1 供試組制備取50mmx50mm銹鋼材質(zhì)的無菌擦片，取無菌棉簽1支，用無菌的0.9%氯化鈉溶液浸濕，并將其靠在錐形瓶口上擠壓至無多余的浸潤劑滴落。握住棉簽柄，在取樣點(diǎn)處選擇約為25cm2以30。角與取樣表面接觸，縱向緩慢并充分擦拭，反轉(zhuǎn)棉簽，同法橫向擦拭（見圖1）,然后將棉簽端用無菌剪刀剪斷置于20mL的0.9%無菌氯化鈉溶

11、液中，充分振搖5min,做好標(biāo)識(shí)，作為供試品溶液。平行制備兩個(gè)不銹鋼載片。取供試液20mL,菌懸液1mL經(jīng)薄膜過濾法過濾，將濾膜取出，菌面朝上分別貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平皿及沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，分別于3035C培養(yǎng)72h、2025c培養(yǎng)120h,記錄各平皿上菌落數(shù)。1.4.2 菌液組制備取pH=7.0氯化鈉蛋白凍緩沖液100mL加入薄膜過濾器中，過濾。取緩沖液20mL,菌懸液1mL經(jīng)薄膜過濾法過濾，將濾膜取出，菌面朝上分別貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平皿及沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，平行制備2個(gè)平皿，分別于3035C培養(yǎng)72h、2025c培養(yǎng)120h,記錄各平皿上菌落數(shù)。1.4.3 陰性

12、對(duì)照組制備取0.9%無菌氯化鈉溶液20mL,經(jīng)薄膜過濾法過濾，將濾膜取出，菌面朝上分別貼于胰酪大豆陳瓊脂培養(yǎng)基平皿及沙氏葡糖糖瓊脂培養(yǎng)基平皿上，分別于3035C培養(yǎng)72h、2025c培養(yǎng)120h,記錄各平皿上菌落數(shù)。1.4.4 回收率計(jì)算回收率以3次實(shí)驗(yàn)測試值的平均值計(jì)。1.4.5 可接受標(biāo)準(zhǔn)回收率應(yīng)70%RStM20%。1.4.6 微生物限度檢驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見附件2）1.4.7 結(jié)論：7 .再驗(yàn)證建議：若該產(chǎn)品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，需重新確認(rèn)8 .驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)及結(jié)論：9 .附件清單附件1擦拭取樣法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果附件2微生物限度檢驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果附件3驗(yàn)證報(bào)告批準(zhǔn)書附件1擦拭取樣法驗(yàn)證實(shí)

13、驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)細(xì)菌酵母菌|毒困驗(yàn)證次數(shù)實(shí)驗(yàn)組大腸埃希|菌（10-7）金黃色有萄球菌枯草芽抱桿菌（10-5）|白色念珠菌（10-5）J|黑曲霉(10-7)(10-6)平皿1212121212供試品組1菌液組陰性對(duì)照回收率（%平皿1212121212供試品組2菌液組陰性對(duì)照回收率（%平皿1212121212供試品組3菌液組陰性對(duì)照回收率（%回收率平均值（%RSD(%)試驗(yàn)人/日期復(fù)核人/日期附件2微生物限度檢驗(yàn)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)細(xì)菌酵母菌|毒困驗(yàn)證次數(shù)實(shí)驗(yàn)組大腸埃希1金黃色春枯草芽抱。色念珠|黑曲霉菌(10-7)萄球菌桿菌（105）1直(10-5)(10)(10-6)平皿1212121212供試品組1菌液組陰性對(duì)照回收率（%平皿1212121212供試品組2菌液組陰性對(duì)照回收率（%9平皿1212121212供試品組3菌液組陰性對(duì)照回收率（%9回收率平均值（%RSD(%)試驗(yàn)人/日期復(fù)核人/日期附件3驗(yàn)證