第16章紫外-可見(jiàn)分光光度法

1、紫外紫外- -可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)分光光度法 第第 16 章章Visible Spectrophotometry and Ultraviolet Spectrophotometry內(nèi)容提要內(nèi)容提要:2.分光光度法的基本原理分光光度法的基本原理 透光率與吸光度透光率與吸光度 朗伯朗伯-比爾定律比爾定律 1.物質(zhì)的吸收光譜物質(zhì)的吸收光譜 物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收 物質(zhì)的吸收光譜物質(zhì)的吸收光譜4.提高測(cè)量靈敏度與準(zhǔn)確度的方法提高測(cè)量靈敏度與準(zhǔn)確度的方法 分光光度法的誤差分光光度法的誤差 提高測(cè)量靈敏度與準(zhǔn)確度的方法提高測(cè)量靈敏度與準(zhǔn)確度的方法3.紫外紫外-可見(jiàn)分光光度法可見(jiàn)分光光度法

2、分光光度計(jì)分光光度計(jì) 定量分析方法定量分析方法 5.紫外分光光度法應(yīng)用簡(jiǎn)介紫外分光光度法應(yīng)用簡(jiǎn)介 752型分光光度計(jì)型分光光度計(jì) 紫外分光光度法的應(yīng)用紫外分光光度法的應(yīng)用 重點(diǎn)：難點(diǎn)：1.朗伯朗伯-比爾定律比爾定律 2.物質(zhì)的吸收光譜物質(zhì)的吸收光譜物質(zhì)的吸收光譜物質(zhì)的吸收光譜第一節(jié)第一節(jié) 物質(zhì)的吸收光譜物質(zhì)的吸收光譜一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收一、物質(zhì)對(duì)光的選擇性吸收 M(基態(tài)基態(tài)) + h M*(激發(fā)激發(fā)態(tài)態(tài)) 物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇物質(zhì)對(duì)光的吸收具有選擇性，若溶液選擇性地吸收了某性，若溶液選擇性地吸收了某種顏色的光，則溶液呈吸收光種顏色的光，則溶液呈吸收光的互補(bǔ)光。的互補(bǔ)光。白白紅紅橙橙黃黃綠

3、綠藍(lán)綠藍(lán)綠藍(lán)藍(lán)綠藍(lán)綠藍(lán)紫紫二、物質(zhì)的吸收光譜二、物質(zhì)的吸收光譜吸光度吸光度A(absorbance) :溶液對(duì)一溶液對(duì)一定波長(zhǎng)光的吸收程度。定波長(zhǎng)光的吸收程度。吸收曲線或吸收光譜吸收曲線或吸收光譜:以吸光度以吸光度A對(duì)對(duì)波長(zhǎng)波長(zhǎng) 作圖所得曲線。作圖所得曲線。 max :吸收光譜中，吸光度最大處的吸收光譜中，吸光度最大處的波長(zhǎng)。波長(zhǎng)。 max是是定性鑒別定性鑒別物質(zhì)的基礎(chǔ)，物質(zhì)的基礎(chǔ)，不同濃度的溶液，不同濃度的溶液， max不變，濃度與不變，濃度與峰值成正比，這是進(jìn)行峰值成正比，這是進(jìn)行定量分析定量分析的依的依據(jù)。據(jù)。 n圖圖16-1三三(鄰二氮菲鄰二氮菲)合鐵合鐵(II)離子的吸收離子的吸收光

4、譜圖光譜圖 max=508nm圖圖16-2 不同物質(zhì)不同物質(zhì)(A,B,C)和不和不同濃度同濃度(1, 2, 3, 4)的同一物質(zhì)的同一物質(zhì)(B)的吸收光譜的吸收光譜(濃度濃度: 1 2 3 4) 注意：注意：1.同物質(zhì)的溶液，同物質(zhì)的溶液，不僅其光吸收曲不僅其光吸收曲線形狀有差別，線形狀有差別，最大吸收波長(zhǎng)也最大吸收波長(zhǎng)也不同。不同。 2.最大吸收波長(zhǎng)與最大吸收波長(zhǎng)與物質(zhì)的濃度無(wú)關(guān)，物質(zhì)的濃度無(wú)關(guān)，是定性分析的依是定性分析的依據(jù)。據(jù)。 三三 對(duì)于有機(jī)物來(lái)說(shuō)，能吸收光子產(chǎn)生電子躍遷的對(duì)于有機(jī)物來(lái)說(shuō)，能吸收光子產(chǎn)生電子躍遷的電子有電子有電子、電子、電子（即價(jià)電子）和電子（即價(jià)電子）和n電子（即非電

5、子（即非鍵電子）等三種。當(dāng)有機(jī)化合物吸收紫外或可見(jiàn)光鍵電子）等三種。當(dāng)有機(jī)化合物吸收紫外或可見(jiàn)光時(shí)，這些電子將躍遷到較高的能級(jí)狀態(tài)。故能發(fā)生時(shí)，這些電子將躍遷到較高的能級(jí)狀態(tài)。故能發(fā)生的躍遷有的躍遷有*、n*、n*和和*等四種類(lèi)型。等四種類(lèi)型。圖圖16-3表示了這四種電子躍遷和相應(yīng)的躍遷能級(jí)。表示了這四種電子躍遷和相應(yīng)的躍遷能級(jí)。 1. *躍遷：躍遷： 飽和烴（甲烷，乙烷） E很高， n * * n *圖圖16-3 分子中電子分子中電子能級(jí)和躍遷能級(jí)和躍遷 注：注：紫外光譜電子躍遷類(lèi)型 ： n *躍遷 *躍遷 飽和化合物無(wú)紫外吸收 電子躍遷類(lèi)型與分子結(jié)構(gòu)及存在基團(tuán)有密切聯(lián)系根據(jù)分子結(jié)構(gòu)推測(cè)可能

6、產(chǎn)生的電子躍遷類(lèi)型；根據(jù)吸收譜帶波長(zhǎng)和電子躍遷類(lèi)型 推測(cè)分子中可能存在的基團(tuán)（分子結(jié)構(gòu)鑒定）第二節(jié)第二節(jié) 分光光度法基本原理分光光度法基本原理一、透光一、透光率率 (transmittance)和吸光度和吸光度 I0 = Ia + It + IrI0-入射光強(qiáng)度入射光強(qiáng)度 It-透過(guò)光強(qiáng)度透過(guò)光強(qiáng)度Ia-吸收光強(qiáng)度吸收光強(qiáng)度Ir-反射損失反射損失Ir 吸收池材料和厚度相同，被測(cè)溶液吸收池材料和厚度相同，被測(cè)溶液和參比溶液的和參比溶液的Ir影響相互抵消：影響相互抵消： 一般一般Ir很?。汉苄。?I0 = Ia + It 吸收光譜中，用吸收光譜中，用I表示表示透過(guò)光強(qiáng)度透過(guò)光強(qiáng)度 透光率透光率T：

7、 It T = I0t0lglgII=T-=AA ：吸光度吸光度二、二、Lambert-Beer定律定律 Lambert-Beer定律：定律： A = k b c K-吸光系數(shù)吸光系數(shù) b-吸光液層的厚度吸光液層的厚度(光程光程)， cm c-吸光物質(zhì)的濃度，吸光物質(zhì)的濃度， g L-1, mol L-1吸光系數(shù)吸光系數(shù)(K)入射光波長(zhǎng)入射光波長(zhǎng)物質(zhì)的性質(zhì)物質(zhì)的性質(zhì)溫度溫度與濃度無(wú)關(guān)，只是符號(hào)、取值與濃度與濃度無(wú)關(guān)，只是符號(hào)、取值與濃度的單位相關(guān)的單位相關(guān)c：mol L-1K 摩爾吸光系數(shù)，摩爾吸光系數(shù)，L mol 1 cm -1c：g L-1K a質(zhì)量吸光系數(shù)，質(zhì)量吸光系數(shù)， L g 1 c

8、m -1Ab cAa b c吸光系數(shù)吸光系數(shù) = aMB%11%111 .010cmcmEME吸光系數(shù)可用比吸光系數(shù)吸光系數(shù)可用比吸光系數(shù)E1cm 1%表示表示比吸光系數(shù)比吸光系數(shù):一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液的濃度為一定波長(zhǎng)時(shí)，溶液的濃度為1%(g/ml)，厚度為，厚度為1cm吸光度吸光度，E1cm1%與與 和和a的關(guān)系分別為：的關(guān)系分別為：例 溶液中鐵()濃度為5.010-4 gL-1的，與1,10-鄰二氮雜菲反應(yīng)，生成橙紅色絡(luò)合物，該絡(luò)合物在波長(zhǎng)508 nm，比色皿厚度為2cm時(shí)，測(cè)得A=0.190 。計(jì)算1,10-鄰二氮雜菲亞鐵的a及。(已知鐵的相對(duì)原子質(zhì)量為55.85)解：根據(jù)比耳定律：A =

9、a b c -1-1-410.190acm5.0 10 g L2cm190 L gAcb-1-14-1-11cm1.1 10molcma190 L g55.85g molML例題例題11-2 某試液顯色后用某試液顯色后用2.0 cm吸收池測(cè)定時(shí)吸收池測(cè)定時(shí)T50.0 %，若用若用1.0 cm或或5.0 cm吸收池測(cè)定，吸收池測(cè)定，T及及A各為多少？各為多少？應(yīng)用應(yīng)用Lambert-Beer定律時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)：定律時(shí)，需注意以下幾點(diǎn)： 1、Lambert-Beer定律僅適用于單一波長(zhǎng)的單色光。定律僅適用于單一波長(zhǎng)的單色光。入射光的波長(zhǎng)范圍越寬，則測(cè)定結(jié)果越容易偏離入射光的波長(zhǎng)范圍越寬，則測(cè)定

10、結(jié)果越容易偏離Lambert-Beer定律。定律。 2、吸收過(guò)程中各物質(zhì)間無(wú)相互作用，但各物質(zhì)的、吸收過(guò)程中各物質(zhì)間無(wú)相互作用，但各物質(zhì)的吸光度具有加和性。即吸光度具有加和性。即 A = Aa+ Ab + Ac + 3、入射光波長(zhǎng)不同時(shí)，、入射光波長(zhǎng)不同時(shí)， 也不同。也不同。 越大，溶液對(duì)入越大，溶液對(duì)入射光的吸收越強(qiáng)，測(cè)定的靈敏度越高。射光的吸收越強(qiáng)，測(cè)定的靈敏度越高。 4、分光光度法僅適用于微量組分的測(cè)定。、分光光度法僅適用于微量組分的測(cè)定。n例例13-2：測(cè)試酶與腺苷酸：測(cè)試酶與腺苷酸(AMP)體系的吸光體系的吸光度如下：度如下：A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0

11、.58，試試計(jì)算每一組分的濃度。計(jì)算每一組分的濃度。n 已知：酶的已知：酶的 (280nm) = 2.96 104L mol-1 cm-1n (260nm) = 1.52 104L mol-1 cm-1n AMP的的 (280nm) = 2.4 103L mol-1 cm-1n (260nm) = 1.5 104L mol-1 cm-1n 吸收池厚度為吸收池厚度為1.00cm。 n解：設(shè)酶和解：設(shè)酶和AMP的濃度分別為的濃度分別為y和和z：n 為為260nm時(shí)：時(shí)： n 0.58 = 1.52 104 1.00y + 1.5 104 1.00zn 為為280nm時(shí)：時(shí)： n 0.46 = 2.

12、96 104 1.00y + 2.4 103 1.00zn 解方程得：解方程得：y = 1.4 10-5（mol L1） n z = 2.5 10-5（mol L-1）n即：即： 酶的濃度為酶的濃度為1.4 10-5 mol L1，n AMP的濃度為的濃度為2.5 10-5 mol L-1 。 第三節(jié) 可見(jiàn)分光光度法 n一、分光光度計(jì)一、分光光度計(jì) (spectrophotomete )n主要部件：主要部件： 光源光源 單色器單色器 檢測(cè)器檢測(cè)器 吸收池吸收池 指示指示器器光光 源：鎢燈，發(fā)出源：鎢燈，發(fā)出3203200nm的連續(xù)光譜。的連續(xù)光譜。單色器：以棱鏡或光柵分光，提供單色光。單色器：

13、以棱鏡或光柵分光，提供單色光。吸收池：分光光度計(jì)中用來(lái)盛放溶液的容器。吸收池：分光光度計(jì)中用來(lái)盛放溶液的容器。檢測(cè)器：將通過(guò)吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再檢測(cè)器：將通過(guò)吸收池的光轉(zhuǎn)換為光電流，再經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。經(jīng)放大輸入指示器，然后顯示。指示指示器：顯示器：顯示A或或T 。1、光源、光源要求：要求：波長(zhǎng)范圍寬，連續(xù)光譜，強(qiáng)度足夠，穩(wěn)定波長(zhǎng)范圍寬，連續(xù)光譜，強(qiáng)度足夠，穩(wěn)定可見(jiàn)光譜：可見(jiàn)光譜： 鎢燈鎢燈 (612V) 3202500nm 碘鎢燈碘鎢燈(612V) 發(fā)光強(qiáng)度高壽命長(zhǎng)發(fā)光強(qiáng)度高壽命長(zhǎng)紫外光譜：紫外光譜： 氫燈氫燈 180375nm 氘燈氘燈 發(fā)光強(qiáng)度發(fā)光強(qiáng)度 使用壽命比氫燈增加

14、使用壽命比氫燈增加23倍倍 都需要電壓穩(wěn)定的電源供電。都需要電壓穩(wěn)定的電源供電。2、單色器、單色器棱鏡單色器：棱鏡單色器： 單色光純度由棱鏡的色散率和出射狹縫寬度決定單色光純度由棱鏡的色散率和出射狹縫寬度決定玻璃棱鏡用于玻璃棱鏡用于3503200nm波長(zhǎng)，可見(jiàn)分光光度計(jì)波長(zhǎng)，可見(jiàn)分光光度計(jì)石英棱鏡用于石英棱鏡用于1854000nm波長(zhǎng)，紫外波長(zhǎng)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)可見(jiàn)分光光度計(jì)光柵單色器：光柵單色器： 利用光的衍射和干射作用制成的元件利用光的衍射和干射作用制成的元件優(yōu)點(diǎn)：適用波長(zhǎng)范圍寬，色散均勻，分率高優(yōu)點(diǎn)：適用波長(zhǎng)范圍寬，色散均勻，分率高缺點(diǎn)：有重疊和相互干擾缺點(diǎn)：有重疊和相互干擾3、吸收

15、池、吸收池比色皿比色皿玻璃比色皿玻璃比色皿 用于可見(jiàn)光用于可見(jiàn)光石英比色皿用于石英比色皿用于400nm的紫外光的紫外光比色皿的質(zhì)量要求：無(wú)色、透明、耐腐蝕、同一比色皿的質(zhì)量要求：無(wú)色、透明、耐腐蝕、同一厚度的透光率誤差厚度的透光率誤差 Cs）適宜適宜 高高 濃度的測(cè)定濃度的測(cè)定ACCxAx差示工作曲線差示工作曲線方法：方法：標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液Cs 、 C1、C2、C3。以以Cs作參比，調(diào)作參比，調(diào)A = 0. 測(cè)測(cè)C1 、C2、C3的的A。4.示差法示差法作作AC差示工作曲線差示工作曲線.同條件下測(cè)同條件下測(cè)Ax.從中查出從中查出Cx.第四節(jié) 提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法n一、分光光度法的誤差一

16、、分光光度法的誤差n1、儀器測(cè)定誤差、儀器測(cè)定誤差 n光電管靈敏性差、光源光電管靈敏性差、光源不穩(wěn)定及讀數(shù)不準(zhǔn)。不穩(wěn)定及讀數(shù)不準(zhǔn)。n透光率誤差透光率誤差 T引起濃度引起濃度誤差誤差 c：n透光率透光率20% 65%，A為為0.20.7時(shí)，濃度相對(duì)誤時(shí)，濃度相對(duì)誤差較小。差較小。 測(cè)量誤差和透光率的關(guān)系 TTTcclg0.434n2、溶液偏離、溶液偏離Beer定律定律 偏離偏離Beer定律，定律，A-c曲線曲線彎曲。主要原因：彎曲。主要原因：化學(xué)因素化學(xué)因素 吸光物質(zhì)吸光物質(zhì)發(fā)生解離、締合、溶發(fā)生解離、締合、溶劑化等現(xiàn)象；劑化等現(xiàn)象；光學(xué)因素光學(xué)因素 復(fù)色光引復(fù)色光引起對(duì)起對(duì)Beer定律的偏離。

17、定律的偏離。主觀誤差主觀誤差兩種不同吸光系數(shù)的混合光對(duì)Beer定律的偏離 1、選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑、選擇適當(dāng)?shù)娘@色劑靈敏度高靈敏度高 選擇性好選擇性好顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收顯色劑在測(cè)定波長(zhǎng)處無(wú)明顯吸收反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定。反應(yīng)生成的有色化合物組成恒定。二、提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法二、提高測(cè)量靈敏度和準(zhǔn)確度的方法2. 選擇合適的測(cè)定條件選擇合適的測(cè)定條件 (1)入射光波長(zhǎng)的選擇入射光波長(zhǎng)的選擇 一般選擇一般選擇max作為入射光的波長(zhǎng)，但有干擾存在作為入射光的波長(zhǎng)，但有干擾存在時(shí)，應(yīng)兼顧靈敏度和選擇性來(lái)選擇入射光的波長(zhǎng)。時(shí)，應(yīng)兼顧靈敏度和選擇性來(lái)選擇入射光的波長(zhǎng)。 根據(jù)朗伯根據(jù)朗伯-

18、比耳定律比耳定律 ，兩邊微分得，兩邊微分得: ，或，或 abcTlgTTdTcdclg434. 0TTTcclg434. 0 對(duì)于一定的光度計(jì)，對(duì)于一定的光度計(jì)，T是是一個(gè)常數(shù)，故以一個(gè)常數(shù)，故以c/c對(duì)對(duì)T（或（或A）作圖）作圖 ,可知：可知：a.透光度在透光度在10% 70%，或吸，或吸光度在光度在1.0 0.15，濃度的相，濃度的相對(duì)誤差較小對(duì)誤差較小 ;b.透光度在透光度在36.8%或吸光度在或吸光度在0.434時(shí)，測(cè)定的相對(duì)誤差最時(shí)，測(cè)定的相對(duì)誤差最小。小。 (2)光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇光度計(jì)讀數(shù)范圍的選擇 3. 空白溶液的選擇空白溶液的選擇 n參比液選用原則：使測(cè)量的A真正反映待測(cè)物

19、濃度4、共存離子的干擾及其消除、共存離子的干擾及其消除控制顯色反應(yīng)的酸度控制顯色反應(yīng)的酸度 加入掩蔽劑加入掩蔽劑 分離干擾離子分離干擾離子n16.5 紫外分光光度法的應(yīng)用紫外分光光度法的應(yīng)用n一、定性鑒別一、定性鑒別比較比較 max、 ( max)或或a( max) 比較吸光度比較吸光度(或吸光系數(shù)的比值或吸光系數(shù)的比值) 二、定量測(cè)定二、定量測(cè)定 如雜質(zhì)檢查如雜質(zhì)檢查 如果化合物在紫外如果化合物在紫外-可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有明顯吸收，而所含雜可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有明顯吸收，而所含雜質(zhì)有較強(qiáng)的吸收，那么含有少量雜質(zhì)就可用光譜檢查出來(lái)。質(zhì)有較強(qiáng)的吸收，那么含有少量雜質(zhì)就可用光譜檢查出來(lái)。例如，乙醇和環(huán)己烷中若含少量雜質(zhì)苯，苯在例如，乙醇和環(huán)己烷中若含少量雜質(zhì)苯，苯在256 nm處處有吸收峰，而乙醇和環(huán)己烷在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，乙醇中含有吸收峰，而乙醇和環(huán)己烷在此波長(zhǎng)處無(wú)吸收，乙醇中含苯量低達(dá)苯量低達(dá)0.001%也能從光譜中檢查出來(lái)。也能從光譜中檢查出來(lái)。三、有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)分析三、有機(jī)化合物的結(jié)構(gòu)分析1.從吸收光譜中初步推斷基團(tuán)從吸收光譜中初步推斷基團(tuán)2.異構(gòu)體的推定異構(gòu)體的推定 許多結(jié)構(gòu)異構(gòu)體可利用其雙鍵的位置不同，應(yīng)用許多結(jié)構(gòu)異構(gòu)體可利用其雙