北京培訓(xùn)中心_兩蟲(chóng)全流程

1、1 水中隱孢子蟲(chóng)和賈第蟲(chóng)的檢測(cè)愛(ài)德士培訓(xùn)中心Sep 27,20132流 程選 擇回收率 3兩蟲(chóng)檢測(cè)全流程 樣品預(yù)處理（Sample Pretreatment）. 染色鏡檢（Staining and Microscopy）. 免疫磁分離（IMS）. 過(guò)濾. 淘洗. 離心. 4樣品預(yù)處理過(guò)濾加標(biāo)實(shí)驗(yàn)（QC） 10L l 采樣量5樣品預(yù)處理過(guò)濾6樣品預(yù)處理過(guò)濾l 濾芯結(jié)構(gòu)過(guò)濾時(shí)水流流向淘洗時(shí)水流流向 79層多孔網(wǎng)狀泡沫層，兩種規(guī)格交互疊放，由790mm壓縮至30mm，螺栓固定。 濾芯兩個(gè)過(guò)濾層：外層區(qū)域?yàn)槌鯙V器，內(nèi)層濾核為選擇性濾器（此結(jié)構(gòu)在提高污水樣品過(guò)濾速度的同時(shí)，保證有效地捕獲隱孢子蟲(chóng)卵）。

2、淘洗時(shí)，目標(biāo)微生物以反流的形式更方便地進(jìn)行有效淘洗。 可處理高濁度原水。 取樣流速可達(dá)4L/min。7樣品預(yù)處理過(guò)濾l 實(shí)驗(yàn)室過(guò)濾8樣品預(yù)處理過(guò)濾l 現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾9樣品預(yù)處理過(guò)濾l 現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾兩蟲(chóng)移動(dòng)取樣箱10樣品預(yù)處理過(guò)濾 濾器 濾芯 采樣管 水表 保溫袋 自封袋l 現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾兩蟲(chóng)移動(dòng)取樣箱11樣品預(yù)處理過(guò)濾 根據(jù)客戶需要合理設(shè)計(jì)的取樣箱。 解決現(xiàn)場(chǎng)采樣問(wèn)題，并使得現(xiàn)場(chǎng)采樣操作簡(jiǎn)便。 解決部分無(wú)兩蟲(chóng)檢測(cè)設(shè)備的送樣問(wèn)題。l 現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾兩蟲(chóng)移動(dòng)取樣箱12樣品預(yù)處理過(guò)濾l 現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾13樣品預(yù)處理過(guò)濾l 現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾14樣品預(yù)處理淘洗l Filta-Max Xpress兩蟲(chóng)快速法淘洗設(shè)備 穩(wěn)定的高回收率（大于70

3、%）。 淘洗時(shí)間90s，目前全球淘洗速度最快的設(shè)備。 一鍵操作，操作簡(jiǎn)單。 不同樣品的結(jié)果一致性高，性能穩(wěn)定。15樣品預(yù)處理離心 離心機(jī)應(yīng)放在牢固的工作臺(tái)或地板上，盡量減少晃動(dòng)。 離心管連同適配器一起配平，保證誤差在0.5g以內(nèi)，盡量減少擺動(dòng)。 離心機(jī)設(shè)定2000g離心力，工作時(shí)間15分鐘。 離心機(jī)應(yīng)選用無(wú)剎車系統(tǒng)的（自然停止大約需7分鐘） 。 16免疫磁分離 基于細(xì)胞表面抗原能與連接在磁珠上的特異性單抗相結(jié)合，形成抗原-抗體-磁珠免疫復(fù)合物，在外磁場(chǎng)中，復(fù)合物被吸附而滯留在磁場(chǎng)中，使其與其他物質(zhì)分離。 l 定義17免疫磁分離18免疫磁分離19免疫磁分離l 試劑盒20免疫磁分離樣品量：0.5-

4、0.8ml沉淀混勻時(shí)間：1-2小時(shí)依次取下L型試管90旋轉(zhuǎn)2分鐘棄上清1XbufferA沖洗磁珠180旋轉(zhuǎn)1分鐘棄上清后酸化分離l 實(shí)驗(yàn)流程21免疫磁分離l 沉淀物體積對(duì)于沉淀量小于0.5mL的樣品，直接再懸浮成10mL.對(duì)于沉淀量大于0.5mL的樣品，按照上述公式，即每0.5mL沉淀懸浮成10mL。比如，2mL沉淀應(yīng)該懸浮成40mL，具體免疫磁分離過(guò)程可以取其中一分部進(jìn)行。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，20L原水的沉淀量一般1-2mL；100L處理水的沉淀量一般小于0.5mL。22免疫磁分離l 結(jié)果計(jì)算如出廠水檢測(cè)出3個(gè)隱孢子蟲(chóng)，帶入共計(jì)進(jìn)行計(jì)算： Y=（310mL)/(10mL100L)=0.03個(gè)/L如原水

5、沉淀量2mL，懸浮成40mL，免疫磁分離取了其中10mL，檢出3個(gè)隱孢子蟲(chóng)，帶入并計(jì)算： Y=（340mL)/(10mL20L)=0.6個(gè)/L23染色鏡檢l 染色試劑盒 單克隆熒光抗體染色試劑 復(fù)染液 封固劑 DAPI染色試劑 陽(yáng)參 1倍洗脫緩沖液24染色鏡檢l 異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)分子量為389.4，最大吸收光波長(zhǎng)為490495nm，最大發(fā)射光波長(zhǎng)為525530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。FITC是在熒光素的基礎(chǔ)上通過(guò)化學(xué)反應(yīng)增加硫氰酸基團(tuán)得到的，硫氰酸基團(tuán)可以和生物活性物質(zhì)，例如蛋白質(zhì)上的伯胺基團(tuán)反應(yīng)形成硫脲鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物

6、活性物質(zhì)的熒光標(biāo)記。能和各種抗體蛋白結(jié)合，結(jié)合后的抗體不喪失與一定抗原結(jié)合的特異性，并在堿性溶液中具有強(qiáng)烈的黃綠色熒光。通過(guò)在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對(duì)相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測(cè)。儲(chǔ)存條件：4避光保存。25染色鏡檢l 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)一種能夠與DNA強(qiáng)力結(jié)合的熒光染料，常用與熒光顯微鏡觀測(cè)。因?yàn)镈API可以透過(guò)完整的細(xì)胞膜，它可以用于活細(xì)胞和固定細(xì)胞的染色。在熒光顯微鏡觀察下，DAPI染劑是利用紫外光波長(zhǎng)的光線激發(fā)。當(dāng)DAPI與雙股DNA結(jié)合時(shí)，最大吸收波長(zhǎng)為358nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm

7、，其發(fā)散光的波長(zhǎng)范圍含蓋了藍(lán)色至青綠色。能快速進(jìn)入活細(xì)胞中與DNA結(jié)合，因此DAPI對(duì)生物體而言，也被視為一種毒性物質(zhì)與致癌物。使用過(guò)程中應(yīng)注意操作與拋棄的處理程序。26染色鏡檢l 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)濃度2mg/mL，用時(shí)需要5000倍稀釋，現(xiàn)用現(xiàn)配。27染色鏡檢l 鏡檢28染色鏡檢l 兩蟲(chóng)孢囊與卵囊特征賈第蟲(chóng)孢囊 外形：卵形或橢圓形 直徑：11-14um29染色鏡檢l 兩蟲(chóng)孢囊與卵囊特征隱孢子蟲(chóng)卵囊 外形：類似球 直徑：4-6um30染色鏡檢l 兩蟲(chóng)孢囊與卵囊特征 蘋果綠外殼：充要條件 大小和形狀31染色鏡檢FI

8、TC染色DAPI染色DIC觀察32染色鏡檢33染色鏡檢34染色鏡檢35如何提高回收率l 采用商售PBS淘洗液試劑品牌貨號(hào)l PBSSigmaP4417-50TABl NaOHFluka38215-1EA-Rl HClFluka35335-1Ll Tween20SigmaP7949-100ML36如何提高回收率l 采用商售HCL和NaOH試劑，或標(biāo)配所需酸堿37如何提高回收率l 對(duì)容器和管子進(jìn)行潤(rùn)洗 使用0.05%的吐溫20或者吐溫80，對(duì)于樣品接觸的所有容器都進(jìn)行潤(rùn)洗，將潤(rùn)洗的液體也加入樣品。38如何提高回收率l 離心后，謹(jǐn)慎去除上清液 可采取虹吸，棄去上清。管子上插上槍頭，使得震動(dòng)最小。39

9、如何提高回收率l 謹(jǐn)慎清洗玻片 隱孢子蟲(chóng)和賈第蟲(chóng)可能在染色過(guò)程被沖走，為了避免此情況發(fā)生，請(qǐng)輕輕的移走玻片上的液體。40如何提高回收率l 玻片干燥過(guò)程可影響回收率 IMS過(guò)程中的酸如果沒(méi)有有效中和可以破壞賈第蟲(chóng)的孢囊外表，引起賈第蟲(chóng)染色過(guò)程中的變化。這可以導(dǎo)致鏡檢過(guò)程中賈第蟲(chóng)的漏檢?？焖賹悠犯稍镆约袄洳貥悠房梢员ＷC賈第蟲(chóng)的表面不受損壞 。 為了優(yōu)化此步驟，確保樣品一旦中和后，快速在37條件下干燥（最長(zhǎng)干燥時(shí)間1小時(shí)），并立即染色。 如果IMS中和后需要延遲染色，需要快速在37干燥玻片后立即放入冰箱冷藏過(guò)夜。否則，需要在標(biāo)準(zhǔn)的家用冰箱冷藏過(guò)夜。在冷室中干燥玻片可能由于濕度環(huán)境使得玻片不易干燥。

10、41如何提高回收率l 免疫磁分離對(duì)于一些水樣，很大一部分的隱孢子蟲(chóng)和賈第蟲(chóng)可能會(huì)遺漏在IMS磁珠上，在酸化過(guò)程中沒(méi)有得到回收。此時(shí)進(jìn)行二次酸化可以有效提高回收率。IMS分離過(guò)程中，二次酸化分離非常有用。對(duì)于回收率比較低沒(méi)有滿足回收率標(biāo)準(zhǔn)的樣品，可以將其IMS過(guò)程廢棄的上清液進(jìn)行收集，對(duì)這些廢液再次進(jìn)行免疫磁分離過(guò)程，以滿足回收率。可以將廢液收集到免疫磁分離之前用的 50mL的離心管中，這可以避免錯(cuò)誤的標(biāo)記樣品，你可以分辨哪個(gè)樣品具有較低的回收率然后做一個(gè)二次的免疫磁分離。非常多的干擾免疫磁分離的物質(zhì)在第一次免疫磁分離過(guò)程中都被去除掉了，所以第二輪免疫磁分離回收率可能會(huì)戲劇性的更高。42如何提高回收率l 可中斷的