農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 NY

1、農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 NY/T 8832004  1范圍本規(guī)程規(guī)定了農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)中所涉及的生產(chǎn)環(huán)境、生產(chǎn)車間、菌種、發(fā)酵增殖、后處理、包裝、儲運及質(zhì)量檢驗等技術(shù)環(huán)節(jié)作出要求。本標準適用于農(nóng)用微生物菌劑產(chǎn)品。2標準性引用文件以下文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。但凡注日期的引用文件，其隨后所有的修改單不包括勘誤的內(nèi)容或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。但凡不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB 3095-1996  環(huán)境空氣質(zhì)量標準GB 3838-2002  地表水質(zhì)量標準

2、3生產(chǎn)環(huán)境及生產(chǎn)車間要求3.1生產(chǎn)環(huán)境 廠區(qū)空氣質(zhì)量到達大氣環(huán)境質(zhì)量標準GB 3095-1996中類標準要求； 發(fā)酵用水到達地表水質(zhì)量標準GB 3838-2002中類水質(zhì)要求，冷卻水及其他用水到達標準中類水質(zhì)要求；3.2生產(chǎn)車間 發(fā)酵車間與吸附等后處理車間距離適當，相對隔離，有密閉且可以滅菌的傳輸通道； 菌種的儲藏間、無菌操作間與生產(chǎn)車間相對隔離； 發(fā)酵等生產(chǎn)關(guān)鍵性車間采用雙路供電或備用一套發(fā)電機。 建立定期用消毒劑進行生產(chǎn)設(shè)備和環(huán)境消毒的車間環(huán)境衛(wèi)生制度。4生產(chǎn)技術(shù)流程農(nóng)用微生物菌劑的一般生產(chǎn)技術(shù)環(huán)節(jié)為：菌種種子擴培發(fā)酵培養(yǎng)后處理包裝產(chǎn)品質(zhì)量檢驗出廠。流程圖見附錄A。4.1菌種4.1.1原種

3、原種是生產(chǎn)用菌種的母種，對原種的要求如下： 有菌種鑒定報告； 菌種的企業(yè)編號、來源等信息。4.1.2菌種的保存和管理 采用適宜的方式保存菌種，確保無雜菌污染，菌種不退化。應(yīng)選用一種以上適宜的方法保藏，常見菌種類型及相應(yīng)保藏方式見附錄B； 分類存放，定期檢查； 建立菌種檔案。4.1.3菌種質(zhì)量控制在生產(chǎn)之前，應(yīng)對所用菌種進行檢查，確認其純度和應(yīng)用性能沒有發(fā)生退化。出現(xiàn)污染或退化的菌種不能作為生產(chǎn)用菌種，需進行4.1.4或4.1.5操作。4.1.4菌種的純化菌種不純時，應(yīng)進行純化?？刹捎闷桨鍎澗€別離法或稀釋別離法，得到純菌種。必要時可采用顯微操作單細胞別離器進行菌種別離純化。對純化的菌種應(yīng)進行生產(chǎn)

4、性能的檢查。4.1.5菌種的復壯菌種發(fā)生以下現(xiàn)象之一，應(yīng)進行菌種復壯： 菌體形態(tài)及菌落形態(tài)發(fā)生變化； 代謝活性降低，發(fā)酵周期改變； 重要功能性物質(zhì)的產(chǎn)生能力下降； 其他重要特性的退化或喪失；菌種復壯方法：回接到原宿主或原別離環(huán)境傳代培養(yǎng)，重新別離該菌種。4.2發(fā)酵增殖4.2.1種子擴培原菌種應(yīng)連續(xù)轉(zhuǎn)接活化至生長旺盛前方可應(yīng)用。種子擴培過程包括試管斜面菌種、搖瓶或固體種子培養(yǎng)瓶、種子罐發(fā)酵或種子固體發(fā)酵培養(yǎng)三個階段，操作過程要保證菌種不被污染、生長旺盛。4.2.2培養(yǎng)基培養(yǎng)基重要原料應(yīng)滿足一定的質(zhì)量要求，包括成分、含量、有效期以及產(chǎn)地等。對新使用的發(fā)酵原料需經(jīng)搖瓶試驗或小型發(fā)酵罐試驗前方可用于發(fā)

5、酵生產(chǎn)。4.2.2.1種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基要保證菌種生長延滯期短，生長旺盛。原料應(yīng)使用易被菌體吸收利用的碳、氮源，且氮源比例較高，營養(yǎng)豐富完全，有較強的pH緩沖能力。最后一級種子培養(yǎng)基主要成分應(yīng)接近發(fā)酵培養(yǎng)基。4.2.2.2發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基要求接種后菌體生長旺盛，在保證一定菌體或芽胞、孢子密度的前提下兼顧有效代謝產(chǎn)物。原料應(yīng)選用來源充足、價格廉價且易于利用的營養(yǎng)物質(zhì)，一般氮源比例較種子培養(yǎng)基低。可采用對發(fā)酵培養(yǎng)基補料流加的方法改善培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成以到達高產(chǎn)。4.2.3滅菌常用的滅菌方式及適用對象見附錄C。4.2.3.1高壓蒸汽滅菌操作要求a)    液體培養(yǎng)基

6、、補料罐包括消泡劑、管道、發(fā)酵設(shè)備及空氣過濾系統(tǒng)滅菌溫度為121125(壓力0.103Mpa 0.168Mpa)，0.5h1.0h。液體培養(yǎng)基裝料量為50%75%發(fā)酵罐容積。b)    固體培養(yǎng)基物料滅菌溫度為121130，1.0h 2.0h；或采用100滅菌2h4h，24h后再滅菌一次。c)    在高溫滅菌會產(chǎn)生對菌體生長有害物質(zhì)或?qū)σ资芨邷仄茐奈锪蠝缇鷷r，應(yīng)采用物料分別滅菌或降低滅菌溫度延長時間。培養(yǎng)基滅菌后按4.2.3.2進行檢查。假設(shè)滅菌不徹底，培養(yǎng)基不得使用。4.2.3.2滅菌效果檢查采用顯微鏡染色觀察法和/或發(fā)酵管試驗法

7、檢查培養(yǎng)基的滅菌效果。4.2.3.2.1染色觀察法a)     對待檢測培養(yǎng)基無菌操作取樣，在潔凈載玻片上涂片、染色、鏡檢。b)     假設(shè)鏡檢發(fā)現(xiàn)有菌體，即可認為滅菌不徹底，需要進行4.2.3.2.2操作，無活菌體后培養(yǎng)基方可使用。c)     假設(shè)未發(fā)現(xiàn)菌體，初步認為滅菌徹底，培養(yǎng)基可以使用。在必要時,可進行4.2.3.2.2操作，以進一步確認培養(yǎng)基滅菌徹底。4.2.3.2.2發(fā)酵管試驗法用無菌操作技術(shù)將1mL供試培養(yǎng)基加至5mL已滅菌的營養(yǎng)肉湯中，重復三次。置于37培

8、養(yǎng)，24h內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體即可認為滅菌徹底。反之，即可判定培養(yǎng)基滅菌不徹底。4.2.4無菌空氣發(fā)酵生產(chǎn)中所通入的無菌空氣采用過濾除菌設(shè)備制得，空氣過濾系統(tǒng)應(yīng)采用二級以上過濾。對制得的無菌空氣按如下步驟檢驗合格前方可用于發(fā)酵生產(chǎn)。用無菌操作技術(shù)，向裝有100mL200mL無菌肉湯培養(yǎng)基的三角瓶中通入待監(jiān)測濾過空氣10min15min。三角瓶置于37培養(yǎng)，24h內(nèi)無渾濁、鏡檢無菌體即判定合格。4.3發(fā)酵控制4.3.1接種量的要求 搖瓶種子轉(zhuǎn)向種子發(fā)酵罐培養(yǎng)的接種量為0.5%5%； 在多級發(fā)酵生產(chǎn)階段，對生長繁殖快的菌種代時<3h，從一級轉(zhuǎn)向下一級發(fā)酵的接種量為5%10%；對生長繁殖較慢的

9、菌種代時>6h，接種量不低于10%。4.3.2培養(yǎng)溫度發(fā)酵溫度應(yīng)控制在2535，對特殊類型的菌種應(yīng)根據(jù)其特性而定。在發(fā)酵過程中，可根據(jù)菌體的生長代謝特性在不同的發(fā)酵階段采用不同的溫度。4.3.3供氧通常采用的供氧方式是向培養(yǎng)基中連續(xù)補充無菌空氣，并與攪拌相配合，或者采用氣升式攪拌供氧。對于好氧代謝的菌株或兼性厭氧類型菌株，培養(yǎng)基中的溶解氧不得低于臨界氧濃度；嚴格厭氧類型菌株培養(yǎng)基的氧化復原電位不得高于其臨界氧化復原電位。4.3.4物料含水量固體發(fā)酵初期適宜發(fā)酵的物料含水量為50%60%。發(fā)酵結(jié)束時，應(yīng)控制在20%40%。4.3.5發(fā)酵終點判斷以下參數(shù)為發(fā)酵終點判定依據(jù)： 鏡檢觀察菌體的形

10、態(tài)、密度,要求芽胞菌發(fā)酵結(jié)束時芽胞形成率80%； 監(jiān)測發(fā)酵液中復原糖、總糖、氨基氮、pH值、溶解氧濃度、光密度及粘度等理化參數(shù)； 監(jiān)測發(fā)酵過程中攝氧率、CO2產(chǎn)生率、呼吸熵、氧傳遞系數(shù)等發(fā)酵代謝特征參數(shù)； 固體發(fā)酵中物料的顏色、形態(tài)、氣味、含水量等變化。4.4后處理后處理過程可分為發(fā)酵物同載體或物料混合吸附和發(fā)酵物直接分裝兩種類型。4.4.1發(fā)酵物同載體(或物料)混合吸附對載體及物料的要求如下： 載體的雜菌數(shù)1.0×104個/ g； 細度、有毒有害元素Hg、Pb、Cd、Cr、 As含量、pH、糞大腸菌群數(shù)、蛔蟲卵死亡率值到達產(chǎn)品質(zhì)量標準要求； 有利于菌體或芽胞、孢子的存活。

11、發(fā)酵培養(yǎng)物與吸附載體需混合均勻，可添加保護劑或采取適當措施，減少菌體的死亡率。吸附和混合環(huán)節(jié)應(yīng)注意無菌控制,防止雜菌污染。4.4.2發(fā)酵物直接分裝對于發(fā)酵物直接分裝的產(chǎn)品劑型，可根據(jù)產(chǎn)品要求進行包裝。4.5建立生產(chǎn)檔案每批產(chǎn)品的生產(chǎn)、檢驗結(jié)果應(yīng)存檔記錄，包括檢驗工程、檢驗結(jié)果、檢驗人、批準人、檢驗日期等信息。4.6產(chǎn)品質(zhì)量跟蹤定期檢查產(chǎn)品質(zhì)量，并對產(chǎn)品建立應(yīng)用檔案，跟蹤產(chǎn)品的應(yīng)用情況。                 

12、0;   附錄A                     資料性附錄農(nóng)用微生物制劑生產(chǎn)工藝流程示意圖略                       附 錄 B&

13、#160;                   資料性附錄               農(nóng)用微生物菌劑生產(chǎn)中菌種的常用保藏方式保藏方式一般存放條件適合的微生物菌種類型一般保存期限凍干管保藏冰箱或室溫各類菌種5年以上沙土管保藏枯燥條件芽胞桿菌、真菌、放線菌2年以上石蠟油保藏4冰箱各

14、類菌種1年以上甘油管保藏-18冰箱或更低溫度主要是細菌1年以上固體曲保藏枯燥條件,4冰箱產(chǎn)生各類孢子的真菌1年以上常規(guī)保藏4左右冰箱各類菌種2個月12個月                    附 錄 C                   資料性附錄          農(nóng)用微生物制劑的生產(chǎn)中常用滅菌方法及適用對象滅菌方式操作要求一般應(yīng)用對象高壓蒸汽滅菌115130，20 min60min培養(yǎng)基，耐熱器皿，廢棄物干熱滅菌160170，1.5 h 2h耐熱器皿，耐熱物料紫外線滅菌距離紫外燈管15W1.2m，0.5h以上潔凈間，潔凈臺化學藥劑滅菌濃度和用量根據(jù)具體情況而定潔凈間，設(shè)備及器材輻射滅菌輻射強度和時間根據(jù)具體情況而定不適宜于熱滅菌的