分子標記技術在西瓜遺傳育種上的應用研究進展VIP

1、分子標記技術在西瓜遺傳育種上的應用研究進展摘 要 西瓜是世界上重要的水果之一。分子標記技術在西瓜研究中的應用，給西瓜的遺傳育種工作帶來了極大的便利。目前，分子標記已成功應用于西瓜親緣關系和遺傳多樣性分析、圖譜構建、重要性狀基因的連鎖標記和雜種純度鑒定等諸多領域。本文從種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性與親緣關系、遺傳圖譜的構建、目標性狀的連鎖分子標記與分子標記輔助育種、品種及雜交種純度鑒定等方面展開綜述，探討近年來分子標記技術在西瓜遺傳育種上的應用研究進展。關鍵詞 分子標記，西瓜，遺傳多樣性，遺傳圖譜Applications of MolecularMarker on Watermelon Genetics

2、and Breeding ProgramsAbstract Watermelon is one of the important fruits in the world. It would be becoming great conveniences for watermelon breeding program in virtue of molecular approaches. So far, DNA Marker techniques would be widely used in the area of species relationships, genetic diversitie

3、s, linkage map construction, important trait genotyping and linked gene mapping, molecular marker assisted breeding, and cultivar purity indentification and so on. In this paper, we reviewed the research progresses of watermelon in the gentics and breeding program, in particular mentioned above.Key

4、words molecular markers, watermelon, genetic diversities, genetic linkage maps引言分子標記是以生物大分子的多態(tài)性為基礎的遺傳標記，分子標記技術的出現(xiàn)使作物育種的間接選擇成為可能，提高了遺傳分析的準確性和選育的有效性，對科學、快速地鑒定種質(zhì)、檢測種子的純度和真實性、保護新品種的知識產(chǎn)權等具有重要意義。廣義的分子標記指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)標記包括種子貯藏蛋白和同工酶及等位酶；狹義的分子標記概念只是指DNA標記，這個界定現(xiàn)在被廣泛采納(周延慶，2005)。分子標記技術根據(jù)其核心技術可將其分為三大類：

5、第一類是以分子雜交(Southern雜交)為核心的標記技術，包括RFLP標記、DNA指紋技術、染色體原位雜交等；第二類是以聚合酶鏈式反應PCR技術為核心的標記技術，包括RAPD標記、SSR、ISSR、AFLP、STS、SCARs、AP-PCR、SRAP標記等；第三類是一些新型的分子標記，如SNP標記、EST等。分子標記是繼形態(tài)標記、細胞學標記、生化標記之后發(fā)展起來的新的一種遺傳標記，反映生物個體或種群間基因組中某種差異特征的DNA片段，直接反映了基因組DNA間的差異，有許多明顯的優(yōu)越性(周延慶，2005)，表現(xiàn)為：(1)直接以DNA的形式表現(xiàn)，在生物體的各個組織、各個發(fā)育階段均可檢測到，不受季

6、節(jié)、環(huán)境限制，不存在表達與否等問題；(2)數(shù)量極多，遍布整個基因組；(3)多態(tài)性高，自然界存在許多等位變異，無須人為創(chuàng)造；(4)表現(xiàn)中性，不影響目標性狀的表達；(5)許多標記表現(xiàn)為共顯性的特點，能區(qū)別純合體和雜合體。西瓜是世界上重要的水果之一。長期的育種實踐表明，西瓜種質(zhì)資源間的遺傳多態(tài)性很低。分子標記技術在西瓜研究中的應用，無疑給西瓜的遺傳育種工作帶來了極大的便利。目前，已成功應用于西瓜親緣關系和遺傳多樣性分析、圖譜構建、重要性狀基因的連鎖標記和雜種純度鑒定等諸多領域：(1)國內(nèi)外許多學者進行了西瓜遺傳多樣性的分析研究，結果發(fā)現(xiàn)西瓜具有較低的遺傳多樣性；(2)構建了數(shù)張西瓜的遺傳連鎖圖譜，并

7、將重要性狀連鎖基因進行了定位；(3)對我國部分西瓜栽培品種進行了品種鑒定與純度檢測的研究。1 種質(zhì)資源遺傳多態(tài)性與親緣關系分子標記所檢測的是植物基因組DNA水平的差異，因而非常穩(wěn)定，在分子圖譜幫助下對品種之間的比較，大大提高了結果的可靠性。分子標記一方面可用于品種資源的鑒定與保存，研究作物的起源與發(fā)展進化，確定親本之間的遺傳差異和親緣關系，從而確定親本間遺傳距離，指導雜交育種親本選配，減少雜交組合數(shù)，有效劃分雜種優(yōu)勢群，為提高育種效率提供依據(jù)；另外，通過親緣關系分析，可以糾正形態(tài)分類中一些不恰當?shù)慕Y論以及目前育種工作中存在的一些問題。西瓜栽培品種與其近緣野生種遺傳資源比較豐富，種植資源遺傳多態(tài)

8、性的研究以及物種親緣關系的鑒定、評價是對其進行有效利用的關鍵。迄今，國內(nèi)外許多學者進行了西瓜遺傳多樣性的分析研究。早期學者進行西瓜遺傳多樣性的同工酶與貯藏蛋白分析，但檢測到的多態(tài)性極低。Navot等(1996)曾用同工酶與蛋白質(zhì)來研究西瓜的遺傳多樣性與遺傳關系方面發(fā)現(xiàn)在384份西瓜材料中，其中26個酶位點中只有4個具有多態(tài)性；在西瓜栽培種(Citrullus lanatus)與西瓜野生種(Citrullus colocynthis)之間存在著豐富的同工酶與種子蛋白的多態(tài)性，首次確定西瓜中19種蛋白編碼基因之間的連鎖關系。Biles等(1989)分析了8個商業(yè)品種的11個蛋白

9、位點，在子葉、莖與葉組織上無差異，只在傷流液中發(fā)現(xiàn)蛋白譜帶上有差異，并可能與抗枯萎病有關，這也是僅有的一篇在栽培品種間確有蛋白譜帶差異的報道。Zhang X.P.等(1993)選用53個引物對西瓜的3個栽培品種與1份栽培種(Citrullus lanatus)的野生類型材料以及1份栽培種與野生種的雜交后代進行的RAPD檢測結果表明在全部5份材料中，多態(tài)性為62.3 %，而在3個栽培品種內(nèi)，多態(tài)性僅為10.1 %，其平均遺傳距離為0.2400.263。李嚴等(2005)用SRAP標記進行西瓜雜交種遺傳多態(tài)性的研究, 利用25個引物組合對生產(chǎn)上推廣的20個西瓜雜交種進行擴增，從中篩選得到

10、20個多態(tài)性引物組合，共產(chǎn)生135個多態(tài)性條帶，平均每個引物組合產(chǎn)生7.11個多態(tài)性條帶，顯示了較高的多態(tài)性比率。趙虎基等(1999)用RAM標記對籽用西瓜的12個品種(系)和西瓜種內(nèi)其他變種的4個品種(系)進行了遺傳多樣性的檢側(cè)，結果表明始選出的14個隨機引物均能擴增出多態(tài)性片段，反應了不同品種(系)的遺傳差異，并計算了這12個西瓜品種(系)的Nei'相似系數(shù)，建立了UPGMA系統(tǒng)樹，得出它們之間的親緣關系。Lee SL等(1996)對39份西瓜材料進行RAPD檢測與聚類分析，其平均遺傳距離的變動范圍為00.366。Jarret等(1997)用SSR標記對西瓜種質(zhì)的親緣關系進行了研究

11、，證明栽培品種間也有較多的差異。Hashizume等(1993)通過RAPD分析發(fā)現(xiàn)，在西瓜(Citrullus lanatus)的雜交種Fijihikari的雙親間能產(chǎn)生多態(tài)性的引物僅為3 %。郭軍等(2002)用RAPD標記對國內(nèi)外32份西瓜主栽品種與其骨干親本及野生類型的遺傳親緣關系進行研究，從720個隨機引物中篩選出15個能產(chǎn)生穩(wěn)定多態(tài)性的引物用于RAPD反應，實驗結果不僅從分子水平驗證了西瓜是遺傳基礎狹窄的作用，而且在分子水平對西瓜傳統(tǒng)分類與地理生態(tài)型分類進行了分析。劉文革等(2004)對西瓜二倍體及同源多倍體的遺傳差異進行AFLP分析，結果表明大部分引物組合擴增出的不同倍性西瓜之間

12、的AFLP譜帶無明顯差異，表明不同倍性西瓜間的多態(tài)性很低。李曉慧等(2007)用SRAP標記對不同倍性西瓜的多態(tài)性進行分析，結果表明不同倍性西瓜之間SRAP多態(tài)性較低。段會軍等(2007)用AFLP標記對48個西瓜品種進行多態(tài)性分析，結果表明西瓜品種間同源性較高、遺傳基礎狹窄，多數(shù)品種親緣關系較近。段會軍等(2006)用RAMS標記對河北省不同地區(qū)的3個西瓜枯萎病病株分離物Fon1、Fon2、Fon3各10個單孢菌株進行了基因組多態(tài)性分析，結果表明同一病株分離物的不同單孢菌株之間在分子水平上存在遺傳差異性。劉立功等(2004)用RAPD標記對國內(nèi)外26份西瓜材料進行遺傳親緣關系研究，結果將供試

13、26份材料分為6個類群：1個美國生態(tài)型類群、2個中間生態(tài)型類群、1個東亞生態(tài)型類群、2個野生類群，并將京欣一號雜種純度鑒定的RAPD特異標記K14-1500與N04-600成功轉(zhuǎn)化為SCAR標記，同時應用于京欣一號純度鑒定實踐。趙虎基等(2000)對西瓜種內(nèi)12個品種(系)進行了核型分析，據(jù)其染色體的對稱性、著絲點位置等核型參數(shù)推斷出了它們之間的相對進化程度，揭示了其親緣關系的遠近，從而對西瓜親本的選擇選配和遺傳育種研究提供了一定的理論依據(jù)。李艷梅等(2007)用AFLP標記對57份西瓜材料進行了多態(tài)性分析，根據(jù)DNA譜帶計算品種間遺傳相似系數(shù)，其范圍在0.240.99之間，平均相似系數(shù)為0.

14、70，表明西瓜品種間遺傳基礎狹窄。2 遺傳圖譜的構建利用分子標記構建遺傳連鎖圖譜，將對西瓜遺傳育種及其重要性狀基因的定位、克隆具有重要意義。目前，已發(fā)表的西瓜分子圖譜有10余張。Hashizume(1995)用一個近交系(H-7；Citrullus lanatus)和一個野生類型(SA-1；Citrullus lanatus)雜交獲得的BC1群體(H-7×SA-1)×SA-1構建了一個最初的西瓜分子遺傳連鎖圖譜，該圖譜包括58個RAPD標記，1個同工酶標記，1個RFLP標記和2個形態(tài)標記，分為11個連鎖群，全長524 cM，Hashizume等(2003)又用以上兩個親本雜

15、交的F2群體為材料進行了圖譜構建，該圖譜包括477個RAPD位點、53個RFLP位點、1個同工酶位點及23個ISSR位點，分為11個連鎖群，覆蓋了2 384 cM的分子圖譜，同時對果皮硬度、果肉顏色等進行了QTL定位。Hawkins等(2001)用枯萎病抗感不同品種NHM×PI296341獲得的雜交F2、F3群體，分別構建出兩張涵蓋112.9和139.0 cM的RAPD連鎖圖，許多RAPD標記和枯萎病生理小種1(Fom-1)和2(Fom-2)的抗性基因有不同程度的連鎖。Levi等(2001，2002)用(PI296341-FR×NHM)×NHM的BC1群體，構建出

16、總長1 295 cM、含有17個連鎖群、155個RAPD標記和1個SCAR標記的分子遺傳連鎖圖譜，之后利用測交群體(Griffin 14113×NHM)×PI386015構建了總長1 166.2 cM的遺傳連鎖圖譜。范敏等(2000)用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系(Citrullus lanatus var.1anatus)97103與可溶性固形物含量低、皮厚、抗枯萎病的野生西瓜種質(zhì)(C.lanatus var.citroides) PI296341含有96個標記的連鎖遺傳圖譜，該圖譜由11個連鎖群構成，覆蓋基因組長度為1 203.2 cM，位點間平均

17、間距為12.53 cM，總的位點數(shù)為96個，包括85個RAPD標記、3個SSR標記、3個同工酶標記、4個形態(tài)標記及1個抗枯萎病生理小種1的基因標記。張仁兵等(2003)用同樣的親本雜交所得的重組自交系F8的群117個單株作圖群體，構建了包含87個RAPD標記、13個ISSR標記，分為15個連鎖群，覆蓋基因組1 027.5 cM。易克等(2003)用可溶性固形物含量高、皮薄、感枯萎病的栽培西瓜自交系97103和可溶性固形物含量低、皮厚、抗病的野生西瓜種質(zhì)PI296341作為親本，獲得F8的重組自交系群體，用SSR和ISSR標記技術構建了包括38個SSR標記和10個ISSR標記組成的分子圖譜，該圖

18、譜總長558.1 cM，平均圖距為11.9 cM，之后易克等(2004)用同樣親本獲得F2S7重組自交系群體，通過AFLP技術對群體擴增，建立了有150個標記組成的圖譜，包括17個連鎖群，覆蓋基因組1 240.2 cM，兩個標記間的平均圖距為8.3 cM。郭紹貴等(2006)用西瓜栽培品種97103和野生品種PI296341-FR為親本構建了由117個穩(wěn)定株系組成的F2S8代重組自交系群體，利用RAPD、SSR、AFLP和SCAR標記構建了該RIL群體的高密度遺傳圖譜，覆蓋基因組總長度1 383.8 cM，平均圖距6.8 cM。車克鵬等(2003)用AFLP標記對30個西瓜核心種質(zhì)材料進行了遺

19、傳分析，建立了這30個材料的DNA指紋圖譜，在該圖譜中每個材料均有其獨特的指紋，材料之間可相互區(qū)分開來，然后將重要抗病種質(zhì)材料“PI296341”的AFLP特異帶轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)上可直接利用的SCAR標記。3 目標性狀的連鎖分子標記與分子標記輔助育種獲得緊密連鎖的標記是成功開展重要性狀標記輔助選擇的關鍵。許勇等(1998)用RAPD技術采用BSA法進行西瓜野生種質(zhì)(PI296341)抗枯萎病基因連鎖的研究，結果表明西瓜野生種質(zhì)PI296341抗枯萎病生理小種1的抗性由單顯性基因控制，RAPD標記OPPOL/700與其抗病基因連鎖，其遺傳距離為30 cM。另一方面，許勇等(1999，2000)將西瓜野

20、生種質(zhì)PI296341抗枯萎病生理小種l的抗性基因連鎖的RAPD標記OPPO1/700進行克隆、測序，Southern雜交證明此標記為1個單拷貝，并轉(zhuǎn)化為SCAR標記，簡化了SCAR擴增產(chǎn)物的檢測技術。張顯等(2005)用RAPD標記以BSA法對西瓜隱性核不育材料Sel8的不育基因進行了研究，結果220個引物中僅有引物S1167、S357在不育株DNA中擴增出了多態(tài)性特異片段，在可育株DNA中未擴增出多態(tài)性片段，驗證結果表明引物S1167在12個不育材料中的138個不育株全部擴增出特異性片段，可以區(qū)分不育株與可育株，對特異性片段進行回收、克隆和測序，顯示S1167擴增特異片段有2 391個堿基

21、對。劉海河等(2004)用RAPD標記對西瓜G17AB隱性核雄性不育系的不育株和可育株gDNA進行比較分析，篩選到可育株與不育株的特異擴增譜帶A123K片段，并用該引物對單個不育株后代育性分離群體進行了RAPD分析，從而確定A123K與育性基因的遺傳距離為8.1 cM。馬少芹等(2006)以抗病毒西瓜野生種質(zhì)P.I.595203與感病普通西瓜自交系98R為親本采用單粒方式得到109個F3代株系，分別對親本、F1及109個F3代株系進行苗期ZYMV-CH接種鑒定，通過F3帶群體的分離情況推測得到F2代各株基因型，采用BSA在F2代建立抗基因池對640條RAPD引物篩選得到一條與ZYMV-CH抗性

22、基因連鎖的譜帶AK13-644，且該標記得到驗證，最后將其轉(zhuǎn)化為SCAR標記SCAK13-644作為西瓜抗病毒輔助選擇的標記。4 品種及雜交種純度鑒定對作物品種鑒定與純度檢測是作物種子品質(zhì)檢驗極為重要的部分，一般可采用表型差異、染色體的多態(tài)性與DNA多態(tài)性等多種方法。其中，表型差異主要采用生長測驗，需要一些可辨認的特殊形態(tài)標記。但由于西瓜的標記性狀數(shù)量很少，因此主要依靠果實外型與顏色來進行品種鑒定，因而要進行早期鑒定是十分困難的。由于西瓜本身遺傳基礎狹窄, 造成品種間多態(tài)性較低，國內(nèi)外曾利用各種技術進行西瓜多態(tài)性分析，有些研究表明利用蛋白質(zhì)或同工酶譜帶的差異可以區(qū)分部分西瓜品種(王璽等，199

23、6；李麗，2000)，有的卻認為同工酶和蛋白質(zhì)很難或者無法在栽培品種之間產(chǎn)生多態(tài)性(張仁兵等，2003；易克，2003)。王鳴剛等(2003)以不同西瓜雜交種及親本自交系為材料，研究利用RAPD技術鑒定西瓜雜種的純度及種質(zhì)的方法，認為在反應條件適合、引物選擇正確的情況下，RAPD技術完全適合于西瓜雜交種純度的鑒定；歐陽新星等(1999)曾針對“京欣1號”及其父母本篩選了320個RAPD引物，僅得到1個引物可以區(qū)分母本和雜交種，不能區(qū)分父本和雜交種，對42份國內(nèi)外西瓜種質(zhì)材料進行了RAPD分析，從600個隨機引物中篩選10多個重復性好、能產(chǎn)生多態(tài)性的引物，找到了某些特殊的RAPD譜帶，但效果不太

24、明顯。閆鵬等(2007)選用100條隨機引物(S71-S190)對西瓜、甜瓜雜種一代和其父、母本的種子進行RAPD分析，結果表明在100條引物中篩選出4條有特征條帶的引物，其中S92號引物能使甜籽一號、白蘭蜜和黃河蜜6號與其母本有效區(qū)分開來；S162號、S181號引物能使甜籽一號與其母本區(qū)分開來；S175號引物能使白蘭蜜與其母本區(qū)分開來；但未發(fā)現(xiàn)使T×14E與其母本區(qū)分開來的引物。艾呈祥等(2006)以2個西瓜雜交品種(系)的種子“黑公子”和“04217”及其親本為材料用SSR標記甄別真假雜種，結果發(fā)現(xiàn)多數(shù)SSR引物對自交系的擴增只出現(xiàn)1條帶，但部分引物在某些自交系中擴增出2條帶，用

25、引物CMCT134b對“黑公子”和引物CMGA165對“04217”進行了各100粒單種子SSR鑒定，所測純度分別為96 %和100 % ，與田間純度95.6 %和99.7 %非常接近，表明SSR標記可應用于西瓜雜交種子純度鑒定。5 研究展望近年來國內(nèi)外學者在分子標記在西瓜上的應用上做了大量研究，促進了西瓜的遺傳育種工作。目前，主要以RAPD、AFLP、SSR等分子標記為主，在種質(zhì)資源利用方面應加強不同類型種質(zhì)資源多態(tài)性的研究與利用，進行西瓜種質(zhì)資源的創(chuàng)新；遺傳圖譜對于基因定位至關重要，圖譜上包括的標記數(shù)越多，分布越均勻，基因定位就越精細，高密度分子遺傳圖譜的繪制不僅使遺傳學研究取得重大進展，

26、對分子標記輔助育種選擇技術和基因圖位克隆技術的發(fā)展也將產(chǎn)生巨大的推動作用，因此今后應加強以下幾個方面的研究：在遺傳圖譜構建方面，開展新型分子標記的應用，如SNP標記、EST標記在西瓜上的應用；開發(fā)SSR、SRAP等分子標記引物，充分利用不同分子標記技術以加快遺傳圖譜的整合工作，完善高密度遺傳標記連鎖圖譜；開展西瓜數(shù)量性狀位點定位以及西瓜抗逆性、抗病性等性狀基因的研究，建立轉(zhuǎn)育特異性狀的分子標記輔助選擇系統(tǒng)，為分子設計育種奠定基礎，以加快西瓜品種改良進程；加強分子標記在鑒定西瓜種子純度上的應用研究，為西瓜種子質(zhì)量的檢測提供快速、簡便、科學實用的檢測鑒定技術。參考文獻Zhou Y.X. ed.,2

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40、rai M.,2003,Construction of a linkage map and QTL analysis of horticultural traits for watermelon Citrullus lanatus (Thunb.) MatsumNakai using RAPD, RFLP and ISSR markers,Theor Appl Genet,106:779-785Hawkins L.K.,DaneF and Kubisiak T.L.,2001,Linkage mappingin a watermelon population segregating for F

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42、erived from a test cross population: (Citrullus lanatusvar.itroides×C.lanatusvar.lanutus)×Citrullus colocynthis ,Theor Appl Genet,105(4):555-563Fan M.,Xu Y.,Zhang H.Y.,Ren.H.Z.,Kang G.B.,Wang Y.J. and Chen K.,2000,Identification of Quantitative Trait Loci Associated with Fruit Traits in Wa

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45、ye Daxue Xuebao(Journal of Agricultural University of Hunan),29(4):333-337(易克,徐向利,盧向陽,許勇,肖浪濤,王永健,康國斌,2003,利用SSR和ISSR標記技術構建西瓜分子遺傳圖譜,湖南農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版),29(4):333-337)Yi K.,Xu Y., Lu X.Y.,Xiao L.T.,Xu X.L.,Gong G.Y. and Zhang H.Y.,2004, Construction of AFLP Molecular Genetic Map for RIL Population of Wate

46、rmelon,Yuanyi Xuebao(Acta Horticulturae Sinica),31(1):53-58(易克,許勇,盧向陽,肖浪濤,徐向利,宮國義,張海英,2004,西瓜重組自交系群體的AFLP分子圖譜構建,園藝學報,31(1):53-58)Guo S.G.,Xu Y.,Zhang H.Y. and Gong G.Y.,2006,QTL Analysis of Soluble Solids Content in Watermelon under Different Environments,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding

47、),4(3):393-398(郭紹貴,許勇,張海英,宮國義,2006,不同環(huán)境條件下西瓜果實可溶性固形物含量的QTL分析,分子植物育種,4(3):393-398)Che K.P., Xu Y.,Liang C.Y.,2003,Gong G.Y.,Weng M.L.,Zhang H.Y.,Jin D.M. and Wang B.,2003,AFLP Fingerprint and SCAR Marker of Watermelon Core Collection,Zhiwu Xuebao(Acta Botanica Sinica),6:731-735(車克鵬,許勇,梁春陽,宮國義,翁曼麗,張海英

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49、質(zhì)耐冷性基因連鎖的RAPD標記,園藝學報,25(4):397-398)Xu Y.,Ouyang X.X. and Zhang H.Y.,1999,Identification of a RAPD Marker Linked to Fusarium Wilt Resistant Gene in Wild Watermelon Germplasm (Citrullus lanatus var.citroides),Zhiwu Xuebao(Acta Botanica Sinica),41(9):952-955(許勇,歐陽新星,張海英,1999,與西瓜野生種質(zhì)抗枯萎病基因連鎖的RAPD標記,植物學報

50、,41(9):952-955)Xu Y., Zhang H.Y.,Kang G.B.,Wang Y.J. and Chen K.,2000,Studies of Molecular Marker-assisted-selection for Resistance to Fusarium Wilt in Watermelon (Citrullus lanatus) Breeding,Yichuan Xuebao(Acta genetica Sinica),27(2):151-157(許勇,張海英,康國斌,王永健,陳杭,2000,西瓜抗枯萎病育種分子標記輔助選擇的研究,遺傳學報,27(2):151

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