植物細胞培養(yǎng)

1、第七章 植物細胞培養(yǎng)第一節(jié)植物細胞培養(yǎng)的理論基礎一、植物細胞的全能性植物細胞全能性是指植物體的每一個活細胞具有發(fā)育成完整個體的潛在能力。即植物體的每個細胞都具有該植物的全部遺傳信息，在適當?shù)膬?nèi)、外條件下，一個細胞有可能形成一完整的新個體。在植物的生長發(fā)育中，從一個受精卵可產(chǎn)生具有完整形態(tài)和結(jié)構(gòu)機能的植株，這是全能性，是該受精卵具有該物種全部遺傳信息的表現(xiàn)。同樣，植物的體細胞，是從合子有絲分裂產(chǎn)生的，也應具有像合子一樣的全能性。但在完整植株上，某部分的體細胞只表現(xiàn)特定的形態(tài)和局部的功能，這是由于它們受到具體器官或組織所在環(huán)境的束縛，但細胞內(nèi)固有的遺傳信息并沒有喪失。因此，在植物組織培養(yǎng)中，被培養(yǎng)

2、的細胞、組織或器官，由于離開了整體，再加上切傷的作用以及培養(yǎng)基中激素等的影響，就可能表現(xiàn)全能性，生長發(fā)育成完整植株。二、植物細胞的脫分化和再分化通常，我們用于組織培養(yǎng)的植物材料，太多是已分化了的細胞。一個已分化有一定機構(gòu)和功能的細胞要表現(xiàn)它的全能性，首先要經(jīng)過一個脫分化的過程。脫分化：是指已分化的細胞在一定因素作用下，失去它原由的機構(gòu)和功能，重新恢復分裂機能。細胞脫分化的機構(gòu)通常形成愈傷組織。從外植體形成愈傷組織的過程，根據(jù)其群體細胞的形態(tài)、細胞分裂、生長活動和RNA相對含量的變動，大致可分起動期、分裂期和形成期三個時期。起動期是細胞準備進行分裂時期。外植體在外觀上雖看不到多大變化，但代謝活化

3、了，細胞內(nèi)的合成代謝迅速進行，RNA的含量急劇上升，細胞核和核仁增大。分裂期的主要特征是被起動細胞進行活躍的細胞分裂。這時細胞比起動的細胞更小，核和核仁更大，RNA含量繼續(xù)上升，出現(xiàn)高峰。由于細胞分裂活躍，細胞數(shù)目迅速增加，開始出現(xiàn)可見的愈傷組織球體。緊接著進入形成期。愈傷組織進一步發(fā)展，細胞分裂較多地出現(xiàn)在愈傷組織的周緣近表面部分，且分割面較多的是平周的，因此構(gòu)成一個所謂愈傷形成層，相應的內(nèi)部細胞顯著增大，核和核仁變小，RNA含量急劇下降。這時愈傷組織迅速長大，同時有薄壁組織分化。愈傷形成層的出現(xiàn)和薄壁組織的分化是愈傷組織建成的特征。用組織培養(yǎng)方法獲得的愈傷組織，其質(zhì)地有的疏松，有的致密。顏

4、色也有不同，它們可以是五色、黃色（含有類胡蘿卜素或黃酮類化合物）、淡綠色（含有少量葉綠素）、紫紅色（含有花青甙）。顯微鏡下的觀察表明：由完全一致的薄壁細胞組成的愈傷組織甚少。愈傷組織通常是由許多異質(zhì)細胞集合而成的積聚體。生長旺盛的愈傷組織含有高比例的類似分升組織狀的細胞群。高度液泡化的細胞可有各種形狀、從圓形到細長形等。再分化：通過脫分化形成的愈傷組織，在一定的培養(yǎng)條件下，可經(jīng)器官發(fā)生或胚狀體發(fā)生進而發(fā)育成完整的植株。由于這是由原來分化狀態(tài)的細胞脫分化培養(yǎng)后，再次分化，所以稱為再分化。器官發(fā)生：是指植物組織培養(yǎng)中由培養(yǎng)形成芽或根的現(xiàn)象。器官發(fā)生可通過愈傷組織，在愈傷組織中形成一些分生細胞團，隨

5、后由其分化成不同的器官原基；也可不通過愈傷組織，由最初的外植體產(chǎn)生器官或由最初外植體通過擬分生組織產(chǎn)生器官。在組織培養(yǎng)中通過形成芽或根而再生植株的方式大致有以下三種：先產(chǎn)生芽，于芽伸長形成莖的基部長根而形成小植物；先長根，在根上長出芽來；在愈傷組織不同部位分別形成芽和根，通過形成連接兩者的維管束組織而形成一個軸，從而形成小植株。大量的研究結(jié)果表明：一般地說，植物組織培養(yǎng)中如先形成芽者，其基部多易生根。反之，如先形成根，則往往會抑制芽的形成。胚狀體發(fā)生：胚狀體是指在培養(yǎng)過程中由外植體或愈傷組織產(chǎn)生的與合子胚發(fā)育方式類似的胚狀結(jié)構(gòu)。它的發(fā)生和器官發(fā)生一樣是以離體組織或細胞的脫分化開始，但以后的一些

6、過程則與單極器官（如芽和根）的發(fā)育不同。胚狀體的發(fā)生過程一般由單個細胞（胚狀體原始細胞）進行一次不均等分裂產(chǎn)生兩個大小不等的細胞，然后由較小的細胞進行連續(xù)分裂產(chǎn)生原胚，而較大的細胞也進行1-2次分裂構(gòu)成胚柄。胚狀體的一個主要特點是兩極性，即在其發(fā)生的最早階段就具有了根端和莖端。因此，胚狀體一旦形成，即可長出小植株。三、植物激素的調(diào)控大量研究表明：在調(diào)節(jié)控制脫分化和再分化的過程中，除了植物材料本身的特性以及營養(yǎng)、光照、溫度等條件完，植物激素起著十分重要的作用。其中影響最顯著的是生長素和細胞分裂素。植物組織培養(yǎng)中常用的生長素類有吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2,4二氯苯氧乙酸（2,4-D）

7、等；細胞分裂素類有激動素（KT）、6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、玉米素（ZT）等。通常，在外植體經(jīng)脫分化形成愈傷組織的過程中，生長素和細胞分裂素是必要的。但由于植物種類及所取部分的不同，誘導其形成愈傷組織所需的激素濃度和組合不同。雙子葉植物一般采用生長素/細胞分裂素比例高的配方；單子葉植物的細胞增殖比雙子葉植物 要求較高的生長素濃度而對細胞分裂素無明顯反應。在大多數(shù)情況下，只用2,4-D就可以成功地誘導愈傷組織。在再分化的過程中，激素的種類和濃度對培養(yǎng)中的再生方式和器官發(fā)生的類型可產(chǎn)生不同的影響。例如在矮牽牛莖、葉組織切塊的培養(yǎng)中，用同一濃度（1mg/L）不同種類的生長素(IAA、NAA、2,

8、4-D)處理，可得到不同的結(jié)構(gòu)。IAA只引起愈傷組織的有限生長；NAA可引起根的大量形成；2,4-D則促進愈傷組織產(chǎn)生，培養(yǎng)兩周后還有胚狀體發(fā)生。用2,4-D作進一步濃度實驗，發(fā)現(xiàn)0.1-0.5mg/L的濃度，可誘導材料形成胚狀體，提高2,4-D濃度（2mg/L），促進愈傷組織生長，但抑制胚狀體形成。生長素，特別是2,4-D是控制體細胞胚狀體發(fā)生的重要因素。在不少材料中均可看到，2,4-D對促進胚狀體的發(fā)生雖有良好效果，但對胚狀體的形成和發(fā)育有抑制傾向。所以，為了促進培養(yǎng)物分化，應及時除去或減少培養(yǎng)基中2,4-D。 第二節(jié) 花藥和花粉的培養(yǎng) 花藥的培養(yǎng)花藥培養(yǎng)是指應用植物培養(yǎng)技術(shù)，把花粉發(fā)育到

9、一定階段的花藥，接種在人工培養(yǎng)基上，以改變花藥內(nèi)花粉粒的發(fā)育途徑，形成花粉胚或愈傷組織，隨后由胚狀體直接發(fā)育成植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)技術(shù)在作物的遺傳育種上具有多種用途，育種以及避免雜種后性狀分離，從而大大提高育種的工作效率。一、花藥培養(yǎng)的方法 花藥培養(yǎng)產(chǎn)生花粉植株一般有兩種途徑：其一是花藥中的花粉通過胚狀體階段發(fā)育為小植株；其二是花藥中花粉在誘導培養(yǎng)基上先形成愈傷組織，再誘導其分化成植株。兩種途徑并無絕對界限，主要取決于培養(yǎng)基中的激素種類及其濃度配比。有時在同一個花藥內(nèi)一些花粉脫分化成愈傷組織，而另一些花粉則分化成胚狀體，在谷子和高粱上都觀察到這種現(xiàn)象。花藥培養(yǎng)時誘導花粉植株能否成功及誘導頻率如何均受

10、到多種因素的影響，其中主要有供試材料及培養(yǎng)方式及條件等。二、供試材料用作花藥培養(yǎng)的親本植株的基因型、生理狀況以及接種時花粉所處的發(fā)育時期，對花粉植株的誘導頻率有直接的影響，因此在接種時對所用的材料要進行嚴格的選擇。1、材料的基因型材料的遺傳背景對培養(yǎng)成敗關(guān)系很大。2、生理狀況親本植株的生理狀況，對誘導頻率有直接影響。煙草開花早期的花藥比后期的更易于產(chǎn)生花粉植株，開花后期的花藥不易培養(yǎng)的原因可能是花粉的可育性有所下降。花粉植株的誘導頻率還與親本植株的生長條件密切有關(guān)。3、花粉發(fā)育時期選擇合適的花粉發(fā)育時期是提高花粉植株誘導頻率的重要因素。被子植物的花粉發(fā)育經(jīng)歷四分體時期、單核期、雙核期和三核期。

11、在花藥早期的研究中發(fā)現(xiàn)，并不是任何時期的花粉都可以培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，只有花粉發(fā)育到一定時期對離體的刺激才最敏感。對大多數(shù)植物而言，單核中期至晚期的花粉最容易形成花粉胚或花粉愈傷組織。在培養(yǎng)花藥之前，要制片鏡檢以確定花粉發(fā)育時期，為方便起見可找出與花粉發(fā)育相對應的形態(tài)學指標。 檢查花粉發(fā)育時期，最常用的有醋酸洋紅染色制片法，對茄科、禾本科的大多數(shù)植物的花粉均可采用此法，但水稻、番茄、蕓苔屬和許多木本植物的花粉細胞核不著色，需采用培花青鉻礬法，可使花粉細胞核染成藍黑色。三、材料的預處理為提高花藥培養(yǎng)的效率，需在接種前對實驗材料進行預處理，實驗結(jié)果證明下列幾種處理有效。1、低溫預處理：低溫預

12、處理可明顯提高花粉胚的誘導率，有人將毛葉曼陀羅的花蕾連同總花梗一同采下，將其插在水中，于3下保存48小時，然后取花藥接種，重復三次，實驗均證明低溫促進花粉胚的產(chǎn)生。2、離心法：將花藥直接離心或在取出花藥前將花蕾及幼穗進行短時間的離心可以提高花粉培養(yǎng)的效率。3、高糖處理：將花藥置于高濃度糖溶液中進行短時間（68分鐘）處理。4、激素處理：用乙烯噴施植株及加入培養(yǎng)基中也可以有效地提高花藥培養(yǎng)的效率。四、材料的接種接種在培養(yǎng)基中花藥一定要保證完全無菌，否則會引起嚴重污染，使培養(yǎng)徹底失敗。接種時注意用具和接種環(huán)境的滅菌，同時盡量減少花藥在空氣中的暴露時間。花藥接種密度較高為好。五、培養(yǎng)基培養(yǎng)基的種類影響

13、培養(yǎng)效果：基本培養(yǎng)基的組成對花藥的培養(yǎng)成功率有明顯的影響。 不同的蔗糖濃度影響培養(yǎng)效果：培養(yǎng)基中蔗糖不僅是最好的碳源，而且還起到調(diào)節(jié)滲透壓的作用。由于不同植物的花粉粒滲透壓差異很大，因此在花藥培養(yǎng)時適宜的蔗糖濃度也不同。對于煙草百分之二的蔗糖效果最好，花粉可經(jīng)胚狀體途徑直接發(fā)育為花粉植株，小麥由花藥誘導花粉愈傷組織用810較為適宜，愈傷組織分化成苗則用58為好。激素：激素對于絕大多數(shù)植物的離體花粉的發(fā)育常常起著關(guān)鍵作用。在實驗過的植物種類中，只有煙草、水稻和小麥花藥可在無激素的培養(yǎng)基上能產(chǎn)生花粉胚和植株。生長素：特別是2，4D促使禾谷類的花粉發(fā)育成愈傷組織。在含有高濃度的生長素的培養(yǎng)基上，茄科

14、植物的花粉胚也會轉(zhuǎn)化成愈傷組織。要使花粉愈傷組織分化為植株，需將他們轉(zhuǎn)移到含低濃度生長素和較高細胞分裂素的分化培養(yǎng)基上。六、培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件1、培養(yǎng)方式花藥的培養(yǎng)方式一般采用瓊脂固化的培養(yǎng)基，但近年來許多研究者用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花藥。采用液體漂浮培養(yǎng)的方法，花粉胚或愈傷組織的產(chǎn)量比在固體培養(yǎng)基上顯著增加。用液體培養(yǎng)基時花藥的生長誘導物質(zhì)容易擴散到培養(yǎng)基中，從而誘發(fā)更多的花藥對培養(yǎng)起反應?？膳懦傊锌赡軘y帶的微量生長抑制物。有些植物如煙草、水稻、小麥和大麥等用花藥漂浮法培養(yǎng)、誘導愈傷組織的成功率雖高，但植株分化的頻率卻較在瓊脂培養(yǎng)基上為低。在禾谷類中，液體培養(yǎng)雖可獲得大量愈傷組織，但愈傷組織分

15、化困難，白化苗顯著增加，所以采用很少。2、培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件中最主要的是溫度，實驗結(jié)果表明離體培養(yǎng)的花藥對溫度比較敏感，曼陀羅、小麥和油菜都是要求較高的植物，在3032下花粉胚的生成率或花粉誘導組織的誘導率較在2628下高得多。對大多數(shù)植物而言，培養(yǎng)室溫度控制在2830是適宜的，但隨著培養(yǎng)溫度的提高，水稻花粉愈傷組織分化白化苗的頻率也隨之增加，因此，培養(yǎng)溫度最好控制在2628。禾谷類植物的花藥培養(yǎng)，其花粉愈傷組織的誘導頻率黑暗下高于光照下。但當愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上之后，光照則有利于愈傷組織的分化和胚狀體的發(fā)育。當植株分化后，光照對再生植株的健壯生長則更為重要。至于光質(zhì)的研究很少，據(jù)報道，藍

16、光和紫光對芽的分化有促進作用，紅光有抑制曼陀羅花粉胚胎發(fā)生的效應。3植株的誘導和移栽、誘導：植株看可以通過兩種途徑產(chǎn)生，一是來自花粉愈傷組織，兩種發(fā)育方式所需要的外源激素的種類和濃度不同。在由花粉胚產(chǎn)生小植株的情況下，由于是從花藥囊中長出，因此往往莖葉細弱、根系不發(fā)達，很難直接移栽到土壤中，需要將幼苗移到合成培養(yǎng)基上以壯苗，然后移栽到盆中或苗床上，蓋上玻璃燒杯或塑料薄膜以保持一定的空氣濕度，有利于小苗的成活。在由花粉形成愈傷組織的情況下，應把愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上誘導形成根和芽。花粉愈傷組織的年齡顯著影響分化頻率，這在禾谷類植物中尤其顯著。愈傷組織及時轉(zhuǎn)移是誘導分化的關(guān)鍵。當然過早的移栽，

17、不利于愈傷組織的成活和生長。對于大多數(shù)植物而言，愈傷組織在分化培養(yǎng)基上生長1020天后，一般就可以看到芽的分化，然后在芽的基部長出不定根。有時芽的基部不能分化出不定根，或雖有根但苗太細弱，需要更換培養(yǎng)基進行壯苗培養(yǎng)。、移栽：移栽后的花粉植株能否成活和正常生長決定于栽培和管理措施。水稻性屬喜高溫，2530的溫度和較強的光照對于幼苗的成活和生長是必須的。玉米幼苗在20左右條件下生長，除保濕外，還必須有足夠的光照。而對于油菜和小麥等冬作物，宜控制在20以下，一旦花粉植株在夏秋高溫季節(jié)形成，可將幼苗放入35冰箱中貯存，待氣溫轉(zhuǎn)涼后，將幼苗取出照光使之轉(zhuǎn)綠，再轉(zhuǎn)入土中。 花粉的培養(yǎng)花粉具有單倍體和單細胞

18、兩個方面的特點，因為除了用作花粉培養(yǎng)深入研究以外，更是研究花粉細胞分化條件，胚胎發(fā)生和形態(tài)發(fā)生機理的較為理想的方法。建立花粉粒培養(yǎng)實驗系統(tǒng)，也可以為深入開展細胞工程，遺傳工程和分子生物學的研究提供技術(shù)基礎。 離體花粉粒在培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間以后，一些種如煙草，曼陀羅等就從花粉粒直接形成胚狀而發(fā)育成苗，而另一些種如茄子，馬鈴薯，水稻，小麥和大大麥等則由花粉粒分裂形成愈傷組織，然后再分化成苗。 一、花粉的分離 1、壓擠法將花粉置于液體培養(yǎng)基中，用平頭的玻璃棒反復擠壓花粉，擠出花粉后用鑷子將花藥空殼取出。此法的優(yōu)點是操作簡便，缺點是花粉中混有體細胞并且所得的懸浮液中花粉密度也不易控制。將經(jīng)預培育過的

19、花粉或從剛采下的花蕾或下花中取出的花藥放入小燒杯中 ，加入一定濃度的蔗糖溶液或甘露醇液，用注射器內(nèi)管輕壓研磨花藥擠出花粉，然后將得到的花粉與藥壁殘渣的混合液通過網(wǎng)篩（一定孔徑的不銹剛篩或尼龍布篩，孔徑應比花粉粒大10 左右）收集到離心管內(nèi)，于是大塊藥壁殘渣被留在網(wǎng)上,離心管中含有花粉與小塊藥壁殘渣。離心管經(jīng)500-1000轉(zhuǎn)每分鐘，花粉粒沉淀，小塊藥壁殘渣留在上清液中，棄去上清液，再重復加懸浮液離心洗滌兩次，最后再用培養(yǎng)液離心純化一次。2、漂浮法利用一些植物的花藥漂浮在液體培養(yǎng)基能自行開裂，脫落出花粉的特性建立了脫落花粉系列收集法。將花粉發(fā)育處于單核中，晚期的花藥，經(jīng)一定時間的低溫處理后，按每

20、升60-100枚的花藥密度接種在適宜的液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)一定天數(shù)后，漂浮的花粉自動裂開，花粉脫落在液體培養(yǎng)基中，其間轉(zhuǎn)移花藥到相同的新鮮液體培養(yǎng)基中 ，供再脫落，連續(xù)收集之用。合并收集脫落花粉懸浮液于離心管中，通過離心重復清洗兩次（1000轉(zhuǎn)/分鐘，1-2分鐘），再懸浮于液體培養(yǎng)基，用血球記數(shù)板記數(shù)，使花粉密度達1000000個/ml左右。此法操作簡便。3、磁拌法該法是將花粉接種于盛有培養(yǎng)液和滲透壓穩(wěn)定劑的三角瓶中,再放入一根磁棒,為提高其分離速度,可另加入幾顆玻璃珠,置于磁力攪拌儀上,低速轉(zhuǎn)至花藥呈透明。此法分離花粉比較徹底，但對花粉有不同程度的損傷。二、花粉培養(yǎng)法1、直接培養(yǎng)法從未經(jīng)任何預

21、培養(yǎng)或預處理的新鮮的花藥中分離花粉粒，直接接種到合成培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。這個方法在50年代就能誘導某些裸子植物如銀杏等的花粉形成愈傷組織，但在 很長時間里沒有取得進展。直到年才在普通煙草花粉直接培養(yǎng)上，經(jīng)胚狀體途徑獲得成功。其關(guān)鍵是取花粉處于二細胞階段的花藥在水中分離花粉粒，并在水中培養(yǎng)5-7天，再轉(zhuǎn)到加有20%蔗糖和5mol/L谷氨酰氨的培養(yǎng)，既可通過形成花粉胚而長成花粉植株。稍后在黃化煙草花粉直接培養(yǎng)上，40%花粉粒經(jīng)胚狀體途徑獲得植株成功。統(tǒng)計表明，花粉在水或無糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)存后活率高。含糖培養(yǎng)基基上培養(yǎng)存后活力迅速下降，此點可能是由于離體花粉不能獲得胚狀體發(fā)育的主要原因之一。更有可能是無

22、糖饑餓效應促進了存活的離體花粉發(fā)育途徑的改變。由蔓青的?；ǚ哿Ｅ囵B(yǎng)也能形成花粉胚并能發(fā)育成植株2、花藥經(jīng)預培養(yǎng)后分離的花粉培養(yǎng)有人采用花藥預培養(yǎng)的方法，將花藥在基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3-6天，然后取出花粉，經(jīng)離心沖洗后在液體培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)三周后可見到各個階段的花粉胚，4-5周后可發(fā)育成小植株。 第八章 植物組織培養(yǎng)技術(shù)一、基本概念植物組織培養(yǎng)是指在無菌條件下，將離體的植物器官(如根尖、莖尖、葉、花、未成熟的果實、種子等)、組織(如形成層、花藥組織、胚乳、皮層等)、細胞(如體細胞、生殖細胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質(zhì)體(如脫壁后仍具有生活力的原生質(zhì)體)，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，

23、給予適宜的培養(yǎng)條件，誘發(fā)產(chǎn)生愈傷組織，或潛伏芽等，或長成完整的植株，統(tǒng)稱為植物組織培養(yǎng)。由于是在試管內(nèi)培養(yǎng)，而且培養(yǎng)的是脫離植物母體的培養(yǎng)物，因此也稱離體培養(yǎng)和試管培養(yǎng)，根據(jù)外植體來源和培養(yǎng)對象的不同，又分為植株培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)、器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)等。二、培養(yǎng)方式 植物組織培養(yǎng)方式大致可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩類。 固體培養(yǎng)即將植物材料培養(yǎng)在加入一定量凝固劑的固體培養(yǎng)基上，最常用的凝固劑是瓊脂，其用量為6-10g/L，以不液化為原則（半固體）。用量太高，培養(yǎng)基過硬，培養(yǎng)材料感好，生長不好；用量太少，則培養(yǎng)基太軟，材料在培養(yǎng)基中不穩(wěn)定，甚至下沉，從而影響組織的呼吸。培養(yǎng)基的硬度還可能

24、受到所用瓊脂的質(zhì)量、培養(yǎng)基pH及無機鹽濃度的影響。固體培養(yǎng)基的優(yōu)點是簡便，只要具備培養(yǎng)室（箱）、接種室（箱）以及一般是實驗室的玻璃皿就可以開展工作。其缺點是被培養(yǎng)的材料只有一部分表面能與培養(yǎng)基接觸，因此與組織接觸處的營養(yǎng)物質(zhì)很快被吸收掉，而其他區(qū)域補充又來得較慢，形成了培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)濃度差異，影響組織的生長速率。液體培養(yǎng)即植物材料被培養(yǎng)在不加凝固劑的液體培養(yǎng)基中。液體培養(yǎng)基常用搖床或轉(zhuǎn)床來振動培養(yǎng)容器，振動速度一般為50-100次分。液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物是被培養(yǎng)基所包圍，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)分布均勻，不會出現(xiàn)濃度差異現(xiàn)象，同時培養(yǎng)物的供氧情況也得到改善，有利于它的代謝、生長。因此，在液體培養(yǎng)中，

25、培養(yǎng)物的生長速度要比固體培養(yǎng)快得多。三、培養(yǎng)基及配制（一）培養(yǎng)基的成分培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)中離體植物材料賴以生存、生長發(fā)育的基地。培養(yǎng)基的合適與否是培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。培養(yǎng)基的成分是根據(jù)被培養(yǎng)植物材料的生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)而設計的。目前在植物組織培養(yǎng)中所采用的培養(yǎng)基成分除水（用蒸餾水）外，一般包括以下五大類：1、無機營養(yǎng)物無機營養(yǎng)物主要由大量元素和微量元素兩部分組成，大量元素中，氮源通常有硝態(tài)氮或銨態(tài)氮，但在培養(yǎng)基中用硝態(tài)氮的較多，也有將硝態(tài)氮和銨態(tài)氮混合使用的。磷和硫則常用磷酸鹽和硫酸鹽來提供。鉀是培養(yǎng)基中主要的陽離子，在近代的培養(yǎng)基中，其數(shù)量有逐漸提高的趨勢。而鈣、鈉、鎂的需要則較

26、少。培養(yǎng)基所需的鈉和氯化物，由鈣鹽、磷酸鹽或微量營養(yǎng)物提供。微量元素包括碘、錳、鋅、鉬、銅、鈷和鐵。培養(yǎng)基中的鐵離子，大多以螯合鐵的形式存在，即FeSO4與Na2EDTA（螯合劑）的混合。2、碳源培養(yǎng)的植物組織或細胞，它們的光合作用較弱。因此，需要在培養(yǎng)基中附加一些碳水化合物以供需要。培養(yǎng)基中的碳水化合物通常是蔗糖。蔗糖除作為培養(yǎng)基內(nèi)的碳源和能源外，對維持培養(yǎng)基的滲透壓也起重要作用。3、維生素在培養(yǎng)基中加入維生素，常有利于外植體的發(fā)育。培養(yǎng)基中的維生素屬于B族維生素，其中效果最佳的有維生素B1、維生素B6、生物素、泛酸鈣和肌醇等。4、有機附加物包括人工合成或天然的有機附加物。最常用的有酪朊水解

27、物、酵母提取物、椰子汁及各種氨基酸等。另外，瓊脂也是最常用的有機附加物，它主要是作為培養(yǎng)基的支持物，使培養(yǎng)基呈固體狀態(tài)，以利于各種外植體的培養(yǎng)。5、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)常用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)大致包括以下三類：(1)植物生長素類。如吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）。(2)細胞分裂素。如玉米素（Zt）、6-芐基嘌呤（6-BA或BAP）和激動素（Kt）。(3)赤霉素。組織培養(yǎng)中使用的赤霉素只有一種，即赤霉酸（GA3）。（二）、幾種常用培養(yǎng)基的配方及其特點在長期的組織培養(yǎng)中，根據(jù)不同的植物材料和不同培養(yǎng)目的對各種營養(yǎng)成分的不同要求，人們已設計出不同的培養(yǎng)基（表）。不同培養(yǎng)基

28、的特點不盡相同，一般無機鹽的變化較大，在氮的運用上，有的只用硝酸鹽，也有硝酸鹽和銨鹽混用的。例如MS培養(yǎng)基是最廣泛應用的培養(yǎng)基。其內(nèi)無機鹽的用量較合適，足以滿足很多培養(yǎng)材料在營養(yǎng)和生理上的要求。一般情況下，不必加入蛋白質(zhì)水解物、酵母提取物等有機附加物。MS培養(yǎng)基中硝酸鹽、銨和鉀的含量比其他培養(yǎng)基高，這是它的明顯特點。LS培養(yǎng)基或稱為RM-1965培養(yǎng)基，實在MS培養(yǎng)基的基礎上修改而來的，只是去掉了甘氨酸、鹽酸吡哆酸、煙酸，硫胺素提高為.4mg/L。White培養(yǎng)基與MS培養(yǎng)基相比，則是一個具有較低濃度無機鹽的培養(yǎng)基。他的使用也較廣泛，在根培養(yǎng)、胚胎培養(yǎng)及木本植物的組織培養(yǎng)上效果較好。N6培養(yǎng)基

29、適用于禾谷類植物的花藥、花粉培養(yǎng)及某些植物的組織培養(yǎng)上。表幾種常用植物組織培養(yǎng)培養(yǎng)基配方（單位：mg/L）培養(yǎng)基化合物MS（1962）White(1963)B5(1968)N6(1974)KCl65MgSO4.7H2O370720250185NH4NO31650(NH4)2SO4134463KNO319008025002830CaCl2.2H2O370720250185KCl65Ca(NO3)2.4H2O300Na2SO4200NaH2PO4.H2O16.5150KI0.830.750.730.8H3BO36.21.531.6MnSO4.4H2O22.374.4MnSO4.H2O10ZnSO4

30、.7H2O321.5ZnSO4.4H2O8.6NaMoO4.2H2O0.250.25CuSO4.5H2O0.0250.025CoCl2.6H2O0.0250.025Na2-EDTA37.337.337.3FeSO4.7H2O27.827.827.8Fe(SO4)22.5肌醇100100煙酸0.50.510.5鹽酸硫胺素0.10.1101鹽酸吡哆素0.50.110.5甘氨酸232蔗糖30000200002000050000pH5.85.65.55.8近年來，培養(yǎng)基都傾向于采用高濃度的無機鹽。高濃度的無機鹽能較好地保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，又可由于離子濃度高，在配制、貯存和消毒過程中，即使某種成

31、分少有出入，也不至于影響培養(yǎng)基的離子平衡。 (三)培養(yǎng)基的配制方法1.制備母液為了避免每次配制培養(yǎng)基都要對幾十種化學藥品進行稱量，應該將培養(yǎng)基中的各種成分，按原量10倍、100倍或1000倍稱量，配成濃縮液，這種濃縮液叫做母液。這樣，每次配制培養(yǎng)基時，取其總量的1/10、1/100、1/1000，加以稀釋，即成培養(yǎng)液?，F(xiàn)將培養(yǎng)液中各類物質(zhì)制備母液的方法說明如下。(1)大量元素。大量元素包括硝酸銨等用量較大的幾種化合物。制備時，按表中排列的順序，以其10倍的用量，分別稱出并進行溶解，以后按順序混在一起，最后加蒸餾水，使其總量達到1升，此即大量元素母液。(2)微量元素。因用量少，為稱量方便和精確起

32、見，應配成100倍或1000倍的母液。配制時，每種化合物的量加大100倍或1000倍，逐次溶解并混在一起，制成微量元素母液。(3)鐵鹽。鐵鹽要單獨配制。由硫酸亞鐵(FeSO47H2O)5.57克和乙二胺四乙酸二鈉(Na2EDTA)7.45克溶于1升水中配成。每配1升培養(yǎng)基，加鐵鹽5毫升。(4)有機物質(zhì)。主要指氨基酸和維生素類物質(zhì)。它們都是分別稱量，分別配成所需的濃度(0.11.0毫克/毫升)，用時按培養(yǎng)基配方中要求的量分別加入。(5)植物激素。最常用的有生長素和細胞分裂素。這類物質(zhì)使用濃度很低，一般為0.0110毫克/升?？砂从昧康?00倍或1000倍配制母液，配制時要單個稱量，分別貯藏。配制

33、植物生長素時，應先按要求濃度稱好藥品，置于小燒杯或容量瓶中，用12毫升0.1N(克當量濃度)氫氧化鈉溶解，再加蒸餾水稀釋至所需濃度。配制細胞分裂素時，應先用少量0.5或1N的鹽酸溶解，然后加蒸餾水至所需量。以上各種混合液(母液)或單獨配制藥品，均應放入冰箱中保存，以免變質(zhì)、長霉。至于蔗糖、瓊脂等，可按配方中要求，隨稱隨用。2.配制培養(yǎng)基的具體操作根據(jù)配方要求，用量筒或移液管從每種母液中分別取出所需的用量，放入同一燒杯中，并用粗天平稱取蔗糖、瓊脂放在一邊備用。將中稱好的瓊脂加蒸餾水300400毫升，加熱并不斷攪拌，直至煮沸溶解呈透明狀，再停止加熱。將中所取的各種物質(zhì)(包括蔗糖)，加入煮好的瓊脂中

34、，再加水至1000毫升，攪拌均勻，配成培養(yǎng)基。用1N的氫氧化鈉或鹽酸，滴入中的培養(yǎng)基里，每次只滴幾滴，滴后攪拌均勻，并用pH試紙測其pH值，直到將培養(yǎng)基的pH值調(diào)到5.8。將配好的培養(yǎng)基，用漏斗分裝到三角瓶(或試管)中，并用棉塞塞緊瓶口，瓶壁寫上號碼。瓶中培養(yǎng)基的量約為容量的1/4或1/5。培養(yǎng)基的成分比較復雜，為避免配制時忙亂而將一些成分漏掉，可以準備一份配制培養(yǎng)基的成分單，將培養(yǎng)基的全部成分和用量填寫清楚。配制時，按表列內(nèi)容順序，按項按量稱取，就不會出現(xiàn)差錯。成分單的格式與內(nèi)容見表2。3.培養(yǎng)基的滅菌與保存培養(yǎng)基配制完畢后，應立即滅菌。培養(yǎng)基通常應在高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，120滅菌20分鐘。如

35、果沒有高壓蒸汽滅菌鍋，也可采用間歇滅菌法進行滅菌，即將培養(yǎng)基煮沸10分鐘，24小時后再煮沸20分鐘，如此連續(xù)滅菌三次，即可達到完全滅菌的目的。表MS培養(yǎng)基 成分 分子量 使用濃度 (mg/L) 大量元素 硝酸鉀 KNO3 101.11 1900 硝酸銨 NH4NO3 80.04 1650 磷酸二氫鉀 KH2PO4 136.09 170 硫酸鎂 MgSO4.7H2O 246.47 370 氯化鈣 CaCl2.2H2O 147.02 440 微量元素 碘化鉀 KI 166.01 0.83 硼酸 H3BO3 61.83 6.2 硫酸錳 MnSO4.4H2O 223.01 22.3 硫酸鋅 ZnSO4

36、.7 H2O 287.54 8.6 鉬酸鈉 Na2MoO4.2 H2O 241.95 0.25 硫酸銅 CuSO4.5 H2O 249.68 0.025 氯化鈷 CoCl2.6H2O237.93 0.025 鐵鹽 乙二胺四乙酸二鈉 Na2.EDTA 372.25 37.3 硫酸亞鐵 Fe2SO4.7H2O 278.03 27.8 有機成分 肌醇 100 甘氨酸 2 鹽酸硫胺素 VB1 0.1 鹽酸吡哆醇 VB6 0.5 煙酸 VB5 或 VPP 0.5 瓊脂 agar 7 g /L 蔗糖 sucrose 342.31 30g /L 經(jīng)過滅菌的培養(yǎng)基應置于10下保存，特別是含有生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)

37、基，在45低溫下保存要更好些。含吲哚乙酸或赤霉素的培養(yǎng)基，要在配制后的一周內(nèi)使用完，其它培養(yǎng)基最多也不應超過一個月。在多數(shù)情況下，應在消毒后兩周內(nèi)用完。四、無菌操作（一）、培養(yǎng)材料的消毒植物體表面常附有各種各樣的微生物，所以必須先將材料進行消毒。由于培養(yǎng)材料是活的植物組織，所以材料消毒的一個基本原則是既要把材料上附著的微生物殺死，又不要傷及材料，影響其生長。消毒劑的選擇、藥劑濃度和處理時間的長短要根據(jù)材料對消毒劑的敏感性來決定。一般采用消毒效果較好，而且在消毒后能夠很容易去掉的藥劑，例如用無菌水（即經(jīng)高壓滅菌的蒸餾水）沖洗幾次后可把大部分藥劑沖掉的或能自動分解變成毒性很低的物質(zhì)。目前常用的消毒

38、劑如次氯酸鈉，它能分解出有殺菌效果的氯氣，過后散失到空氣中。低濃度的氯化貢（升汞）溶液，消毒效果很好，缺點是不易除去殘留的汞，因此，消毒后必須用大量的無菌水反復沖洗。 材料的干凈與否，影響著消毒的效果，因此在消毒前一般需將材料先用蒸餾水充分沖洗干凈。較臟的材料要用中性肥皂水輕輕擦洗（注意勿損傷表皮細胞），再用清水反復沖洗。 對一些帶茸毛的材料，由于茸毛間有空氣，常使消毒液不易進浸入，影響消毒效果?？稍诓牧戏湃胂疽褐?，先在70%酒精中漂洗數(shù)秒鐘，這樣可使材料表面弄濕，從而使消毒液易于浸透材料，殺死微生物，而且酒精本身也是很好的消毒劑。材料消毒后放在無菌的培養(yǎng)皿中備用。（二）、無菌操作植物組織

39、培養(yǎng)中除了培養(yǎng)基及材料本身消毒不徹底引起污染外，還可在操作過程中引起污染。為了減少或免除這種污染，全部操作過程都必須嚴格做到無菌操作，為此，必須要在接種室（箱）中進行接種。近年來，大多采用超凈工作臺代替接種室（箱）。由于超凈工作臺有機動濾塵設備，使進入臺面的空氣凈化。接種前應先開機15分鐘，保證接種空間的空氣充分過濾消毒。接種前，工作人員的雙手必須剪去指甲及用肥皂仔細洗凈，再用70%酒精棉球擦拭，操作所用的用具和器皿，必須經(jīng)過滅菌處理。金屬用具（如刀、剪、鑷子等）先用70%棉球仔細擦拭，再在酒精燈火焰上滅菌，冷卻后使用。玻璃器皿用牛皮紙或廢紙包好置于高壓滅菌鍋中120滅菌20分鐘，也可在電熱烘

40、箱內(nèi)150干烘40分鐘或120干烘2小時滅菌。 接種時，要嚴格操作。例如在去掉培養(yǎng)容器上的橡皮筋和包紙時動作要輕，以免揚起帶真菌孢子的灰塵，致使接種操作空間污染。打開瓶塞時必須在近酒精燈火焰處，瓶子拿成斜角（瓶口低，底部高），最好瓶口在酒精燈火焰的上方，這樣可借助火焰上升的氣流阻止空氣中漂浮的孢子落入瓶內(nèi)。接種過程中注意切勿讓手或被手接觸過的器具部分碰到植物材料，同時禁止談話、咳嗽，以免呼吸排出的細菌引起污染。接種用的工具（刀、鑷子等）在使用中可能會從空氣、消毒不徹底的材料以及操作人員的身上等幾方面又重新受到污染，因此這些工具每使用一次后，最好在酒精燈的火焰上再燒灼滅菌，但必須冷卻后才能使用，

41、為此需備兩份同樣的工具，交替使用。 材料接種好后，將瓶口放在酒精燈火焰上轉(zhuǎn)動燒一遍，殺死留在瓶口的細菌。加蓋封口。五、植物組織培養(yǎng)的應用 （一）、在植物育種上的應用目前，國內(nèi)外把植物組織培養(yǎng)已普遍應用于作物育種，并在以下幾個方面取得了較大進展：1、單倍體育種單倍體植株往往不能結(jié)實，在培養(yǎng)中用秋水仙素處理，可使染色體加倍，成為純合二倍體植株，這種培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應用稱為單倍體育種。單倍體育種具有高速、高效率、基因型一次純合等優(yōu)點，因此，通過花藥或花粉培養(yǎng)的單倍體育種，已經(jīng)作為一種嶄新的育種手段問世，并已開始育成大面積種植的作物新品種。在單倍體育種方面，我國科學家做出了突出貢獻。1974年就育成

42、了世界上第一個作物新品種-單育1號煙草品種。隨后又育成了中花8號水稻和京花1號、京單92-2097小麥等面積栽培的作物新品種，還獲得了多種作物的大量花培新品系。河南省在花培育種方面卓有成效，培育出了花培28、花配2321、峽麥1號、豫麥1號、豫麥37號、花9、花特早、豫麥60號等優(yōu)良品種(系)，已累計推廣700多萬畝，在全國名列前茅。2、胚胎培養(yǎng)在植物種間雜交或遠緣雜交中，雜交不孕給遠緣雜交帶來了許多困難。而采用胚的早期離體培養(yǎng)可以使胚正常發(fā)育并成功地培養(yǎng)出雜交后代，可以通過無性系繁殖獲得數(shù)量較多、性狀一致的群體，胚培養(yǎng)已在50多個科屬中獲得成功。遠緣雜交中，可把未受精的胚珠分離出來，在試管內(nèi)

43、用異種花粉在胚珠上萌發(fā)受精，產(chǎn)生的雜種胚在試管中發(fā)育成完整植株，此法稱為“試管受精”。用胚乳培養(yǎng)可以獲得三倍體植株，為誘導形成三倍體植物開辟了一條新途徑。三倍體加倍后可得到六倍體，可育成多倍體新品種。3、細胞融合通過原生質(zhì)體融合，可部分克服有性雜交不親和性，而獲得體細胞雜種，從而創(chuàng)造新種或育成優(yōu)良品種，這是組織培養(yǎng)應用最誘人的一個方面，目前已獲得40余個種間、屬間、甚至科間的體細胞雜種、愈傷組織，有些還進而分化成苗。目前，采用原生質(zhì)體融合技術(shù)已經(jīng)能從不雜交的植物中如番茄和馬鈴薯、煙草和龍葵、芥菜等獲得屬間雜種，但這些雜種尚無實際應用價值。隨著原生質(zhì)體融合、選擇、培養(yǎng)技術(shù)的不斷成熟和發(fā)展，今后可

44、望獲得更多有一定應用價值的經(jīng)濟作物體細胞雜種及新品種。4、基因工程用基因工程的方法，把目標基因切割下來并通過載體使外來基因整合進植物的基因組是完全有可能的，這項研究如果獲得成功，將克服作物育種中的盲目性，而變成按人們的需要操縱作物的遺傳變異，育成優(yōu)良品種，目前這項研究剛剛起步，加上植物的遺傳背景比原核生物更為復雜，因此，要用基因工程實現(xiàn)作物改良，以增加產(chǎn)量和改善品質(zhì)，將是21世紀需要解決的一個問題。5、培養(yǎng)細胞突變體無論是愈傷組織培養(yǎng)還是細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)細胞均處在不斷分生狀態(tài)，容易受培養(yǎng)條件和外界壓力(如射線、化學物質(zhì)等)的影響而產(chǎn)生誘變，從中可以篩選出對人們有用的突變體，從而育成新品種。尤其對原來誘發(fā)突變較為困難、突變率較低的一些性狀，用細胞培養(yǎng)進行誘發(fā)、篩選和鑒定時，處理細胞數(shù)遠遠多于處理個體數(shù)，因此一些突變率極低的性狀有可能從中選擇出來。例如植物抗病蟲性、抗寒、耐鹽、抗除草劑毒性、生理生化變異等的誘發(fā)，為進一步篩選和