二苯乙烯苷對D-半乳糖致擬癡呆小鼠學習記憶和海馬APP、Aβ表達的影響

1、    二苯乙烯苷對D-半乳糖致擬癡呆小鼠學習記憶和海馬APP、A表達的影響作者：黃忠仕，謝海源，農(nóng)嵩，李韜，張樹球    作者單位：右江民族醫(yī)學院生化教研室，廣西,百色,533000【摘要】  目的 觀察二苯乙烯苷（TSG）對D-半乳糖致擬癡呆小鼠學習記憶能力及海馬淀粉樣蛋白前體(APP)、淀粉樣蛋白(A)表達的影響。方法 連續(xù)給昆明種小鼠灌胃TSG 50天，同時每天頸部皮下注射D-半乳糖建立癡呆小鼠模型，以Morris水迷宮為學習記憶評價指標，并采用免疫組化及圖像分析測定各組小鼠海馬組織APP、A平均光密度和陽

2、性細胞數(shù)。結(jié)果 在隱蔽平臺試驗中擬癡呆小鼠表現(xiàn)出明顯的學習記憶障礙，逃避潛伏期顯著延長（P<0.05），TSG各劑量組逃避潛伏期較模型組顯著縮短（P<0.05）；探索試驗中TSG各劑量組原平臺象限的停留時間和穿越原平臺次數(shù)明顯多于模型組。與模型組比較，TSG各劑量組能降低擬癡呆小鼠腦內(nèi)APP、A平均光密度值和陽性細胞數(shù)(P<0.05)。以上效應均呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。結(jié)論 TSG各劑量能明顯地改善擬癡呆小鼠的學習記憶能力，能減少或抑制APP、A的過度產(chǎn)生，保護神經(jīng)元免受A的神經(jīng)毒性?！娟P(guān)鍵詞】  二苯乙烯苷 癡呆 學習記憶能力 淀粉樣蛋白前體 淀粉樣蛋白 小鼠 動物

3、實驗Effects of TSG on learning and memory abilities and expressions of APP and A in hippocampus of mice with dementia induced by D-galactoseHUANG Zhong-shi, XIE Hai-yuan, NONG Song, LI Tao, ZHANG Shu-qiu(Department of Biochemistry, Youjiang Medical College for Nationalities, Baise, Guangxi 533000, Chi

4、na)Abstract:  Objective  To study the effects of 2, 3, 5, 4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glylcoside (TSG) on learning and memory abilities and expressions of -amyloid precursor protein (APP) and -amyloid (A) in hippocampus of mice with dementia induced by D-galactose.  Methods

5、0; After the mice were treated with intragastric  administration with TSG for 50 days continually, the mice were treated subcutaneous injection with D-galactose at the same time to establish the dementia model, then the Morris water maze test was performed to survey the learning and memory abil

6、ities, and the immunohistochemical analysis and computerized image presentation analysis system were used to determine the APP and A average optical density and their immunoreactive neurons in hippocampus.  Results  The mice with dementia had learning and memory disorders during hidden pla

7、tform test, and the escape latency were significantly longer than that of TSG-treated groups (P<0.05).  TSG-treated groups could significantly prolong the staying time and the frequency of crossing original platform quadrant in spatial probe test (P<0.05). Compared with model group, TSG-t

8、reated groups could decrease significantly the APP and A average optical density and their immunoreactive neurons in hippocampus of mice with dementia via immunohistochemical analysis (P<0.05). All the data showed a dose-response relationship to some degree.  Conclusion  TSG can improve

9、 the learning and memory abilities in mice with dementia and reduce or inhibit the over-expression of APP and A in hippocampus of mice with dementia, so as to protect the neurons from the neurotoxicity of  A.     Key words:  2,3,5,4'- tetrahydroxy-stilbene-2-O-D-glylcosi

10、de; dementia; learning and memory abilities; -amyloid precursor protein; -amyloid; mice; animals, experiments阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease, AD）是一多發(fā)在老年，以近期記憶障礙為主要臨床癥狀，老年斑（SP）、神經(jīng)元纖維纏結(jié)（NFT）和神經(jīng)元丟失為主要病理改變的進行性神經(jīng)變性疾病。目前AD的發(fā)病機制尚未完全清楚，亦無良好的防治措施，因此研究AD的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療藥物成為當前研究熱點之一。二苯乙烯苷（2,3,5,4'-四羥基-二苯乙烯-D-葡萄

11、糖苷，TSG）是何首烏中的主要水溶性成分，近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗衰老作用、神經(jīng)保護作用、降血脂及抗動脈粥樣硬化作用等1,2。其作用機制是多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑的，因此對老年性癡呆等神經(jīng)退行性病變的防治具有很好的應用價值，可開發(fā)研制為治療老年性癡呆的新藥物。本實驗以D-半乳糖建立擬癡呆小鼠模型，觀察TSG對擬癡呆小鼠學習記憶及海馬組織淀粉樣前體蛋白（-amyloid precursor protein, APP）、淀粉樣蛋白（-amyloid, A）表達的影響，現(xiàn)報道如下：1  材料與方法1.1  材料昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重20±2g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中

12、心提供（許可證號：SCXKG桂2003-0003，實驗動物使用許可證：SYKG桂2003-0005）。D-半乳糖（Sigma公司提供）；石杉堿甲（豫中制藥廠生產(chǎn)，批號：H10940156）；一抗：-Amyloid precursor protein，-Amyloid兔抗大鼠多克隆抗體（武漢博士德公司生產(chǎn)，批號：BA0580）；二抗：即用型快捷MaxvisionTM檢測試劑盒；DAB顯色試劑盒（福建邁新公司生產(chǎn)）。Morris水迷宮（中國科學院藥研所制）；湖北孝感亞鵬TS-12U生物組織自動脫水機；武漢俊杰JB-L5生物組織石蠟包埋機；Shandon切片機；奧林巴斯光學顯微鏡；重慶天海彩色病理圖

13、像分析系統(tǒng)；恒溫培養(yǎng)箱。1.2  方法將昆明種小鼠60只隨機分為6組（每組10只）：正常對照組；模型組；石杉堿甲組；TSG低劑量組；TSG中劑量組；TSG高劑量組。各組均按0.2ml/10g體重給藥，組每天灌0.9%生理鹽水；組灌石杉堿甲0.02mg/kg體重；組灌TSG 0.033g/kg體重；組灌TSG 0.1g/kg體重；組灌TSG 0.3g/kg體重。組同時頸部皮下按120mg/kg體重注射D-半乳糖（配成0.6%濃度），每天一次，連續(xù)50天。從第46天起，進行Morris水迷宮試驗，連續(xù)5天。Morris水迷宮為一不銹鋼的圓形水池，內(nèi)壁黑色，直徑100cm，高50cm，水溫

14、控制在（22±1）。水池等分為4個象限，任選其中1個象限，正中放置1個安全平臺。平臺為圓形，直徑10cm，沒于水下1cm。水池放在一間小屋的中央，室內(nèi)的門、窗、攝像頭等構(gòu)成視覺暗示。迷宮上方安有攝像機，并和計算機連接，自動錄入小鼠游泳軌跡并進行分析。歷時5天，每天上下午各1次，入池位置為平臺所鄰2個象限的池壁中點。將小鼠面向池壁分別從入水點放入水中，記錄其在100s內(nèi)尋找到平臺的時間（逃避潛伏期，escape latency）。如果小鼠在100s未找到平臺，則由實驗者用手牽引其至平臺上，停留10s，逃避潛伏期記成100s。每天以兩次潛伏期算術(shù)均值作為這一天的成績進行統(tǒng)計分析。撤除平臺

15、，任選1個入水點將小鼠放入水中，使小鼠在無平臺情況下尋找記憶中的平臺，記錄其100s的游泳軌跡、原平臺象限游泳的時間和穿越原平臺的次數(shù)。所有檢測結(jié)果以±s表示。用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗。2  結(jié)果2.1  隱蔽平臺試驗結(jié)果見表1。由表1可以看出，隱蔽平臺試驗從第1天起，模型組的逃避潛伏期即明顯短于正常對照組（P<0.05或P<0.01），說明長期注射D-半乳糖后，小鼠的學習記憶明顯下降。石杉堿甲組和TSG組從第3天起，逃避潛伏期明顯短于模型組（P<0.05或P<0.01），說明用藥后能改善擬癡呆小鼠的學習記憶

16、能力。TSG組與陽性藥石杉堿甲組比較差異無顯著性(P>0.05)。表1  TSG對D-半乳糖致擬癡呆小鼠隱蔽平臺試驗逃避潛伏期的影響（略）2.2  探索試驗結(jié)果見表2。正常對照組、石杉堿甲組和TSG各組軌跡大部分位于原平臺象限，其次較多地在原平臺象限相鄰的左右兩側(cè)象限尋找，但模型組基本圍繞池壁游泳，其運動軌跡呈隨機分布于各象限之中。由表2可以看出，正常對照組、石杉堿甲組和TSG各組的停留原平臺象限時間和穿越原平臺次數(shù)均明顯多于模型組，差異具有顯著性（P<0.05或P<0.01），說明用藥后各組擬癡呆老鼠的記憶能力比模型組老鼠強，提示TSG能增強癡呆模型鼠的

17、記憶能力。表2  TSG對D-半乳糖致擬癡呆小鼠探索試驗的影響(略)2.3  APP和A免疫陽性細胞的形態(tài)學觀察見圖1圖2。APP和A免疫陽性神經(jīng)元呈錐形、不規(guī)則形等。陽性反應物呈棕黃色，定位于細胞膜及胞漿，細胞核呈陰性。另外在腦血管壁上也可見APP和A的沉積。正常對照組小鼠海馬區(qū)有少量APP和A神經(jīng)元表達，陽性反應物染色較淺；擬癡呆小鼠海馬APP和A免疫陽性神經(jīng)元廣泛表達于神經(jīng)細胞胞漿，染色較深；石杉堿甲組和TSG各劑量組海馬區(qū)APP和A免疫陽性神經(jīng)元細胞數(shù)較模型組明顯降低。2.4  免疫組織化學染色結(jié)果見表3。與正常對照組相比，模型組小鼠海馬區(qū)APP和A平均光

18、密度值和陽性神經(jīng)元細胞數(shù)顯著升高，差異具有顯著性（P<0.05或P<0.01）；與模型組相比，石杉堿甲組和TSG各劑量組平均光密度和陽性細胞數(shù)明顯降低，其差異具有顯著性（P<0.05或P<0.01）。提示TSG能減少A和APP平均光密度值和免疫陽性神經(jīng)元細胞數(shù)。表3  TSG對各組小鼠海馬A和APP表達的平均光密度和陽性細胞數(shù)的影響  (略)3  討論D-半乳糖所致亞急性衰老模型是較好的老化伴記憶衰退模型，該模型表現(xiàn)出與人類自然衰老相似的生化改變，免疫功能低下，基因表達與調(diào)控異常，細胞生長繁殖能力下降及細胞退行性變，它可誘導腦老化，出現(xiàn)與A

19、D的外在表現(xiàn)和腦內(nèi)海馬結(jié)構(gòu)相一致的變化，因此可作為部分模擬AD的動物模型35。本實驗結(jié)果顯示，長期注射D-半乳糖可致小鼠學習記憶能力降低，海馬組織APP和A表達增高，與上述文獻報道一致。    小鼠水迷宮實驗是一種主要依賴海馬的空間性作業(yè)，檢測的是小鼠空間學習記憶能力，通常被認為是一種工作記憶，相當于人類的近期記憶。本實驗采用Morris水迷宮對癡呆動物行為學進行測定。隱蔽平臺試驗中的逃避潛伏期反映了動物空間記憶的獲得情況，即學習能力；探索試驗是Morris水迷宮中較為敏感而精確的測試方法，測量動物的記憶保持能力68；本實驗結(jié)果顯示D-半乳糖致擬癡呆小鼠的學習記憶

20、能力明顯低于正常對照組的小鼠，具體表現(xiàn)為：逃避潛伏期明顯延長，原平臺象限的停留時間縮短，再學習能力下降，分析判斷能力低下。隱蔽平臺試驗中，TSG組小鼠的逃避潛伏期明顯縮短，提示經(jīng)TSG治療后擬癡呆小鼠的學習記憶能力得以明顯改善。探索試驗結(jié)果顯示，正常對照組、陽性藥對照組和TSG各組的停留原平臺象限時間和穿越原平臺次數(shù)均明顯多于模型組，差異具有顯著性（P<0.05或P<0.01），說明經(jīng)TSG干預后各組小鼠的記憶保持能力得到增強。TSG各組和陽性藥石彬堿甲組之間差異無顯著性，說明TSG改善癡呆小鼠學習記憶能力與目前老年性癡呆治療常用藥物膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲相當。A是AD主要病理改變

21、老年斑的核心成分，現(xiàn)代研究證明A的沉積是AD病理的始發(fā)因素和中心環(huán)節(jié)9,10。A來源于APP11。主要是APP經(jīng)過分泌酶酶和分泌酶切發(fā)生裂解產(chǎn)生A12。A具有神經(jīng)元毒性作用，可以引起神經(jīng)元的退變、凋亡13。一般認為，A神經(jīng)毒性作用是聚集依賴的方式或聚集相關(guān)毒性，即可溶性A聚集成不溶性A纖絲才具有更強毒性。A肽鏈越長，越容易聚集沉積。通過在細胞外的積聚，促進神經(jīng)細胞骨架的改變，從而導致神經(jīng)損傷。A除對細胞具有直接毒性作用外，還可增強或放大各種傷害性刺激如低糖、興奮性毒性、自由基等細胞損傷效應14。本實驗對TSG干預擬癡呆小鼠海馬組織APP、A的表達進行了研究，結(jié)果顯示：與模型組比較，TSG組AP

22、P、A表達水平明顯降低，差異具有顯著性，并且差異有顯著性的蛋白表達呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。而與陽性藥石杉堿甲組的APP、A比較，差異均無顯著性，說明其療效與膽堿酯酶抑制劑石杉堿甲相當。   以上結(jié)果顯示，TSG能明顯地改善擬癡呆小鼠的學習記憶能力，能減少或抑制APP、A的過度產(chǎn)生，保護神經(jīng)元免受A的神經(jīng)毒性，具有較好的抗癡呆作用。【參考文獻】  1王春英.何首烏中有效成分二苯乙烯苷的研究進展J.河北醫(yī)科大學學報，2008，29（1）：157-160.2賈新,陳建宗.二苯乙烯苷神經(jīng)保護作用及其機制的研究進展J.國際中醫(yī)中藥雜志，2007，29（6）：347-348.3

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