高效液相色譜儀的使用和不易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性分析

1、華南師范大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告學(xué)生姓名:黃敬霞學(xué)號(hào):20092401147專業(yè):化學(xué)師范年級(jí)、班級(jí):09級(jí)化四課程名稱:近代有機(jī)分析方法和實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)時(shí)間:2011年10月12日高效液相色譜儀的使用和不易揮發(fā)有機(jī)化合物的定性分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)使用高效液相色譜儀,掌握保留時(shí)間的概念和定性分析2、通過(guò)對(duì)樣品的定性測(cè)定,初步掌握獲得高效液相色譜圖和數(shù)據(jù)的一般操作程序與技術(shù)二、實(shí)驗(yàn)原理:高效液相色譜分是由儲(chǔ)液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測(cè)器、記錄儀等幾部份組成。由于樣品溶液中的各組分在色譜柱中兩相中的分配系數(shù)不同,當(dāng)試樣隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后,組分就在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配,由于固定相對(duì)各種組分的吸附能力不同

2、,各組分在色譜柱中的運(yùn)行速度就不同,經(jīng)過(guò)一定柱長(zhǎng)后彼此分離,依次從色譜柱流出,通過(guò)檢測(cè)器時(shí)樣品濃度被轉(zhuǎn)換成電信號(hào)傳送到記錄儀,數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來(lái)。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑:1、儀器:島津液相色譜儀,SPD-20A檢測(cè)器,LC-20AT泵,微量進(jìn)樣器,C18色譜柱2、試劑:煙酸乙酯,甲醇(AR,色譜純,超純水四、實(shí)驗(yàn)步驟:1、準(zhǔn)備1.1準(zhǔn)備所需的流動(dòng)相,用合適的0.45m濾膜過(guò)濾,超聲脫氣20min。(這里用的是流動(dòng)相是甲醇(B和超純水(A,分別用有機(jī)相系和水相系的0.45µm濾膜過(guò)濾,超聲脫氣20min。1.2根據(jù)待檢樣品的需要更換合適的洗脫柱(注意方向和定量環(huán)。1.3配制樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶

3、液(也可在平衡系統(tǒng)時(shí)配制,用合適的0.45m濾膜過(guò)濾。(即用移液管量取0.5 mL的煙酸乙酯用甲醇定容在5 mL的容量瓶中(105ppm,然后用移液管量取1 mL剛定容的溶液并用甲醇稀定容在10mL的容量瓶后(104 ppm并用移液管量取1 mL剛定容的溶液并用甲醇稀定容在10mL的容量瓶中,這樣就配制成濃度為1000ppm,用0.45µm有機(jī)濾膜過(guò)濾。1.4檢查儀器各部件的電源線、數(shù)據(jù)線和輸液管道是否連接正常。2、開機(jī)接通電源,依次開啟不間斷電源、B泵、A泵、檢測(cè)器,待泵和檢測(cè)器自檢結(jié)束后,打開打印機(jī)、電腦顯示器、主機(jī),最后打開色譜工作站(即電腦桌面上的CS-Light Real

4、Time Analysis。3、參數(shù)設(shè)定3.1波長(zhǎng)設(shè)定:在檢測(cè)器顯示初始屏幕時(shí),按func鍵接著按Enter鍵,用數(shù)字鍵輸入所需波長(zhǎng)值245nm,按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出到初始屏幕。3.2流速設(shè)定:在A泵顯示初始屏幕時(shí),按func鍵,用數(shù)字鍵輸入所需的流速(柱在線時(shí)流速一般不超過(guò)1ml/min,按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出。3.3流動(dòng)相比例設(shè)定:在A泵顯示初始屏幕時(shí),按conc鍵,用數(shù)字鍵輸入流動(dòng)相B的濃度百分?jǐn)?shù)(80%,按Enter鍵確認(rèn)。按CE鍵退出。4、更換流動(dòng)相并排氣泡4.1將A/B管路的吸濾器放入裝有準(zhǔn)備好的流動(dòng)相的儲(chǔ)液瓶中;4.2逆時(shí)針轉(zhuǎn)動(dòng)A/B泵的排液閥180

5、6;,打開排液閥;4.3按A/B泵的purge鍵,pump指示燈亮,泵大約以9.9ml/min的流速?zèng)_洗,3min(可設(shè)定后自動(dòng)停止;4.4將排液閥順時(shí)針旋轉(zhuǎn)到底,關(guān)閉排液閥。4.5如管路中仍有氣泡,則重復(fù)以上操作直至氣泡排盡。4.6如按以上方法不能排盡氣泡,從柱入口處拆下連接管,放入廢液瓶中,設(shè)流速為5ml/min,按pump鍵,沖洗3min后再按pump鍵停泵,重新接上柱并將流速重設(shè)為規(guī)定值。5、平衡系統(tǒng)5.1按N2000色譜數(shù)據(jù)工作站操作規(guī)程打開"在線色譜工作站"軟件,輸入實(shí)驗(yàn)信息并設(shè)定各項(xiàng)方法參數(shù)后,按下"數(shù)據(jù)收集"頁(yè)的 查看基線 按鈕。5.2等

6、度洗脫方式?jīng)_洗系統(tǒng),一般最少需6倍柱體積的流動(dòng)相。按A泵的pump鍵,A、B泵將同時(shí)啟動(dòng),pump 指示燈亮。用檢驗(yàn)方法規(guī)定的流動(dòng)相沖洗系統(tǒng),一般最少需6倍柱體積的流動(dòng)相。管路仍有氣泡,按4.6操作。統(tǒng)已達(dá)到平衡狀態(tài),可以進(jìn)樣。6、進(jìn)樣6.1進(jìn)樣前在CS-Light Real Time Analysis中:(1點(diǎn)擊“單次分析”,接著點(diǎn)擊“樣品記錄”,在樣品記錄名稱中輸入所要檢測(cè)得樣品名稱,然后點(diǎn)擊“數(shù)據(jù)文件”選擇該樣品儲(chǔ)存在哪里,最后在“數(shù)據(jù)儲(chǔ)存的文件夾”后面輸入該樣品名稱,點(diǎn)擊確定。(2在信號(hào)采集菜單中設(shè)定停止時(shí)間(6 min和延遲時(shí)間(3 min。6.2進(jìn)樣前按檢測(cè)器zero鍵調(diào)零,按軟件

7、中 零點(diǎn)校正 按鈕校正基線零點(diǎn),再按一下查看基線 按鈕使其彈起。6.3用試樣溶液清洗注射器,并排除氣泡后抽取20 L。6.4進(jìn)樣時(shí)先注入注射器后向逆時(shí)針扳動(dòng)進(jìn)樣閥的板扣后注入溶液再向順時(shí)針扳動(dòng)進(jìn)樣閥后取出注射器。7、數(shù)據(jù)處理7.1在桌面雙擊“CS-Light Postrum Analysis”,點(diǎn)擊確定按鈕后,在“文件夾目錄中”選中該樣品記錄雙擊鼠標(biāo),在譜圖上單擊鼠標(biāo)右鍵的“顯示設(shè)置”,在“顯示設(shè)置”中選擇“展開色譜”的“時(shí)間”填寫“0”到“20”后點(diǎn)擊確定7.2用鼠標(biāo)點(diǎn)擊“編輯”選擇“積分”中的“最小峰面積/高”輸入“最小峰面積值”,然后點(diǎn)擊“查看”。7.3復(fù)制譜圖到Word文檔,在譜圖中點(diǎn)

8、擊鼠標(biāo)右鍵選擇“復(fù)制”;復(fù)制數(shù)據(jù),單擊鼠標(biāo)左鍵全選,然后鼠標(biāo)右鍵“復(fù)制表格到剪貼板(b”。8、關(guān)閉儀器分析完畢后,關(guān)閉色譜工作站,再自上而下關(guān)閉儀器。五、數(shù)據(jù)記錄2.03.04.05.06.07.08.0V(x100,0000.03.04.05.06.07.0V(x100,0004.303 六、結(jié)果分析及討論定性分析:在液相色譜分析中,當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置在合適位置并保持不變的時(shí)候,在樣品能保證檢測(cè)的前提下,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的就是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)者的操作是否標(biāo)準(zhǔn)及規(guī)范。一般說(shuō)來(lái),整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)樣操作應(yīng)由同一人進(jìn)行,以防個(gè)體操作差異而引起實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)出現(xiàn)誤差。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用液相色譜法對(duì)煙酸乙酯進(jìn)行定性分析,

9、其中流動(dòng)相是選用甲醇與水的8:2混合液,在該液相色譜實(shí)驗(yàn)中,甲醇無(wú)(強(qiáng)吸收峰,利于樣品的檢測(cè)。在樣品進(jìn)樣后4.303min 處出現(xiàn)一強(qiáng)吸收峰,利用保留時(shí)間能方便快捷判斷出樣品,該峰屬于煙酸乙酯。七、思考題1、液相色譜法和氣相色譜法有何區(qū)別?答:高效液相色譜分析法(HPLC,它的基本概念及理論基礎(chǔ)(如保留值、塔板理論、速率理論、容量因子、分離度等,與氣相色譜是一致的,但又有不同之處:高效液相色譜與氣相色譜的主要區(qū)別可歸結(jié)于以下幾點(diǎn):(1進(jìn)樣方式的不同:高效液相色譜只要將樣品制成溶液,而氣相色譜需加熱氣化或裂解;(2流動(dòng)相的不同,在被測(cè)組分與流動(dòng)相之間、流動(dòng)相與固定相之間都存在著一定的相互作用力;

10、(3由于液體的粘度較氣體大兩個(gè)數(shù)量級(jí),使被測(cè)組分在液體流動(dòng)相中的擴(kuò)散系數(shù)比在氣體流動(dòng)相中約小45個(gè)數(shù)量級(jí);(4由于流動(dòng)相的化學(xué)成分可進(jìn)行廣泛選擇,并可配置成二元或多元體系,滿足梯度洗脫的需要,因而提高了高效液相色譜的分辨率(柱效能;(5高效液相色譜采用510Lm細(xì)顆粒固定相,使流體相在色譜柱上滲透性大大縮小,流動(dòng)阻力增大,必須借助高壓泵輸送流動(dòng)相;(6高效液相色譜是在液相中進(jìn)行,對(duì)被測(cè)組分的檢測(cè),通常采用靈敏的濕法光度檢測(cè)器,例如,紫外光度檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、熒光光度檢測(cè)器等;(7液相色譜與氣相色譜相比較,高效液相色譜同樣具有高靈敏度、高效能和高速度的特點(diǎn)。高效液相色譜的定性和定量分析,與

11、氣相色譜分析相似,在定性分析中,采用保留值定性,或與其他定性能力強(qiáng)的儀器分析法連用;在定量分析中,采用測(cè)量峰面積的歸一化法、內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法等,但高效液相色譜在分離復(fù)雜組分式樣時(shí),有些組分常不能出峰,因此歸一化法定量受到限制,而內(nèi)標(biāo)法定量則被廣泛使用。3、色譜分離方式應(yīng)如何選擇?答:(1根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量選擇低相對(duì)分子質(zhì)量(400的試樣因其揮發(fā)性強(qiáng),宜采用氣相色譜分離;相對(duì)分子質(zhì)量大于2000的化合物可采用液相色譜分離;相對(duì)分子質(zhì)量介于1002000范圍內(nèi)的分子,應(yīng)視試樣性質(zhì)選用液-固吸附色譜、液-液分配色譜或離子交換色譜分離。(2根據(jù)溶解性選擇水溶性離子化合物與共價(jià)化合物可分別采用離子交換色譜或液-液分配色譜分離。對(duì)于非水溶性化合物,若易溶于烴類溶劑,可采用液-固吸附色譜分離;若溶于二氯甲烷或氯仿,可采用液-固吸附色譜或正相液-