MTX壓力與表達篩選

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上MSX加壓篩選與MTX加壓篩選分子生物與細胞培養(yǎng)蛋氨酸亞氨基代砜(methionine sulfoximine, MSX)篩選用的是谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase, GS）系統(tǒng)壓力； 氨甲喋呤（amethopterin, MTX）篩選用的是二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase, dhfr）系統(tǒng)壓力。 1. CHO細胞表達體系     常用的CHO細胞系有兩種：CHO和CHO(dhfr-)，CHO(dhfr-)是缺失二氫葉酸還原酶的細胞株。CHO表達系統(tǒng)是

2、目前應(yīng)用最廣泛的真核表達系統(tǒng)之一，與其它表達系統(tǒng)相比，它具有許多優(yōu)點：準確的轉(zhuǎn)錄后修飾功能，表達的糖基化藥物蛋白在分子結(jié)構(gòu)、理化特性和生物學(xué)功能方面最接近天然蛋白分子；表達產(chǎn)物胞外分泌，便于分離純化；具有重組基因的高效擴增和表達能力；貼壁生長，有較高的耐受剪切力和滲透壓能力，可進行懸浮培養(yǎng)或在無血清培養(yǎng)基中達到高密度，培養(yǎng)體積能達到1000L以上；CHO細胞屬于成纖維細胞，很少分泌內(nèi)源蛋白，利于外源蛋白的分離純化。 改造CHO細胞，可更好地表達外源蛋白。為減少大規(guī)模細胞培養(yǎng)過程中凋亡的發(fā)生，將bcl-2基因（細胞凋亡抑制基因）導(dǎo)入細胞，bcl-2基因的過量表達能抑制Gln或氧缺乏引起的細胞凋亡

3、，減少細胞特定營養(yǎng)成分的消耗，提高細胞密度和目的蛋白產(chǎn)量。向CHO細胞中導(dǎo)入p21、p27基因，可使細胞G1期延長（細胞靜止），改造后細胞活力正常，營養(yǎng)成分消耗和代謝毒物含量有效降低，從而減少細胞凋亡、死亡，外源蛋白表達量提高，產(chǎn)品成本降低。2. 載體系統(tǒng)     借助真核基因表達調(diào)控的理論，可將較強的順式作用元件集中到一個載體中，使其方便高效地表達外源基因。目前，已經(jīng)構(gòu)建了許多真核表達載體，它們包含適當(dāng)?shù)捻樖阶饔迷瓦x擇標記。順式作用元件主要有啟動子增強子元件、轉(zhuǎn)錄剪切和Poly A信號等；CHO細胞表達載體中主要有兩類選擇標記：非擴增基因和共擴增基

4、因。2.1啟動子和增強子 啟動子是影響外源基因表達效率的關(guān)鍵因素。作為表達載體元件之一，啟動子既需強的轉(zhuǎn)錄活性，又應(yīng)具備較廣的應(yīng)用范圍。細菌的主要啟動子和增強子在動物細胞中不起作用，所以大多從啟動效率高且生物背景清楚的病毒基因組中分離得到。SV40、LTR和CMV啟動子在CHO細胞中效果良好。有研究表明：在CHO細胞中，CMV啟動子的轉(zhuǎn)錄活性分別是SV40啟動子和LTR啟動子的10倍和30倍左右。來源于噬菌體的一些啟動子，如T7啟動子也可用于動物細胞。除了病毒來源的啟動子，現(xiàn)在熱衷于尋找細胞內(nèi)源性的啟動子，如肽鏈延長因子基因的啟動子（EF-1）、雞胞漿肌動蛋白啟動子等。EF-1啟動子是迄今應(yīng)用

5、中最強的啟動子之一。目前商業(yè)化的表達載體中主要使用SV40、CMV和EF-1啟動子。 外源基因在哺乳動物細胞中的表達受許多因素的影響，如轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后處理、翻譯水平以及翻譯后加工等方面，其中尤以轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)最為重要。在細胞中轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是由基因的順式作用元件與細胞內(nèi)存在的反式作用因子之間的相互作用來實現(xiàn)，由于在特定的細胞內(nèi)，反式作用因子是固定的，不可改變的，因此基因的表達主要取決于其順式作用元件的作用。對外源基因而言，也就是決定于特定的表達載體中的啟動子，一個合適的啟動子可將外源基因的表達水平提高幾倍甚至幾十倍。但是對于特定的基因和細胞，各啟動子起始轉(zhuǎn)錄的效率有很大的差別，因此我們認為在

6、進行外源基因的表達研究中，應(yīng)考慮選用幾種不同的強啟動子，才有可能獲得較為理想的表達效果。與啟動子相連的是增強子元件，具種、組織特異性，CHO細胞中一般采用SV40和CMV增強子。2.2選擇標記和基因擴增 CHO細胞表達載體主要有兩類選擇標記。一類是neo等非擴增基因，它對目的基因的拷貝數(shù)沒有影響，用于構(gòu)建瞬時表達載體。另一類具有基因擴增的功能，也稱共擴增基因，如二氫葉酸還原酶基因（dihydrofolatereductase，dhfr），谷氨酰胺合成酶基因（glutaminesynthetase，gs）。 外源基因在CHO細胞中擴增是提高表達水平的重要策略之一。dhfr基因擴增系統(tǒng)最

7、常用，當(dāng)攜帶dhfr基因的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞后，或攜帶dhfr基因的標志質(zhì)粒與攜帶外源基因的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-細胞后，可以得到在選擇培養(yǎng)基生長的細胞克隆，dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤（Amethopterin，MTX）所抑制，不斷提高MTX濃度，絕大多數(shù)細胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細胞中，dhfr基因均得以擴增。進行性選擇抗氨甲喋呤的細胞系，結(jié)果會導(dǎo)致與dhfr串聯(lián)在一起的外源基因的共擴增，拷貝數(shù)可增加幾百到幾千倍，從而使目的基因高水平表達，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴增的區(qū)域遠遠大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴增。但它也有

8、缺陷，表達細胞僅限dhfr缺陷型細胞，重復(fù)篩選抗性細胞費時費力，去除選擇壓力后，擴增基因不穩(wěn)定。細胞遺傳學(xué)表明，在選擇壓力下，擴增基因的大小和結(jié)構(gòu)處在不斷變化之中。在細胞分裂的不同時間，不同的宿主細胞和選擇藥物使基因的擴增范圍處于不斷變化之中，從1001000kb。即使是同一種細胞，選擇過程不同，基因擴增的范圍也不同。谷氨酰胺合成酶（GS）擴增系統(tǒng)是新近發(fā)展的更有效的系統(tǒng)，具有更高的擴增效率，但細胞長期連續(xù)培養(yǎng)時，生長狀況不佳，DHFR系統(tǒng)表達水平雖較GS系統(tǒng)低，但細胞生長穩(wěn)定。 基因擴增還可通過弱化選擇標記基因表達來達到。弱化選擇標記基因的表達，在使用與常規(guī)的表達載體相同的選擇壓力時，dhf

9、r基因拷貝數(shù)更高，外源基因的表達水平也得到提高。如一種雙順反子載體將dhfr基因連在外源基因的3端，從而位于外源基因3端下游的dhfr基因的翻譯起始效率大大降低，dhfr基因表達被弱化。另一種載體將dhfr基因插入人工合成的內(nèi)含子內(nèi)部，兩邊為剪接供體SD和剪接受體SA，外源基因在內(nèi)含子的下游，mRNA剪切時，95%的dhfr mRNA被剪切掉。也有一些表達質(zhì)粒不含選擇基因，則必須共轉(zhuǎn)染一個可表達選擇基因的標志質(zhì)粒，如pSV dhfr,該質(zhì)粒由Psv2 dhfr去除SV40的增強子構(gòu)建而成，起到弱化dhfr基因表達的作用。2.3其它 表達載體引入天然或人工合成的內(nèi)含子序列，有利于外源基因組DNA

10、轉(zhuǎn)錄的mRNA剪接內(nèi)含子，增加穩(wěn)定性，提高翻譯效率，許多真核表達載體帶有SV40的內(nèi)含子。但因大多數(shù)插入的外源基因是cDNA，所以一般也用不著剪接信號。真核基因的mRNA加工需要多聚腺苷酸加尾信號（pA），實驗表明，除去pA后，外源蛋白表達量降低90%。目前多采用SV40的晚期及早期pA、牛生長素基因的pA和人工合成的pA。3. 外源基因     啟動子之后是克隆的基因組DNA或cDNA?；蚪MDNA比cDNA表達量要高，應(yīng)盡量使用基因組DNA。除此之外，可以通過下列方法增加外源基因的表達量：(1)在基因起始密碼子的前后設(shè)置Kozak序列，即GCCGCC

11、A-3/GCCA UGG+4，其中最重要的是-3位的嘌呤，其次是+4位的嘌呤。具有Kozak序列與否，翻譯起始強弱會有一個數(shù)量級的差異；(2)盡量切除cDNA中的不必要序列，一方面降低轉(zhuǎn)錄、翻譯時不必要的能量消耗，另一方面減少5未翻譯前導(dǎo)區(qū)和克隆中的GC尾部對表達水平的不良影響，以及減少3未翻譯區(qū)對mRNA穩(wěn)定性的不良影響； (3)拼接一個重組蛋白的信號前導(dǎo)肽，它可以有效地指導(dǎo)合成、分泌蛋白的輸出等；(4)在不改變蛋白氨基酸序列的前提下，修飾個別基因的編碼序列，解決密碼偏性問題。實際表達中，可根據(jù)表達效果，對基因加以改造，以提高表達量。4. 表達克隆的篩選   &

12、#160; 不同的細胞克隆，外源蛋白表達水平高低不同，原因可能有二方面，一是外源質(zhì)粒片段整合入細胞染色體的位置不同，有的區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性高，有的轉(zhuǎn)錄活性低；二是不同的細胞克隆，質(zhì)粒的拷貝數(shù)是不同的。挑選高表達的單克隆細胞株一般采用兩種流程：第一種方案首先通過檢測外源基因的表達，逐一篩選dhfr陽性單克隆，再轉(zhuǎn)到濃度持續(xù)升高的MTX之下生長，分別進行擴增；另一種方法先把dhfr陽性單克隆合并，在不斷升高的MTX之下加壓擴增外源基因的表達，最后挑出穩(wěn)定的、高表達的單克隆細胞株。加壓擴增外源基因表達，除了單純使用dhfr擴增系統(tǒng)或GS擴增系統(tǒng)外，也可采用G418與MTX聯(lián)合作用細胞，G418與MSX（m

13、ethioninesulphoximine，GS抑制物）聯(lián)合作用細胞，或者利用dhfr擴增系統(tǒng)與GS擴增系統(tǒng)共加壓。 混合克隆的表達水平遠趕不上表達較高的單個克隆，這是因為轉(zhuǎn)染的CHO細胞中存在不表達或低表達的非生產(chǎn)細胞，并可在長期生存，甚至MTX加壓時占生長優(yōu)勢，排斥其它高表達細胞，成為細胞群體中的主要部分，導(dǎo)致產(chǎn)量嚴重下降，并對MTX加壓無反應(yīng)。當(dāng)撤除MTX，會發(fā)生外源蛋白表達量下降的情況，原因也可能在此。 5. 工程細胞大規(guī)模培養(yǎng)     細胞培養(yǎng)是現(xiàn)代生物學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)之一。它的突出優(yōu)點，一是研究對象是活的細胞，可長時期地監(jiān)

14、控、檢測甚至定量評估其形態(tài)、結(jié)構(gòu)和生命活動等；二是可以人為地嚴格控制研究條件，便于研究各種物理、化學(xué)、生物等外界因素對細胞生長、發(fā)育和分化等的影響，有利于單因子分析；三是研究的樣本可以達到比較均一性。常用的細胞系均是性質(zhì)均一的細胞，需要時還可采用克隆化等方法使細胞進一步純化；四是研究的內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄。體外培養(yǎng)的細胞可采用顯微鏡，電鏡等直接觀察記錄，充分滿足實驗的要求。另外還具有研究范圍比較廣泛，研究費用相對經(jīng)濟等優(yōu)點。 然而，細胞培養(yǎng)也有其局限性。由于培養(yǎng)的細胞脫離了機體復(fù)雜的環(huán)境條件，其細胞形態(tài)和功能都會發(fā)生一定程度的改變。尤其是體外反復(fù)傳代、長期培養(yǎng)的細胞，有可能發(fā)生染色體非二倍

15、體改變等情況。因此，應(yīng)將體外培養(yǎng)的細胞視為一種既保持動物體內(nèi)原細胞一定的性狀又具有某些改變的特定的細胞群體。 由于細胞培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點是其他實驗方法和技術(shù)所不能比擬的，所以近年來細胞培養(yǎng)技術(shù)在分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、遺傳學(xué)、老年學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)和病毒學(xué)等很多領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用，其中對于分子生物學(xué)家及細胞生物學(xué)家而言，應(yīng)用細胞培養(yǎng)對感興趣的基因產(chǎn)物進行定位、運動及功能研究變得越來越重要。在克隆一個基因后的下一步，往往是將其導(dǎo)入不同類型細胞，以分析其表達，測定表達對細胞生長的影響，或?qū)⒏弑磉_的基因產(chǎn)物純化。5.1 血清 利用含血清培養(yǎng)基生產(chǎn)蛋白制品有許多不利，如增加培養(yǎng)成本和污染機會，增加純化

16、難度和成本，增加產(chǎn)品質(zhì)控指標。因此，大規(guī)模生產(chǎn)臨床使用的生物制品，應(yīng)盡量減少血清的用量，最好用無血清培養(yǎng)基取代。為此，應(yīng)盡可能增加大規(guī)模細胞培養(yǎng)的接種密度，以縮短生長延滯期，提高細胞比生長速率。如果接種密度較低時，在培養(yǎng)開始階段，可使用含血清培養(yǎng)基，待細胞密度達到一定濃度(如>106/ml)，細胞進入對數(shù)生長期，再降低血清濃度或使用無血清培養(yǎng)基。外源蛋白的實際產(chǎn)量無明顯下降。許多實驗表明，細胞的比生長速度相對降低時，產(chǎn)物的比生長速率提高，原因可能是用于細胞增殖的能量減少，有利于外源蛋白的生產(chǎn)。 使用無血清培養(yǎng)墓代替含血清培養(yǎng)基，可克服血清帶來的弊端。但失去血清中的促細胞生長因子，細胞生長

17、減慢，密度降低，生存周期縮短，導(dǎo)致蛋白產(chǎn)最下降。因此，往往通過增加無血清培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，以優(yōu)化細胞培養(yǎng)，提高蛋白表達。用作血清替代成份的種類很多，大致可分為激素和生長因子、結(jié)合蛋白、貼壁和擴展因子及低分子量營養(yǎng)因子四類。有研究報道，添加BSA對促進細胞生長作用顯著，丙酮酸鈉、腐胺、丁酸鈉有利于表達目的產(chǎn)物。不同的CHO工程細胞的培養(yǎng)基添加成份可能存在差異，一般需要自己進行摸索最優(yōu)條件。5.2 氧氣和二氧化碳 一般認為動物細胞培養(yǎng)的適宜溶氧在10%60%之間，過高可損傷細胞膜甚至DNA，從而導(dǎo)致細胞死亡。而溶氧過低又會改變細胞的代謝，降低細胞蛋白表達水平，甚至因缺氧而導(dǎo)致細胞逐漸死亡。胡顯文

18、等在利用多孔微載體大規(guī)模培養(yǎng)CHO細胞時發(fā)現(xiàn)，溶氧維持在20%45%時，對細胞表達產(chǎn)物和葡萄糖代謝無明顯影響，但溶氧降至7%9%時，細胞表達水平明顯降低，葡萄糖代謝轉(zhuǎn)化為乳酸 的比例上升，培養(yǎng)基的有效利用率明顯降低。 隨著細胞培養(yǎng)規(guī)模和密度的增大，可導(dǎo)致CO2積聚，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用或者改變細胞代謝水平。CHO細胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器中，最適CO2水平為4%10%。當(dāng)達到14%時便會阻礙細胞生長。高CO2分壓使重組CHO細胞系的生長和組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)產(chǎn)率均受到抑制，而且t-PA糖鏈中包含N-羥乙酰神經(jīng)氨酸的唾液酸比例稍下降。5.3 氮和乳酸 氨和乳酸是細胞培養(yǎng)過程中的主要

19、代謝副產(chǎn)品。與乳酸相比，較低濃度的氨就會對重組CHO細胞產(chǎn)生明顯的抑制作用，最終的細胞密度隨著氨濃度的提高而降低。氨來源于兩方面：一是直接來源于培養(yǎng)基，一是細胞代謝產(chǎn)生。二者都涉及谷氨酸胺，因此需要防止培養(yǎng)基中Gln自然分解，限制Gln用量，并盡量去除培養(yǎng)基中的氨。乳酸是細胞糖代謝的產(chǎn)物，高濃度的乳酸也會抑制細胞的生長。氨和乳酸對細胞的毒性作用在多種不同的細胞系均存在，不同細胞系對于這兩種代謝產(chǎn)物的耐受性差別很大，原因可能是不同細胞系葡萄糖和谷氨酰胺代謝過程中關(guān)鍵酶的敏感性不同，或者在不良的生長環(huán)境下，氨基酸代謝發(fā)生改變。由于Gln和葡萄糖代謝的相互影響，因此降低培養(yǎng)基中葡萄糖濃度以及減少乳酸

20、產(chǎn)生的同時，必須平衡葡萄糖和Gln的比例。6. 問題和展望     外源蛋白在CHO細胞中表達的影響因素非常復(fù)雜，建立穩(wěn)定、高效表達的重組CHO細胞系并非易事。目前主要存在問題如下：重組CHO細胞生產(chǎn)效率低；某些糖基化表達產(chǎn)物不穩(wěn)定，不易純化；重組CHO細胞上游構(gòu)建與下游分離純化脫節(jié)，主要表現(xiàn)為上游構(gòu)建時著重考慮它的高效表達，而對產(chǎn)物的分離純化過程考慮較少；重組細胞培養(yǎng)費用昂貴，自動化水平低下。 重組蛋白在CHO細胞中高效表達是一個涉及多學(xué)科的問題，需多個研究領(lǐng)域的共同合作探討?？蒲腥藛T可能把以下問題作為今后的主攻方向：提高表達水平，如尋找一些新的強啟動

21、子和合適的增強子、在載體上裝配適合基因高效表達的必要元件、根據(jù)CHO細胞翻譯特點，調(diào)整外源基因密碼子等；注重分離純化的問題，如改變DNA中的個別序列，使表達產(chǎn)物在不影響生物活性的前提下，攜帶有利于分離純化的基因；細胞培養(yǎng)的低成本、高密度、高產(chǎn)量和培養(yǎng)設(shè)備的大型化，自動化、精巧化；分離純化的低成本和高活性回收率等方面。 討論     有些天然的具有生物活性的蛋白類物質(zhì)，在人類疾病的治療中發(fā)揮著巨大的作用。但是這些活性物質(zhì)，有些在自然界中含量很少，滿足不了人們的需要；有些含異源蛋白太多，純化難度大等缺點，基因工程藥物的產(chǎn)生解決了這些難題，具有跨時代

22、的意義，是生物技術(shù)水平發(fā)展的重要標志之一。重組蛋白質(zhì)藥物具有活性高、用量少、易于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點，是國內(nèi)外生物藥物開發(fā)的重點。     細胞表達源蛋白最重要的是要保持其天然結(jié)構(gòu)及活性。而早期的原核表達系統(tǒng)不能分泌有活性的蛋白，都是以內(nèi)涵體的形式存在的，真核表達系統(tǒng)因為具有轉(zhuǎn)錄后的修飾加工功能，包括蛋白折疊、二硫鍵形成、亞基多聚化、肚鏈裂解、蛋白磷酸化以及N型和O型糖基化等，因而表達的重組蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面更接近于天然的蛋白分子，具有生物活性，可分泌胞外。CHO細胞是外源蛋白表達運用得較為成功的哺乳動物細胞，其用于外源基因表達也具有很多優(yōu)點，如外源基因能

23、夠穩(wěn)定整合于細胞染色體內(nèi)，易于規(guī)?；囵B(yǎng)等。     由于CHO-dhfr-細胞自身缺失二氫葉酸還原酶（dhfr），無法自身合成四氫葉酸，所以必須在添加了次黃嘌呤（hypoxanthine）、胸腺嘧啶（Thymidine）和甘氨酸的培養(yǎng)液中才能得以存活。而通過目的基因與dhfr基因共轉(zhuǎn)染，不僅得到在不含上述添加劑的培養(yǎng)基上也能生長的細胞克隆，更為重要的是由于dhfr可被葉酸類似物MTX所抑制，在MTX濃度選擇壓力下，dhfr基因必須擴增到很多的拷貝數(shù)才能生存，從而得到抗MTX細胞系；又由于與dhfr基因共轉(zhuǎn)染的目的基因傾向于同它一起整合到細胞染

24、色體上的同一區(qū)域，所以編碼外源重組蛋白的序列片段也隨著dhfr基因的擴增而擴增，我們就得到了能大量表達外源蛋白的細胞克隆，這在基因工程抗體及各種基因工程蛋白的表達中是可行度很高的一種措施。     上面也提到影響重組蛋白在CHO細胞中表達的因素很多，涉及CHO細胞表達體系、表達載體系統(tǒng)、外源基因、表達細胞株的加壓擴增與篩選、細胞大規(guī)模培養(yǎng)等。我認為表達載體的構(gòu)建是影響細胞能否表達的關(guān)鍵問題，因為dhfr基因及鄰近區(qū)段染色體DNA拷貝數(shù)是共擴增的關(guān)系，因此必須將外源基因片段整合到dhfr基因的上游或者下游，位置不能太遠，否則無論如何篩選也得不到表達外源基因產(chǎn)物的細胞，因此說它是能否表達的關(guān)鍵，當(dāng)然其它步驟也不能忽略，如CHO-dhfr-細胞轉(zhuǎn)染、使用強啟動子等。如果構(gòu)建成功可以產(chǎn)生外源蛋白，那么篩選高表達的細胞株等操作就是提高外源蛋白表達量的問題，使外源蛋白高效表達，也是很有意義的，為大規(guī)模培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。