基因工程知識(shí)點(diǎn) 超全

1、基因工程一、基因工程的概念基因工程是指依據(jù)人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賜予生物以新的遺傳特性，從而制造出更符合人們需要的新的生物類(lèi)型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的額，因此又叫做DNA重組技術(shù)?；蚬こ痰膭e名 基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)操作環(huán)境 生物體外操作對(duì)象 基因操作水平 DNA分子水平基本過(guò)程 剪切 拼接 導(dǎo)入 表達(dá)實(shí)質(zhì)（原理） 基因重組結(jié)果改造的方向 克服遠(yuǎn)緣雜交不親和的障礙，定向改造生物的遺傳特性二、基因工程的基本工具1、限制性核酸內(nèi)切酶-“分子手術(shù)

2、刀”2、DNA連接酶-“分子縫合針”3、基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體-“分子運(yùn)輸車(chē)”（5）識(shí)別序列的特點(diǎn)： 2“分子縫合針”DNA連接酶（1）作用：將限制酶切割下來(lái)的DNA片段拼接成DNA分子。（2）類(lèi)型相同點(diǎn)：都連接磷酸二酯鍵3“分子運(yùn)輸車(chē)”載體(1)載體具備的條件：能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。具有一個(gè)至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源DNA片段插入。具有標(biāo)記基因，供重組DNA的鑒定和選擇。(2)最常用的載體是質(zhì)粒，它是一種暴露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)潔的、獨(dú)立于細(xì)菌擬核之外，并具有自我復(fù)制力量的雙鏈環(huán)狀DNA分子。(3)其他載體：噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒。(4)載體的作用: 作為運(yùn)載工具，將目的基因送入受體細(xì)胞。在

3、受體細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制?！窘忸}技巧】(1)限制酶是一類(lèi)酶，而不是一種酶。(2)限制酶的成分為蛋白質(zhì)，其作用的發(fā)揮需要適宜的理化條件，高溫、強(qiáng)酸或強(qiáng)堿均易使之變性失活。(3)在切割目的基因和載體時(shí)要求用同一種限制酶，目的是產(chǎn)生相同的黏性末端。(4)獵取一個(gè)目的基因需限制酶剪切兩次，共產(chǎn)生4個(gè)黏性末端或平末端。(5)不同DNA分子用同一種限制酶切割產(chǎn)生的黏性末端都相同，同一個(gè)DNA分子用不同的限制酶切割，產(chǎn)生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位點(diǎn)應(yīng)位于標(biāo)記基因之外，不能破壞標(biāo)記基因，以便于進(jìn)行檢測(cè)。(7)基因工程中的載體與細(xì)胞膜上物質(zhì)運(yùn)輸?shù)妮d體不同?；蚬こ讨械妮d體是DNA分子，能將

4、目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。(8)基因工程中有3種工具，但工具酶只有2種。例1限制酶Mun和限制酶EcoR的識(shí)別序列及切割位點(diǎn)分別是CAATTG和GAATTC。如圖表示四種質(zhì)粒和目的基因，其中，箭頭所指部位為限制酶的識(shí)別位點(diǎn)，質(zhì)粒的陰影部分表示標(biāo)記基因。適于作為圖示目的基因載體的質(zhì)粒是（ ）A限制酶的應(yīng)用特點(diǎn)（1）在獵取目的基因和切割載體時(shí)通常用同種限制酶，以獲得相同的黏性末端。但是假如用兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端相同時(shí)，在DNA連接酶的作用下目的基因與載體也可以連接起來(lái)。（2）為了防止載體或目的基因的黏性末端自己連接，可用不同的限制酶分別處理目的基因

5、和載體，使目的基因兩側(cè)及載體上具有兩個(gè)不同的黏性末端五種酶的比較 作用底物作用部位形成產(chǎn)物限制性?xún)?nèi)切酶 DNA分子 磷酸二酯鍵 黏性末端或平末端DNA連接酶 DNA片段 磷酸二酯鍵 重組DNA分子DNA聚合酶 脫氧核苷酸 磷酸二酯鍵 子代DNADNA解旋酶DNA分子 堿基對(duì)間的氫鍵 脫氧核苷酸單鏈RNA聚合酶 核糖核苷酸 磷酸二酯鍵 核糖核苷酸單鏈三、基因工程的操作步驟1、目的基因的獵取2、基因表達(dá)載體的構(gòu)建3、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞4、目的基因

6、的檢測(cè)與鑒定1、目的基因的獵取獵取目的基因的方法：（1）直接分別法從基因文庫(kù)中獵取目的基因?qū)⒑心撤N生物不同基因的很多DNA短片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲(chǔ)存，各個(gè)受體菌分別含有這種生物的不同的基因，稱(chēng)為基因文庫(kù)。包括基因組文庫(kù)和cDNA文庫(kù)。直接從基因組中獵取目的基因最常用的方法是： “鳥(niǎo)槍法”。（2）人工合成法化學(xué)合成法：片段較小，核苷酸序列已知的目的基因，直接利用DNA合成儀用化學(xué)方法合成，不需要模板。反轉(zhuǎn)錄法：以RNA為模板，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成目的基因DNA（cDNA）。（4）利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因PCR技術(shù)：是一項(xiàng)在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。由于PCR過(guò)程在高溫下進(jìn)

7、行，因此需要使用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶。目的：通過(guò)指數(shù)式擴(kuò)增獵取大量的目的基因前提：要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。2基因表達(dá)載體的構(gòu)建基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。(3)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過(guò)程：3將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過(guò)程，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵是目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。金榜 P185轉(zhuǎn)化過(guò)程將目的基因插入到Ti質(zhì)粒 的TDNA上農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞整合到受體細(xì)胞的染色體DNA上表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵)顯

8、微注射受精卵發(fā)育獲得具有新性狀的動(dòng)物Ca2處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸取DNA分子4目的基因的檢測(cè)與鑒定誤區(qū)警示(1)標(biāo)記基因的作用篩選、檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞，常見(jiàn)的有抗生素抗性基因、發(fā)光基因(表達(dá)產(chǎn)物為帶顏色的物質(zhì))等。(2)受體細(xì)胞常用植物受精卵或體細(xì)胞(經(jīng)組織培育)、動(dòng)物受精卵(一般不用體細(xì)胞)、微生物(大腸桿菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰島素則必需用真核生物酵母菌(需內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體的加工、分泌)；一般不用支原體，緣由是它營(yíng)寄生生活；肯定不能用哺乳動(dòng)物成熟的紅細(xì)胞，緣由是它無(wú)細(xì)胞核，不能合成蛋白質(zhì)。(3)基因表達(dá)載體中，啟動(dòng)子(DNA

9、片段)起始密碼子(RNA)；終止子(DNA片段)終止密碼子(RNA)?；虮磉_(dá)載體的構(gòu)建是最核心、最關(guān)鍵的一步，在體外進(jìn)行。(4)目的基因與載體的連接方式有多種，如目的基因目的基因、目的基因載體、載體載體等。例3.下列有關(guān)基因工程操作的敘述中，正確的是 () AA用同種限制酶切割載體與目的基因可獲得相同的黏性末端B以蛋白質(zhì)的氨基酸序列為依據(jù)合成的目的基因與原基因的堿基序列相同C檢測(cè)到受體細(xì)胞含有目的基因就標(biāo)志著基因工程操作的成功D用含抗生素抗性基因的質(zhì)粒作為載體是由于其抗性基因便于與外源基因連接例4 金榜P187 T2四、基因工程的應(yīng)用與蛋白質(zhì)工程1乳腺生物反應(yīng)器與工程菌生產(chǎn)藥物的比較(1)含

10、義：乳腺生物反應(yīng)器是指將外源基因在哺乳動(dòng)物的乳腺中特異表達(dá)，利用動(dòng)物的乳腺組織生產(chǎn)藥物蛋白。工程菌是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表達(dá)的菌類(lèi)細(xì)胞株系。(2)兩者區(qū)分：比較項(xiàng)目乳腺生物反應(yīng)器工程菌基因結(jié)構(gòu)動(dòng)物基因的結(jié)構(gòu)與人類(lèi)基因的結(jié)構(gòu)基本相同細(xì)菌或酵母菌等生物基因的結(jié)構(gòu)與人類(lèi)基因的結(jié)構(gòu)有較大差異基因表達(dá)合成的藥物蛋白與自然蛋白質(zhì)相同細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器，產(chǎn)生的藥物蛋白可能沒(méi)有活性2蛋白質(zhì)工程與基因工程的比較 （金榜P189）蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其與生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過(guò)基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類(lèi)的生

11、產(chǎn)和生活的需求。3、基因工程的應(yīng)用： 金榜P1894、基因治療：（1）概念：指利用正常基因置換或彌補(bǔ)缺陷基因的治療方法。（2）方法：基因置換、基因修復(fù)、基因增補(bǔ)、基因失活等。如：腺苷酸脫氨酶（ADA）基因缺陷癥的基因治療。（3）基因治療的途徑體外基因治療：先從病人的體內(nèi)獲得某種細(xì)胞進(jìn)行培育，然后在體外完成基因轉(zhuǎn)移，再篩選成功轉(zhuǎn)移的細(xì)胞擴(kuò)增培育，最終重新輸入患者體內(nèi)。如腺苷酸脫氨酶基因的轉(zhuǎn)移。體內(nèi)基因治療：用基因工程的方法，直接向人體組織細(xì)胞中轉(zhuǎn)移基因的治病方法。5、基因診斷（1）概念：又稱(chēng)DNA診斷，是接受基因檢測(cè)的方法來(lái)推斷患者是否消滅了基因特別或攜帶病原體。（2）方法：DNA分子雜交技術(shù)。

12、它的基因原理是：互補(bǔ)的DNA單鏈能夠在肯定條件下結(jié)合成雙鏈，即能夠雜交，這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格依據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原則進(jìn)行。當(dāng)用一段已知基因的單鏈作探針（常用同位素、熒光分子等進(jìn)行標(biāo)記），與變性后的單鏈基因組DNA接觸時(shí)，假如兩者的堿基完成配對(duì)，互補(bǔ)地結(jié)合成雙鏈，表明被測(cè)基因組DNA中含有已知的基因序列。誤區(qū)警示(1)基因治療后，缺陷基因沒(méi)有轉(zhuǎn)變。基因治療是把正?；?qū)胧荏w細(xì)胞中，以表達(dá)正常產(chǎn)物從而治療疾病，對(duì)原來(lái)細(xì)胞中存在缺陷的基因沒(méi)有清除或轉(zhuǎn)變。(2)對(duì)蛋白質(zhì)分子進(jìn)行改造，其本質(zhì)是轉(zhuǎn)變其基因組成。假如對(duì)蛋白質(zhì)直接改造，即使改造成功，被改造的蛋白質(zhì)分子還是無(wú)法遺傳。(3)DNA分子作探針進(jìn)行檢測(cè)時(shí)應(yīng)檢測(cè)單鏈，即將待測(cè)雙鏈DNA分子打開(kāi)。(4)青霉素是青霉菌產(chǎn)生的，不是通過(guò)基因工程產(chǎn)生的。例5下列關(guān)于蛋白質(zhì)工程和基因工