豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性檢測原理

1、豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性檢測原理試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。往預(yù)先包被卵清蛋白特異性IgE（OVA-sIgE）抗體的包被微孔中，依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的卵清蛋白特異性IgE（OVA-sIgE）呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD值），計算樣品濃度。樣品收集、處理及保存方法1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細胞

2、迅速小心地分離。2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。3. 細胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。自備物品1. 酶標儀（450nm）2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3. 37恒溫箱豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性操作注意事項1. 試劑盒保存在2-8，使用前室溫平衡20 分鐘。

3、從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶完全溶解后再使用。2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。3. 濃度為0 的S0 號標準品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時樣本已經(jīng)稀釋5 倍，最終結(jié)果乘以5 才是樣本實際濃度。4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。5. 所有液體組分使用前充分搖勻。試劑盒組成名稱 96孔配置 48孔配置 備注微孔酶標板12 孔8 條12 孔4 條無標準品0.3mL*6 管0.3mL*6 管無樣本稀釋液6mL 3mL 無檢測抗體-HRP 10mL 5mL 無20洗滌緩沖液25mL 15mL 按說明

4、書進行稀釋底物A 6mL 3mL 無底物B 6mL 3mL 無終止液6mL 3mL 無封板膜2 張2 張無說明書1 份1 份無自封袋1 個1 個無注：標準品（S0-S5）濃度依次為：0、1.5、3、6、12、24g/mL試劑的準備20洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20 稀釋，即1 份的20洗滌緩沖液加19 份的蒸餾水。洗板方法1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min 后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5 次。2. 自動洗板機：每孔注入洗液350L，浸泡1min，洗板5 次。豚鼠卵清蛋白特異性ELISA分析定性操作步驟1. 從室溫平衡20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，

5、剩余板條用自封袋密封放回4。2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50L；3. 樣本孔先加待測樣本10L，再加樣本稀釋液40L；空白孔不加。4. 除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100L，用封板膜封住反應(yīng)孔，37水浴鍋或恒溫箱溫育60min。5. 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5 次（也可用洗板機洗板）。6. 每孔加入底物A、B 各50L，37避光孵育15min。7. 每孔加入終止液50L，15min 內(nèi)，在450nm 波長處測定各孔的OD 值。結(jié)果判斷繪制標準曲線：在Excel 工作表中，以標準品濃度作橫坐標，對應(yīng)OD 值作縱坐標，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值。試劑盒性能1. 準確性：標準品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值，大于等于0.9900。2. 靈敏度：最低檢測濃度