細胞污染及處理方法

1、細胞污染及處理方法總結潔凈區(qū)，并不是沒有細菌，而是細菌的數(shù)量格外少，國家標準100級的潔凈標準是浮游菌數(shù)不得超過5個每立方米，沉降菌數(shù)不得超過1個每培育皿.而國外的標準比我國的還要高一點，要求的數(shù)量更少。所以在我們的潔凈操作臺里，并不是真正一個細菌都沒有的，所以在操作的時候還是要盡量利索快速地完成操作。盡量削減進入培育體系細菌的數(shù)量。所以處理細菌污染的重要原則就是：無限地稀釋細菌的濃度，無限地削減細菌的數(shù)量！1、 細菌污染培育基：顏色發(fā)紅，液體清亮或渾濁；顯微鏡下：有黑點或桿狀物在處處游走，細胞部分脫落，消滅細胞碎片；成像：圖一：桿菌污染圖二：白色鏈球菌以下是摘自丁香園的處理方法：1） .將污

2、染的培育液倒掉，轉燒瓶口，加入10mlPBS，適當晃動清洗培育瓶，然后倒掉。轉燒瓶口。2） .連續(xù)加入10mlPBS，同樣方法晃動，清洗培育瓶，然后倒掉。3） .連續(xù)加入5mlPBS，同樣方法洗瓶，主要是培育面，然后倒掉。4） .重復步驟3再洗。5） .重復步驟3再洗。6） .加入3-5ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。7） .加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。8） .再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。9） .加入10ml培育液，加入2ml雙抗，放置培育箱培育，5小時之后，倒掉培育基，加入PBS洗瓶兩次，然后加入胰酶消化，吹打后置于離心機800-1000r/min離心，然

3、后洗一次。置于新的培育瓶里培育，培育體系加入2ml雙抗。10） .24h之后，視狀況換液，若仍舊污染嚴峻，培育基渾濁，重復以上步驟，若看不到污染物，則連續(xù)步驟1)、3）、4）、6）、8），然后加入培育液培育，培育體系加入2ml雙抗.11） .24h之后，若仍污染嚴峻，可再重復一次，若還污染只能棄之（不過一般沒有消滅這種狀況），若鏡下不見污染物，則換液PBS洗瓶，正常培育。（常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）若細胞狀態(tài)極差，盡早處理掉細胞，并找出污染源，對培育箱，生物平安柜，細胞房進行消毒處理。2、 真菌污染培育基：有的培育液清亮，不變色；顯微鏡下：有絲狀物，有些真菌開頭很像死細胞碎片，只是它很多

4、很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，漸漸的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那么簡潔被發(fā)覺，但是一旦發(fā)覺有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。成像：圖三：看上去像白色念珠菌污染處理方法：若為霉菌或者真菌污染，加入兩性霉素B清洗和培育，終濃度一般為2.5g/ml（在30g/ml時會有細胞毒性）。另外也可以選擇在培育基里加3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。其它操作同細菌。3、 霉菌污染培育基：培育液是清亮的；顯微鏡下：絮狀雜質(zhì)，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂移物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長，但時間長之后，細胞的活力狀態(tài)變差；成像：處理方法：預防霉菌污染，可在培育基里加

5、3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；（原來我們這里也有霉菌感染的，不過后面在培育基里加上了0.5的大?？担ㄔ瓉淼碾p抗各改為0.25的青霉素和鏈霉素）摘自丁香園），效果還可以！你可以試試！但細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細胞。，將環(huán)境徹底消毒，假如全部細胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培育基和器材，假如只是個別污染，可能是操作問題，就要留意操作 。霉菌污染多來自空氣,所以做試驗時說話談天,或瓶口放開時間太長,還有培育箱開關頻繁是主要緣由,還是多找自身緣由. 4、 支原體污染支原體污染后，不會馬上使細胞死亡，可以與細胞長期共存，培育基一

6、般不發(fā)生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞收到多方面潛在影響，如引起細胞變形， 影響 DNA 合成，抑制細胞生長等。培育基：可能無明顯表現(xiàn)；顯微鏡下：漸漸會使細胞狀態(tài)變差,生長變慢，在顯微鏡下觀看可能會有小黑點，但培育基一般不發(fā)生 渾濁。細胞傳代以后就消滅細胞間黑點，細胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細胞，最終細胞漂移，完全死亡。細胞生長緩慢，或者消滅無明顯誘因脫落，凋亡，細胞碎片增多，有的甚至只表現(xiàn)為細胞狀態(tài)日漸不佳。成像：處理方法：接受支原體清除劑，有同學說用泰樂處理支原體污染效果比較好。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于細胞培育，無任何不良反應。Sigma公司的使用時

7、用50ug/ml Tylosin培育液培育6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。假如作為常用的抗生素的話, 建議用8ug/ml的濃度。一般處理起來比較簡單，因此多放棄細胞重新培育。5、 黑膠蟲污染培育基：可能無明顯表現(xiàn)，或液體顏色異樣顯微鏡下：大量黑點原地震驚，與細菌污染相鑒別，細胞狀態(tài)不佳。有的因細胞密度較高，或細胞增殖較快，細胞代謝產(chǎn)物增多，要留意鑒別。成像：處理方法：黑膠蟲在科研領域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應對方法。預防為主！還是要強調(diào)無菌操作??！尤其留意血清的質(zhì)量！這個是主要來源。一般建議用北美血清，這個黑膠蟲污染會概率小。6、 原蟲污染培育基：培育液可稍微渾濁顯微鏡下：細小的點狀物數(shù)量格外多，稍微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態(tài)不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪養(yǎng)分。這種共生是格外普遍的，但他們的數(shù)量小，細胞占優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達肯定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。成像：處理方法：在操作的過程中，肯定要當心操作動作，輕柔緩慢，切忌大動作魯莽。防止細胞脫落。這個挽救細胞還是主要針對無路可退的時候。污染還是重在預防！細胞房培育箱每兩周更換一次水（高壓過的雙蒸水），條件允許的每兩周可以用酒精擦洗一遍培育箱；地面每兩到三天用新潔爾滅拖洗一遍，桌面等同