細(xì)胞工程及其在食品工業(yè)中應(yīng)用

1、第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 細(xì)胞工程（cell engineering）：以生物細(xì)胞或組織為研究對象，利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，應(yīng)用工程學(xué)的步驟，按照預(yù)定目標(biāo)和設(shè)計有計劃地改變細(xì)胞的遺傳物質(zhì)并使之增殖，從而生產(chǎn)有用的細(xì)胞生物產(chǎn)品或獲得新型生物品種的一門綜合性技術(shù)。細(xì)胞工程細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程植物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程動物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程微生物細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞工程細(xì)胞培養(yǎng)及控制生長技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)及控制生長技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)組織培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞拆合技術(shù)細(xì)胞拆合技術(shù)染色體導(dǎo)入技術(shù)染色體導(dǎo)入技術(shù)胚胎和細(xì)胞核移植技術(shù)胚胎和細(xì)胞核移植技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)細(xì)胞工程的內(nèi)涵細(xì)胞工程

2、的內(nèi)涵第二節(jié)第二節(jié) 細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 細(xì)胞培養(yǎng)（cell culture）：從生物體獲得細(xì)胞,在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境,使之生存和生長,并維持其結(jié)構(gòu)和功能特性的培養(yǎng)技術(shù)。 一、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)一、植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) （一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史：（一）植物細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展簡史： 20世紀(jì)世紀(jì)40年代年代 J. Bonner報道了銀膠菊組織培養(yǎng)能報道了銀膠菊組織培養(yǎng)能產(chǎn)生橡膠；產(chǎn)生橡膠； 20世紀(jì)世紀(jì)70年代年代 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用有效成分在工植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)藥用有效成分在工業(yè)上獲得成功；業(yè)上獲得成功； 20世紀(jì)世紀(jì)80年代年代 全世界已經(jīng)建立了全世界已經(jīng)建立了400多種植物的組多種植物的組

3、織和細(xì)胞培養(yǎng)，可分離出超過織和細(xì)胞培養(yǎng)，可分離出超過600種代謝產(chǎn)物；種代謝產(chǎn)物； 20世紀(jì)世紀(jì)90年代年代 全世界有全世界有1000多種植物被進行過細(xì)多種植物被進行過細(xì)胞培養(yǎng)的研究。胞培養(yǎng)的研究。 植物細(xì)胞培養(yǎng)植物細(xì)胞培養(yǎng)： 指在離體條件下，將愈傷組織或其他易分散的的組織置于液體培養(yǎng)基中，進行振蕩培養(yǎng)，得到分散成游離的懸浮細(xì)胞，通過傳代培養(yǎng)使細(xì)胞增殖，從而獲得大量的細(xì)胞群體的一種技術(shù)。（二）植物細(xì)胞工程理論基礎(chǔ)1 細(xì)胞的全能性細(xì)胞的全能性指：即單一的離體細(xì)胞在一定的環(huán)境條件下能分化成不同細(xì)胞組織的乃至整個植株的能力。動物和植物細(xì)胞都可在一定的條件表現(xiàn)出全能性，其中最先發(fā)現(xiàn)的是植物細(xì)胞的全能性

4、，植物細(xì)胞表現(xiàn)全能性要求的條件更容易達(dá)到。但不是所有基因型的所有細(xì)胞在任何條件下都具有良好的培養(yǎng)反應(yīng)；即使對于植物細(xì)胞而言，細(xì)胞全能性也并不意味著任何細(xì)胞均可以直接產(chǎn)生植物個體。植物細(xì)胞全能性的差異植物細(xì)胞全能性的差異根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織根據(jù)細(xì)胞所處的組織不同從強到弱為：頂端分生組織 居間分生組織居間分生組織 側(cè)生分生側(cè)生分生 組織組織 薄壁組織薄壁組織(基本組織基本組織) 厚角組織厚角組織 輸導(dǎo)組織輸導(dǎo)組織 厚壁組織。厚壁組織。P702 細(xì)胞分化與脫分化2-1 細(xì)胞分化，是指導(dǎo)致細(xì)胞形成不同結(jié)構(gòu)，引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。 細(xì)胞分化也可以說是相同基因型的

5、細(xì)胞所具有的各個不同的表現(xiàn)型。 它包括：時間上的分化：一個細(xì)胞在不同的發(fā)育階段上可以有不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能；空間上的分化：對于多細(xì)胞生物來講，同一細(xì)胞后代，由于所處的環(huán)境不同而可以有相異的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能。細(xì)胞分化是一個復(fù)雜的生物化學(xué)過程，它是以內(nèi)部生理生化變化為基礎(chǔ)，同時又受到外界條件的調(diào)控。據(jù)知，營養(yǎng)物質(zhì)和激素的種類和配比能深刻影響分化過程，光照則是許多細(xì)胞分化的必需條件2-2 細(xì)胞脫分化與組織培養(yǎng) 組織培養(yǎng)(tissue culture) 指通過無菌操作分離出植物體的一部分接種到培養(yǎng)基上，在人工控制條件下(包括溫度、濕度、光照等)進行培養(yǎng)的過程。 外植體(explant)：通常指被培養(yǎng)的上

6、述植物離體部分。 離體器官、 組織或細(xì)胞 脫分化 愈傷組織 再分化 根、芽 植物體 p69脫分化：植株上已經(jīng)分化的細(xì)胞或組織離體后在培養(yǎng)條件下逐漸恢復(fù)到分生狀態(tài)的過程。愈傷組織：細(xì)胞脫分化的結(jié)果通常是形成愈傷組織（未分化的細(xì)胞團）。已經(jīng)脫分化的細(xì)胞或組織在一定條件下，它們又可以經(jīng)過胚狀體(由體細(xì)胞形成的類似合子胚的結(jié)構(gòu))或愈傷組織再分化出芽和根，從而發(fā)育成一個完整的植株，因為在細(xì)胞的基因中，除了全套的結(jié)構(gòu)基因外，還有操縱基因，使結(jié)構(gòu)基因不能啟動而無法工作。激素則是在一定條件下能打破操縱基因的控制，使結(jié)構(gòu)基因活化。因此，它直接影響和控制細(xì)胞的分化。（三）植物細(xì)胞培養(yǎng)基（四）愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)

7、技術(shù)（四）愈傷組織和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)基本概念： 細(xì)胞懸浮培養(yǎng) 愈傷組織 外植體3個步驟：1 步驟選擇細(xì)胞株，一般選擇次生代謝物含量高的植物種類、品種或某一高產(chǎn)植株，利用外植體誘導(dǎo)出愈傷組織。將愈傷組織轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)株， 并從中篩選出目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量高、性能優(yōu)良的無性繁殖系。擴大培養(yǎng)，即把選出的“種子”接種到通氣攪拌罐或進一步放大到幾百升至幾立方米的生物培養(yǎng)器中。注意： 由于植物細(xì)胞培養(yǎng)的目標(biāo)產(chǎn)物都屬于次級代謝產(chǎn)物，要在細(xì)胞生長的后期才開始合成。因此，為了讓產(chǎn)物產(chǎn)量高，一般采用二步培養(yǎng)法： 即使用生長培養(yǎng)基使細(xì)胞大量增殖，達(dá)到了一定的細(xì)胞密度，然后再改用適合細(xì)胞產(chǎn)物積累的培養(yǎng)基

8、，促進細(xì)胞啟動 次級代謝途徑并提高產(chǎn)物的產(chǎn)量2 培養(yǎng)條件（1）物理因素 光：根據(jù)植物細(xì)胞而定 溫度：25 左右 PH值：56（2）化學(xué)因素 溶氧：植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是好氧過程，但植物細(xì)胞的呼吸率低。選擇合適溶氧度 培養(yǎng)基：有機碳源、含氮鹽類（有時加入有機氮）、植物激素（IAA和2，4D等）3.植物細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞生理特性 在自然狀態(tài)下，植物之間通過“細(xì)胞間連絲”實現(xiàn)細(xì)胞間的聯(lián)系與接觸。這種接觸對于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)同樣重要，所以，植物細(xì)胞離體懸浮培養(yǎng)需要保持一定的聚集度，適當(dāng)保持細(xì)胞的尺寸。與微生物發(fā)酵相比，植物細(xì)胞培養(yǎng)需要注意的方面為：細(xì)胞尺寸、對剪氣力的敏感性，沉降性、生長速率、次級代謝物的合成特點

9、和細(xì)菌污染等 解決對策剪氣力敏感在減少流體剪切力和滿足植物細(xì)胞良好混合之間的尋求平衡易染菌反應(yīng)器要加強密封性，防止污染細(xì)胞生長與次級代謝產(chǎn)物積累無關(guān)聯(lián)在培養(yǎng)基中分別進行細(xì)胞增殖和代謝物積累，或采用固定化物來控制細(xì)胞處于只積累目的代謝物的理想狀態(tài)4. 植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化存在的問題 生長緩慢 次級代謝物含量低 培養(yǎng)細(xì)胞不穩(wěn)定等 多數(shù)產(chǎn)物積累于胞內(nèi) 不耐受剪切力 一般的說，只有當(dāng)次級代謝產(chǎn)物的價格高于1000美元/kg時，才考慮采用植物細(xì)胞培養(yǎng)方法。（五）單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)1.單細(xì)胞分離方法 機械法 酶法 化學(xué)法 2. 單細(xì)胞培養(yǎng)方法 看護培養(yǎng) 平板培養(yǎng) 微室培養(yǎng) 單細(xì)胞培養(yǎng)的程序：建立細(xì)胞株高產(chǎn)細(xì)胞株

10、的選擇分化培養(yǎng)或擴大培養(yǎng)鑒定和提?。┨岣咧参锛?xì)胞次級代謝產(chǎn)物含量的方法 1.加入前體物或誘導(dǎo)物 2.毛狀根和冠癭瘤培養(yǎng)技術(shù)紅豆杉毛狀根紅豆杉毛狀根紅莧菜毛狀根紅莧菜毛狀根西洋參毛西洋參毛狀根狀根煙草毛狀根煙草毛狀根二、動物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 1885 Roux最早將雞胚神經(jīng)培養(yǎng)在保溫的生理鹽水中，并存活了一段時間； 1907 Ross Harrison采用懸滴培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織，保持存活幾周，并觀察到細(xì)胞突起生長過程； 1923 Carrel將設(shè)計的卡氏瓶成功用于雞胚的心肌組織培養(yǎng)； 1951 Earle等人開發(fā)了動物細(xì)胞體外培養(yǎng)基； 1975 Kohler和Milstein創(chuàng)立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技

11、術(shù)，獲得了單克隆抗體； 1997 英國Wilmut小組用體細(xì)胞克隆技術(shù)克隆出多利綿羊； 2001 英國宣布成功培育出世界首批轉(zhuǎn)基因克隆豬。動物細(xì)胞培養(yǎng)一般程序 胚胎成幼齡動物的組織器官（細(xì)胞來源）胚胎成幼齡動物的組織器官（細(xì)胞來源）單個細(xì)胞單個細(xì)胞原代細(xì)胞原代細(xì)胞細(xì)胞株細(xì)胞株細(xì)胞系細(xì)胞系剪碎胰蛋白酶剪碎胰蛋白酶分離細(xì)胞分離細(xì)胞洗滌、稀釋、分離洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變遺傳物質(zhì)沒有發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變遺傳物質(zhì)發(fā)生改變1、動物細(xì)胞培養(yǎng)過程、動物細(xì)胞培養(yǎng)過程2、應(yīng)用：、應(yīng)用：細(xì)胞系細(xì)胞系動物胚胎動物胚胎幼齡動物器官幼齡動物器官細(xì)胞懸細(xì)胞懸浮液浮液1010

12、代代細(xì)胞細(xì)胞5050代代細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞株細(xì)胞株原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)傳代培養(yǎng)病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體的生產(chǎn)，制皮膚病毒疫苗、干擾素、單克隆抗體的生產(chǎn)，制皮膚細(xì)胞，檢測有毒物質(zhì)的毒性細(xì)胞，檢測有毒物質(zhì)的毒性 原代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)： 傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)： 細(xì)胞株：細(xì)胞株： 細(xì)胞系：細(xì)胞系：單個細(xì)胞單個細(xì)胞十代左右十代左右原代培養(yǎng)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞4050代左右代左右10到到40、50代的細(xì)胞，代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)沒發(fā)生改變遺傳物質(zhì)沒發(fā)生改變超過超過50代的細(xì)胞，代的細(xì)胞，遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，可無限增殖遺傳物質(zhì)發(fā)生改變，可無限增殖3、植物組織培養(yǎng)和動物組織培養(yǎng)的比較、植物組織培養(yǎng)和動物組織培養(yǎng)的比較比較

13、項目原理培養(yǎng)基結(jié)果培養(yǎng)目的植植物物動動物物細(xì)細(xì)胞胞全全能能性性細(xì)細(xì)胞胞增增殖殖固體固體營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)植物激素植物激素液體液體營養(yǎng)物質(zhì)營養(yǎng)物質(zhì)動物血清動物血清培養(yǎng)成培養(yǎng)成植株植株培養(yǎng)成培養(yǎng)成細(xì)胞株細(xì)胞株細(xì)胞系細(xì)胞系快速繁殖快速繁殖培養(yǎng)無病毒培養(yǎng)無病毒植株植株獲得細(xì)胞獲得細(xì)胞產(chǎn)品、細(xì)產(chǎn)品、細(xì)胞胞培養(yǎng)液培養(yǎng)液 種類種類: :液體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基 成分：成分：葡萄糖、氨基酸、無機鹽、葡萄糖、氨基酸、無機鹽、 維生素和動物血清等維生素和動物血清等一、細(xì)胞融合的定義一、細(xì)胞融合的定義細(xì)胞融合（細(xì)胞融合（cell fusion)，又稱體細(xì)胞雜交（somatic hybridiazation），是指兩個或更

14、多個相同或不同細(xì)胞通過膜 融合形成單個細(xì)胞的過程。第三節(jié)第三節(jié) 細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)及其應(yīng)用uMuller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細(xì)胞能在體內(nèi)自發(fā)地融合產(chǎn)生多核的腫瘤細(xì)胞。uVirchow于1858年描述了正常組織、發(fā)炎組織以及腫瘤組織中的多核細(xì)胞現(xiàn)象。uLuginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細(xì)胞存在。uLange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細(xì)胞發(fā)生融合的過程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞合并現(xiàn)象。u1958年日本學(xué)者岡田（Okada）發(fā)現(xiàn)仙臺病毒具有觸發(fā)動

15、物細(xì)胞融合的效應(yīng)。u1974年華裔加拿大學(xué)者高國楠創(chuàng)立了聚乙二醇（PEG）化學(xué)融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞而產(chǎn)生能分泌預(yù)定單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。u20世紀(jì)80年代出現(xiàn)了電融合技術(shù)。二、細(xì)胞融合研究進展二、細(xì)胞融合研究進展生物種類生物種類細(xì)胞來源細(xì)胞來源成功年代成功年代煙草兩個種間苷藍(lán)青菜大豆馬唐草矮牽牛龍面花大麥花生大麥大豆小麥矮牽牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麥蠶豆大豆草香木犀酵母菌雞大豆煙草大豆秋水仙人胡蘿卜番茄馬鈴薯人小鼠葉葉葉根愈傷組織葉葉花瓣種子種子葉懸浮細(xì)胞葉花瓣葉懸浮細(xì)胞葉懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞懸浮細(xì)胞葉根懸浮細(xì)胞葉原生質(zhì)

16、體血紅細(xì)胞懸浮細(xì)胞葉懸浮細(xì)胞葉腹水癌細(xì)胞原生質(zhì)體葉根尖纖維肉瘤細(xì)胞畸胎瘤細(xì)胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細(xì)胞融合成功的例子幾種細(xì)胞融合成功的例子植物融合細(xì)胞成長狀態(tài)對比植物融合細(xì)胞成長狀態(tài)對比,右瓶為地面融合的右瓶為地面融合的細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞細(xì)胞，左瓶中為太空微重力環(huán)境下融合的細(xì)胞 動物細(xì)胞融合實驗使用的小白鼠 三、動植物細(xì)胞的融合過程三、動植物細(xì)胞的融合過程植物細(xì)胞融合過程植物細(xì)胞融合過程人造小鼠培育過程示意圖人造小鼠培育過程示意圖四、細(xì)胞融合的意義

17、四、細(xì)胞融合的意義u理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這理論上說任何細(xì)胞，都有可能通過體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這 對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。對于種質(zhì)資源的開發(fā)和利用具有深遠(yuǎn)的意義。u融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間融合過程不存在有性雜交過程中的種性隔離機制的限制，為遠(yuǎn)緣物種間 的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。u體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分 裂和增殖過程中雙親的葉綠體、線粒體裂和增殖過程中雙親的葉綠

18、體、線粒體DNA亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新亦可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新 的核外遺傳系統(tǒng)。的核外遺傳系統(tǒng)。u淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。淋巴細(xì)胞雜交瘤和單克隆抗體的制備。五、細(xì)胞融合的基本原理 細(xì)胞融合是指兩種不同親株經(jīng)酶法除去細(xì)胞融合是指兩種不同親株經(jīng)酶法除去細(xì)胞壁得到兩個原生質(zhì)體球，然后置于細(xì)胞壁得到兩個原生質(zhì)體球，然后置于高滲溶液中，在促融因子（生物的、物高滲溶液中，在促融因子（生物的、物理的，化學(xué)的）作用下，使兩者互相凝理的，化學(xué)的）作用下，使兩者互相凝聚并發(fā)生細(xì)胞之間的融合，進而導(dǎo)致基聚并發(fā)生細(xì)胞之間的融合，進而導(dǎo)致基因重組，獲得新的菌株。因重組，獲得新的菌株。顯微鏡下細(xì)胞融合過程顯微

19、鏡下細(xì)胞融合過程融合過程中兩個細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解融合過程中兩個細(xì)胞膜從彼此接觸到破裂形成細(xì)胞橋的變化過程圖解用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖 六、六、 細(xì)胞融合的常用方法細(xì)胞融合的常用方法(一一) 生物學(xué)法：仙臺病毒（生物學(xué)法：仙臺病毒（HVJ）法）法仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個階段：仙臺病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合經(jīng)四個階段：兩種細(xì)胞在一起培養(yǎng)，加入病毒，在4條件下病毒附著在細(xì)胞 膜上。并使兩細(xì)胞相互凝聚；在37中，病毒與細(xì)胞膜發(fā)生反應(yīng)，細(xì)胞膜受到破環(huán)，此時需 要Ca2+和Mg2+，最適PH為8.0一8.2；細(xì)胞膜連接部穿通，周邊

20、連接部修復(fù)，此時需Ca2+和ATP；融合成巨大細(xì)胞，仍需ATP 。病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：病毒促使細(xì)胞融合的主要步驟如下：1. 兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；兩個原生質(zhì)體或細(xì)胞在病毒黏結(jié)作用下彼此靠近；2. 通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個細(xì)胞膜間互相滲透，通過病毒與原生質(zhì)體或細(xì)胞膜的作用使兩個細(xì)胞膜間互相滲透，胞質(zhì)互相滲透；胞質(zhì)互相滲透；3. 兩個原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個細(xì)胞融為一體；兩個原生質(zhì)體的細(xì)胞核互相融合，兩個細(xì)胞融為一體；4. 進入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。進入正常的細(xì)胞分裂途徑，分裂成含有兩種染色體的雜種細(xì)胞。用滅活的病

21、毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖用滅活的病毒誘導(dǎo)的動物細(xì)胞融合過程示意圖 u 優(yōu)點是易得，用法簡單，融合效果穩(wěn)定。u聚乙二醇(PEG)結(jié)構(gòu)為：HOH2C（CH20CH2）nCH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細(xì)胞融合劑。uPEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養(yǎng)液為1g重)，即成50PEG溶液。uPEG經(jīng)高壓滅菌后，與溫?zé)岬腅ngle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產(chǎn)生 最多雜交細(xì)胞。uPEG溶液在pH6.0時細(xì)胞融合率最高。(二二) 化學(xué)法：聚乙二醇（化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）法）法聚乙二醇（聚

22、乙二醇（PEG）法細(xì)胞融合過程）法細(xì)胞融合過程PEG的作用機理的作用機理： Kao等認(rèn)為，由于等認(rèn)為，由于PEG分子具有分子具有輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)輕微的負(fù)極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質(zhì)和碳水化合物等形成和碳水化合物等形成H鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子鍵，從而在在質(zhì)膜之間形成分子橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；橋，其結(jié)果是使細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生粘連進而促使質(zhì)膜的融合；另外，另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)能增加類脂膜的流動性，也使細(xì)胞的核、細(xì)胞器發(fā)生融合成為可能。胞器發(fā)生融合成為可能。 PEG誘導(dǎo)融合的特點誘導(dǎo)融合的特點：其優(yōu)點

23、是融合成本低，勿需特殊其優(yōu)點是融合成本低，勿需特殊設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。設(shè)備；融合子產(chǎn)生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細(xì)胞有毒害?？赡軐?xì)胞有毒害。聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法細(xì)胞融合步驟細(xì)胞融合步驟（1）將兩種不同親本細(xì)胞各）將兩種不同親本細(xì)胞各5l06混勻；混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；）離心沉淀，吸去上清液；（3）加）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸溶液，用吸管吹打，使之與細(xì)胞接觸1分鐘；分鐘；（4）加）加9ml 培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上清液；培養(yǎng)液，離心沉淀，吸去上

24、清液；（5）加）加5ml 培養(yǎng)液，分別接種培養(yǎng)液，分別接種5個直徑個直徑60mm平皿，每個平皿加培平皿，每個平皿加培養(yǎng)液至養(yǎng)液至 5ml，37的的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（6）624小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。小時后，換成選擇培養(yǎng)液篩選雜交細(xì)胞。（三）電融合法（三）電融合法 電融合法是80年代出現(xiàn)的細(xì)胞融合技術(shù)，在直流電脈沖的誘導(dǎo)下，細(xì)胞膜表面的氧化還原電位發(fā)生改變，使異種細(xì)胞粘合并發(fā)生質(zhì)膜瞬間破裂，進而質(zhì)膜開始連接，直到閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優(yōu)點：電融合法的優(yōu)點：u融合率高、重復(fù)性強、對細(xì)胞傷害??；u裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；u

25、免去PEG誘導(dǎo)后的洗滌過程、誘導(dǎo)過程可控性強。電融合的基本過程：電融合的基本過程：細(xì)胞膜的接觸：細(xì)胞膜的接觸：當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通當(dāng)原生質(zhì)體置于電導(dǎo)率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電后，電流即通過原生質(zhì)體而不是通過溶液，其結(jié)果是原生質(zhì)體在電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；電場作用下極化而產(chǎn)生偶極子，從而使原生質(zhì)體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：膜的擊穿：原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以原生質(zhì)體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。使原

26、生質(zhì)膜擊穿，從而導(dǎo)致兩個緊密接觸的細(xì)胞融合在一起。 電融合誘導(dǎo)法原理示意圖電融合誘導(dǎo)法原理示意圖七、七、 雜種細(xì)胞的篩選雜種細(xì)胞的篩選根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其根據(jù)已經(jīng)發(fā)生融合的細(xì)胞中所含有核的類型，可將其分為以下幾種類型：分為以下幾種類型：u異核細(xì)胞：非同源細(xì)胞的融合體。u同核細(xì)胞：兩個相同細(xì)胞的融合體。u多核細(xì)胞：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。u基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選基于酶缺陷型細(xì)胞和藥物抗性所建立的雜種篩選u基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選基于營養(yǎng)缺陷型細(xì)胞所建立的雜種篩選u由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩選由溫度敏感型細(xì)胞組成的雜種細(xì)胞的篩

27、選u具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選具有所需性狀雜種細(xì)胞的篩選常用的雜種細(xì)胞篩選方法常用的雜種細(xì)胞篩選方法八、細(xì)胞融合技術(shù)在食品工業(yè)的應(yīng)用八、細(xì)胞融合技術(shù)在食品工業(yè)的應(yīng)用 （一）氨基酸生產(chǎn)菌的育種 （二）酶制劑生產(chǎn)菌的育種 （三）酵母菌的育種 （四）醬油曲霉菌的育種氨基酸生產(chǎn)菌的育種 谷氨酸生產(chǎn)菌FM84-415是我國推廣應(yīng)用于味精廠的高產(chǎn)優(yōu)良菌株，但該菌不太穩(wěn)定，易被噬菌體感染。 趙廣鈴等人選用FM84-415和FM242-4作為出發(fā)菌株進行原生質(zhì)體融合，F(xiàn)M242-4帶有噬菌體敏感的phages遺傳標(biāo)記。 目的是篩選出性能穩(wěn)定、能抗噬菌體感染的谷氨酸高產(chǎn)菌株。 操作流程： FM84-415和FM

28、242-4的原生質(zhì)體懸浮液各3mL混勻2500r/min離心8min 沉淀置于高滲溶液中，加入適量PEG和CaCl2溶液 2500r/min離心8min 用高滲緩沖溶液洗洗滌沉淀后，懸浮于3mL高滲緩沖液中 挑取HMM平板上菌落5000個，點種于CM平板和含噬菌體的雙層平板上培養(yǎng)得菌63株復(fù)篩出高產(chǎn)且抗噬菌體的菌株。35保溫20min酵母菌的育種 釀酒酵母生長快，耐酒精，但是不能分解淀粉或糊精，也不發(fā)酵乳糖。 糖化酵母和乳酸克魯維酵母具備分解乳糖及糊精和淀粉的能力。 釀酒酵母與糖化酵母的融合子可以直接發(fā)酵乳糖或淀粉。酵母菌的育種酵母菌的育種（五）、植物細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用1 利用植物細(xì)胞培養(yǎng)進行藥物生產(chǎn) 太平洋紫杉細(xì)胞生產(chǎn)抗癌藥物紫杉醇、人參細(xì)胞培養(yǎng)人參皂苷和人參多糖、毛地黃細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)化毛地黃毒苷典型案例：紫杉醇生產(chǎn)案例 紫杉醇(Paclitaxel)是繼阿霉素和鉑類抗癌藥之后本世紀(jì)后期最受人們重視的一種抗癌新藥，是一新發(fā)現(xiàn)的有絲分裂抑制劑，其作用機理在于阻止微管正常生理聚集，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂和紡錘體的形成，從而使癌細(xì)胞的