淮山藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究

1、淮山藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用研究              作者：徐增萊，汪瓊，趙猛，徐琴，賈成森，史云云【摘要】  目的探討淮山藥粗多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。方法小鼠灌胃給予不同劑量（200，400和800 mg/kg）的淮山藥多糖，1次/d，連續(xù)8 d，進(jìn)行ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）、測(cè)定血清溶血素測(cè)定（半數(shù)溶血值法）、小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)。結(jié)果山藥多糖具有增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的作用，促進(jìn)小鼠抗體生成的作用和增強(qiáng)小鼠碳廓清能力的作用。結(jié)論淮山藥多

2、糖具有一定的免疫功能增強(qiáng)作用。 【關(guān)鍵詞】  淮山藥；多糖；免疫調(diào)節(jié)Key words：Dioscorea opposita Thunb.;  Polysaccharide;  Immunity moderation   山藥屬常用中藥，味甘、性平，具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精等作用。山藥多糖Dioscorea opposita Thunb.polysaccharide是從山藥中分離提純的水溶性多糖成分，具有免疫調(diào)節(jié)作用。以往有關(guān)山藥的藥理研究多針對(duì)河南省出產(chǎn)的鐵棍山藥和太谷山藥等懷山藥品種。而山藥在全國(guó)大部分地區(qū)均有栽培，淮山藥為其在淮河

3、中下游地區(qū)（江蘇、安徽兩省北部）傳統(tǒng)栽培品種。以食用為主，兼作藥用。對(duì)淮山藥等山藥地方品種的藥理作用至今仍缺乏研究。為了充分利用淮山藥資源，本實(shí)驗(yàn)研究了江蘇產(chǎn)淮山藥粗多糖對(duì)小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。1  材料1.1  樣品淮山藥Disoscorea oppostita Thunb.來源：淮山藥采自江蘇省灌南縣花苑鄉(xiāng)。   將淮山藥削皮切片，曬干后粉碎，干燥后稱取粗粉（60目）900.0 g，加入適量蒸餾水在水浴中浸提，其間不斷攪拌，靜置冷卻后離心（3 000 r/min，5 min）除去不溶物，收集上清液，減壓濃縮。在冷卻后的上清液中加入95%乙醇至醇含量在8

4、0%以上，不斷攪拌，有大量沉淀生成，離心，收集沉淀，分別用無水甲醇和乙醚洗滌，以除去水分和雜質(zhì)，得到灰白色粉末狀粗多糖38.88 g(1 g粉末相當(dāng)于生藥23.14 g)。粗多糖得率可以達(dá)到4.32%，該粗多糖中含有18.43% 的山藥多糖。1.2  動(dòng)物和細(xì)胞ICR種小鼠1822 g，雄性，中國(guó)科學(xué)院上?？巳R斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（滬）2003-2004。豚鼠，由江寧青龍動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，動(dòng)物使用許可證號(hào)：（蘇）2002-0057。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均食用全價(jià)顆粒飼料，自由攝食飲水。YAC-1細(xì)胞，由南京中醫(yī)藥大學(xué)海洋中心藥理毒理室提供。1.3  綿羊紅細(xì)胞（SRBC

5、）與補(bǔ)體制備健康綿羊頸脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個(gè)方向搖動(dòng)，以脫纖維，用阿氏液保存于4冰箱保存?zhèn)溆?。用時(shí)生理鹽水2000 r/min離心10 min洗滌3遍。   采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清），前將1 ml壓積SRBC加入到5 ml豚鼠血清中，放4冰箱30 min，經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝小瓶，-70保存。用時(shí)以生理鹽水按110稀釋。2  方法   小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（給予蒸餾水）及山藥多糖200，400，800 mg/kg1 3個(gè)劑量組，每組10只。灌胃體積0.1 ml/10 g體重，1次/d，連續(xù)8

6、d。2.1  C onA誘導(dǎo)的小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)1640培養(yǎng)液用微孔濾膜過濾除菌，加入10%小牛血清、1%谷氨酰胺（200 mg/ml）、青霉素（100 mg/ml）、鏈霉素（100 mg/ml）及2-巰基乙醇（5 mol/ml），用無菌HC1（1 mol/L）或無菌NaOH（1 mol/L）調(diào)pH至7.07.2，制成完全培養(yǎng)液；用7.27.4的PBS緩沖液作溶劑，現(xiàn)用現(xiàn)配MTT溶液（5 mg/ml）；以3.5%的無菌NaHCO3將無菌Hansks液pH調(diào)至7.27.4；用雙蒸水配制成100 g/ml的ConA液，過濾除菌后，-20保存；在96 ml異丙醇中加入4 ml HCl（1

7、 mol/L）制成酸性異丙醇溶液。各組動(dòng)物連續(xù)灌胃至第8天，每鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾，于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用攝子輕輕將脾撕碎，制成單個(gè)細(xì)胞懸液，200目過濾，用Hanks液多次洗滌、離心后懸浮于2 ml完全培養(yǎng)液中，用臺(tái)酚染色計(jì)活細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/ml，分兩孔放入培養(yǎng)孔中，每孔1 ml，一孔加50 l ConA液，另一孔作為對(duì)照，置5%CO2，37培養(yǎng)72 h，培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔輕輕吸去上清液0.7 ml，加入0.7 ml不含小牛血清的1640培養(yǎng)液，同時(shí)加入50 mlMTT液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結(jié)束，每孔加入1 ml酸性異丙醇，吹打混勻，使

8、紫色結(jié)晶完全溶解，移入1 ml比色杯中，于分光光度計(jì)，570 nm處測(cè)定光密度2。         2.2  血清溶血素測(cè)定半數(shù)溶血值（HC50）的測(cè)定各組動(dòng)物連續(xù)灌胃至3 d時(shí)，每鼠腹腔注射2%（v/v）綿羊紅細(xì)胞懸液0.2 ml。5 d（期間不停止灌胃）后，小鼠經(jīng)眼眶取血于離心管中，放置1 h，3 500 r/min離心15 min，收集血清，血清用生理鹽水緩沖液稀釋320倍。將稀釋后血清1 ml置試管內(nèi)，依次加入10%（v/v）SRBC 0.5 ml，補(bǔ)體1 ml（用生理鹽水按110稀釋），另設(shè)不加

9、血清的對(duì)照管（以生理鹽水代替）。置37恒溫水浴中保溫30 min后，冰浴終止反應(yīng)。2 000 r/min離心10 min。取上清液1 ml，都氏試劑3 ml于試管內(nèi)，同時(shí)取10%（v/v）SRBC 0.25 ml加都氏試劑至4 ml，于另一支試管內(nèi)，作為SRBC的半數(shù)溶血值。充分混勻，放置10 min后，于540 nm處以對(duì)照管作空白，分別測(cè)定各管光密度值2。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HC50）表示，按下列公式計(jì)算：  各小鼠的半數(shù)溶血值（HC50）=樣品管光密度SRBC半數(shù)溶血時(shí)的光密度×稀釋倍數(shù)2.3  小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)將印度墨汁用生理鹽水稀釋4倍制成用墨汁，稱取

10、1.0 gNa2CO3加蒸餾水至1 000 ml配置成0.1%Na2CO3溶液。各組動(dòng)物連續(xù)灌胃至8 d時(shí)，每鼠尾靜脈注入注射用墨汁（0.1 ml/10 g·bw），注入后立即計(jì)時(shí)，于注入后0.5 ，6 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 l，加到2 ml Na2CO3溶液中，用分光光度儀計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度值，以Na2CO3溶液作為空白對(duì)照。頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重3。按下列公式計(jì)算廓清指數(shù)K   廓清指數(shù)K=（logOD50-logOD6）/(t6-t0.5)2.4  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)計(jì)量資料用（±s)表示

11、，各組間實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較采用兩樣本均數(shù)t 檢驗(yàn)，P0.05有顯著差異。3  結(jié)果3.1  ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）用加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值代表淋巴細(xì)胞的增殖能力。結(jié)果如下。表1  淮山藥多糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響(略)   以上結(jié)果表明山藥多糖400，800 mg/kg劑量時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖的能力的作用。3.2  血清溶血素的測(cè)定實(shí)驗(yàn)（HC50法）結(jié)果見表3。表3  淮山藥多糖對(duì)小鼠血清溶血素的影響(略)   以上結(jié)果表明淮山藥多糖各劑量都具有促進(jìn)小鼠抗體生成的作用。3.3  小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。表4  淮山藥多糖對(duì)小鼠碳廓能力的影響(略)   以上結(jié)果表明淮山藥多糖800 mg/kg劑量時(shí)，具有增強(qiáng)小鼠碳廓清能力的作用。4  討論   本研究測(cè)定了淮山藥粗多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響。結(jié)果顯示淮山藥粗多糖對(duì)能增強(qiáng)小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力、促進(jìn)小鼠抗體生成、增強(qiáng)小鼠碳廓清能力等作用。結(jié)果表明淮山藥多糖對(duì)小