抗腫瘤藥物阿霉素對細胞增殖及凋亡的影響

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上抗腫瘤藥物阿霉素對細胞增殖及凋亡的影響 馮景（8） 張書（6）指導(dǎo)老師：張偉摘要：為了探究抗腫瘤藥物阿霉素對細胞增殖及凋亡的影響，使用了MTT比色法測定了細胞給不同濃度后的相對數(shù)量，研究其對細胞增殖的影響；使用熒光染色法研究其對細胞形態(tài)的影響，并觀察細胞凋亡形態(tài)。關(guān)鍵字：阿霉素 細胞凋亡 MTTAbstract：To explore the anticancer drug doxorubicin effect on cell proliferation and apoptosis, studying its effects on cell proliferation

2、by the MTT that analyzes the relative number of cells after different concentrations; learning its affect on cells morphology using fluorescence staining and apoptotic morphology was observed.Keywords: Apoptosis doxorubicin MTT近50年的抗腫瘤藥物研究開發(fā)工作使腫瘤化療取得相當(dāng)?shù)倪M步，特別是使血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者生存時間明顯延長，但嚴(yán)重威脅人類生命健康的占惡性腫瘤90%以

3、上的實體瘤的治療尚未達到滿意的療效?？鼓[瘤藥物正從傳統(tǒng)的非選擇性單一的細胞毒性藥物向針對機制的多環(huán)節(jié)作用的新型抗腫瘤藥物發(fā)展。目前發(fā)現(xiàn)許多天然藥物具有抗腫瘤作用，部分常用的抗腫瘤藥物及其作用機制如表1所示，其中很多抗腫瘤藥物可以明顯抑制腫瘤細胞的增殖，而對正常細胞的毒副作用較小。表1.部分常用的抗腫瘤藥物及其作用機制藥物名稱作用機制藥物名稱作用機制Actinomycin D（ 更生霉素）抑制RNA的合成Glucocorticoids（糖皮質(zhì)激素）激素Adriamycin （Doxorubicin，阿霉素）DNA嵌入劑5-Fluorouracil（ 5-氟尿嘧啶）抗代謝藥物Bleomycin (

4、博來霉素)引起DNA片斷化Hydroxyurea（羥基脲）抗代謝藥物Camptothecin（ 喜樹堿）拓?fù)洚悩?gòu)酶I型藥物Mitoxantrone（米托蒽醌）DNA嵌入劑Chlorambucil（苯丁酸氮芥）DNA交聯(lián)劑Paclitaxel(TAXOL) (紫杉醇)靶向微管藥物Cisplatin （順鉑）DNA交聯(lián)劑Staurosporine （ 星形孢菌素）激酶抑制劑Cytarabine（阿糖胞苷）抗代謝藥物Tamoxifen（它莫西芬）激素拮抗劑Cycloheximide (放線菌酮)蛋白質(zhì)合成抑制劑Topotecan（拓?fù)涮婵担┩負(fù)洚悩?gòu)酶I型藥物Cyclophosphamide（環(huán)磷酰胺

5、）DNA交聯(lián)劑Vinblastine （長春堿）靶向微管藥物材料和方法1 實驗材料1.1 生物材料 人胃癌細胞BGC-8231.2 試劑 MTT母液(5mg/mL)、裂解液（10%SDS0.01N HCl）、胰酶、PBS溶液、PI 、Ho.33342、阿霉素。阿霉素：是一種抗腫瘤抗生素，可抑制RNA 和DNA的合成，對RNA的抑制作用最強，抗瘤譜較廣，對多種腫瘤均有作用，屬周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。主要適用于急性白血病，對急性淋巴細胞白血病及粒細胞白血病均有效，一般作為第二線藥物，即在首選藥物耐藥時可考慮應(yīng)用此藥。PI（碘化丙啶）：是一種可對DNA染色的細胞核染色

6、試劑，常用于細胞凋亡檢測，它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。盡管PI不能通過活細胞膜，但卻能穿過破損的細胞膜而對核染色。Ho.33342 ：結(jié)合于DNA的AT堿基對，釋放藍色熒光,可進入活細胞,用于細胞周期的研究,染色體和細胞核的觀察2 實驗方法步驟2.1 取對數(shù)生長期的細胞,用胰酶消化計數(shù),配制細胞懸液濃度為: 3-4104/mL，取細胞接種到96孔板，每孔200L，即8000細胞/孔。2.2 加藥處理:待細胞貼壁后于第二天中午換液加藥(可在24小時進行), 換200L新鮮培養(yǎng)基，用無菌水配制相應(yīng)濃度的藥液（詳細配置藥液方法見表2），每個孔加入4L配制后藥液，作用72

7、小時。表2.阿霉素濃度配制表1246810阿霉素 ul0.40.81.62.43.24無菌水 ul39.639.238.437.636.836總體積 ul404040404040圖1.96孔板加樣示意圖2.3 測定: 取測定孔, 棄去培養(yǎng)基,加100L 新鮮的培養(yǎng)基, 加12 L MTT，8小時后加100L裂解液。過夜后，用酶標(biāo)儀測定OD值。 2.4 將酶標(biāo)儀測出的數(shù)據(jù)用SPSS軟件進行分析，找出半數(shù)抑制濃度( IC50 )，IC50是指在用藥后存活的細胞數(shù)量減少一半時所需的藥物濃度。在MTT法中, 就是以對照組吸光度OD 值減少一半所需的藥物濃度為IC50。2.5 取生長到80-90%融匯度

8、，對數(shù)生長期的細胞，按1：4比例傳代。取1瓶細胞傳到4瓶 。2.6 第二天加入藥物或水。本組實驗加入4g/ml的藥物培養(yǎng)基。2.7 48小時后，收集培養(yǎng)液，用胰酶適度消化細胞，用收集的培養(yǎng)液吹打細胞，將分散成單個的細胞懸液收集至10mL離心管中，1000rpm, 離心 15 min去上清，用0.2毫升PBS重懸細胞。2.8 取178 l PBS細胞懸液，加入PI 20 L（終濃度100 g/ml），Ho.33342 2 L（終濃度10g/ml），混勻，37度溫箱中避光標(biāo)記15min。(帶手套操作）2.9 1000rpm，離心10min，棄上清，加30L PBS重懸，取10 L滴于載玻片上，蓋片

9、（不能有氣泡或漂起），保存于暗處。2.10 熒光顯微鏡觀察拍照（紫外激發(fā)）。實驗結(jié)果1 MTT實驗結(jié)果表3 各藥物濃度梯度對應(yīng)的OD值序號0124681011.6781.2071.2650.4140.388-0.148-0.26321.6021.5091.1530.3240.301-0.146-0.331.5861.5311.1970.3660.094-0.107-0.22841.6531.5391.250.4190.66-0.142-0.275均值1.629751.44651.216250.380750.36075-0.13575-0.2665抑制率0.112440.253720.76638

10、0.7786511表4 SPSS軟件求得的IC50（紅框所示）圖2各藥物濃度梯度對應(yīng)的抑制率及其擬合直線根據(jù)圖二可以看出，藥物濃度越大，對細胞抑制效果越強，又因R2=0.941，擬合效果較好。根據(jù)表四得：ic50=3.21g/ml。綜合其他組的實驗結(jié)果和助教的預(yù)實驗，認(rèn)為3.21g/ml可能抑制效果不夠明顯，不利于拍到凋亡細胞形態(tài)，最終取4g/ml繼續(xù)做后面的藥物對核型影響的實驗。2 熒光染色結(jié)果圖3 阿霉素對照組細胞核熒光染色照片圖4 阿霉素（4 g/ml)細胞核熒光染色照片對照組細胞細胞核正常，呈規(guī)則的圓形，細胞整體呈藍色，幾乎沒有凋亡細胞，屬于正常細胞，由于操作問題，有少量呈紫紅色壞死細胞。實驗組除了有正常的細胞外，還有一些細胞細胞核呈現(xiàn)腎形或坍縮狀等不規(guī)則形狀，有凋亡小體(白色箭頭所示)形成，屬于凋亡細胞，此外，還有大量壞死（白圈所示）細胞，細胞呈紅色或紫紅色。結(jié)果表明阿霉素對于BG-823細胞的凋亡具有促進作用。討論1 實驗整體系統(tǒng)誤差分析受到實驗條件的限制，鋪板后加藥前之間