分子生物學(xué)檢驗(yàn)

1、第二章 臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)志物1. 分子生物標(biāo)志物：指可以反映機(jī)體生理，病理狀態(tài)的核酸、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物等生物分子，是生物標(biāo)志物的一種類型。2. 中心法那么：指遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再?gòu)腞NA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過(guò)程。也可以從DNA傳遞給DNA，即完成DNA的復(fù)制過(guò)程。這是所有有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的生物所遵循的法那么。在某些病毒中的RNA自我復(fù)制(如煙草花葉病毒等)和在某些病毒中能以RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄成DNA的過(guò)程(某些致癌病毒)是對(duì)中心法那么的補(bǔ)充。3. 基因組：是一個(gè)細(xì)胞或一種生物體的整套遺傳物質(zhì)，包括基因和非編碼DNA。4. 原核生物基因組特征：1原核生物基因組較小

2、：大小一般在106107堿基對(duì)之間；2原核生物的類核結(jié)構(gòu)：原核生物基因組DNA位于細(xì)胞中央的核區(qū)，沒(méi)有核膜將其與細(xì)胞質(zhì)隔開(kāi)在蛋白質(zhì)的協(xié)助下，以一定的形式盤曲，折疊包裝起來(lái)，形成類核；3原核生物的操縱子結(jié)構(gòu)：原核生物的結(jié)構(gòu)基因大多數(shù)按功能相關(guān)性成簇地串聯(lián)排列于染色體上。結(jié)構(gòu)基因同其上游的調(diào)控區(qū)以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，共同組成了一個(gè)基因表達(dá)單位，即操縱子結(jié)構(gòu)；4原核生物的結(jié)構(gòu)基因：原核生物的結(jié)構(gòu)基因中無(wú)內(nèi)含子成分，多數(shù)是單拷貝基因，基因與基因之間有重復(fù)序列存在；5具有編碼同工酶的基因：這類基因表達(dá)產(chǎn)物的功能相同，但基因結(jié)構(gòu)不完全相同；6含有可移動(dòng)DNA序列：可移動(dòng)的DNA序列通過(guò)不同的轉(zhuǎn)移方式發(fā)生

3、基因重組，改變生物體的遺傳性狀，使生物體更適應(yīng)環(huán)境的變化；5. 質(zhì)粒：指細(xì)菌細(xì)胞染色體以外，能獨(dú)立復(fù)制并穩(wěn)定遺傳的共價(jià)閉合環(huán)狀分子；6. 人類基因組包括細(xì)胞核內(nèi)的核基因組3X109bp和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的線粒體基因組16569bp，人類基因組中存在大量的非編碼序列和重復(fù)序列；7. 小衛(wèi)星DNA：由10100bp組成的重復(fù)單位重復(fù)幾十到幾百甚至幾千次，形成的15bp的短DNA，又稱可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)；8. 微衛(wèi)星DNA：核心序列為16bp，可以重復(fù)上百次，又稱短串聯(lián)重復(fù)；9. 多基因家族：指由某一祖先基因經(jīng)過(guò)重復(fù)和變異所產(chǎn)生的一組基因，在多基因家族中，某些成員并不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這些基因稱為假基因；

4、10. 多態(tài)性：當(dāng)某種變異相對(duì)常見(jiàn)，在群體中的頻率高于1%時(shí)，那么稱為多態(tài)性，頻率低于1%的變異稱為突變；錯(cuò)義突變，無(wú)義突變，RNA加工突變；11. 多態(tài)性類型：限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性；小衛(wèi)星和微衛(wèi)星多態(tài)性；單核苷酸多態(tài)性主要指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性；拷貝數(shù)多態(tài)性指基因組中較大的片段200bp2Mb發(fā)生了拷貝數(shù)的變化；12. DNA甲基化： 1定義：指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過(guò)程； 2作用位點(diǎn)：腺嘌呤的N6，胞嘌呤的N4，鳥(niǎo)嘌呤的N7，胞嘧啶的C5； 3作用機(jī)理：13. 微小RNA：是一類內(nèi)源性的具

5、有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約2025個(gè)核苷酸，在細(xì)胞內(nèi)主要發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控作用；14. 長(zhǎng)鏈非編碼RNA：長(zhǎng)度大于200bp的非編碼RNA；第四章：核酸雜交技術(shù)1. 融解溫度Tm：DNA的變性會(huì)在一個(gè)很狹窄的溫度范圍內(nèi)發(fā)生，這一溫度范圍的中點(diǎn)被稱為融解溫度；Tm值的大小取決于核酸分子的G-C含量。G-C堿基含量越高，Tm值越高；2. 變性：在一定條件下，雙螺旋之間氫鍵斷裂，雙螺旋解開(kāi)，DNA分子成為單鏈，形成無(wú)規(guī)那么線團(tuán)的過(guò)程；3. 復(fù)性：變性DNA只要消除變性條件，具有堿基互補(bǔ)區(qū)域的單鏈又可以重新結(jié)合形成雙鏈的過(guò)程；4. Southern印跡雜交：過(guò)程：1將待測(cè)定核酸分子通過(guò)一

6、定的方法轉(zhuǎn)移并結(jié)合到一定的固相支持物硝酸纖維素膜或尼龍膜上，即印跡；2固定于膜上的核酸同位素標(biāo)記的探針在一定的溫度和離子強(qiáng)度下退火，即分子雜交過(guò)程；原理：利用瓊脂糖凝膠電泳別離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反響顯色，從而檢測(cè)特定DNA分子的含量；特點(diǎn)：特異性和靈敏度高；5. Northern雜交靶核酸是RNA，Southern雜交靶核酸是DNA；第五章：核酸擴(kuò)增技術(shù)1. 聚合酶鏈反響技術(shù)PCR：由美國(guó)Cetus公司K.Mullis博士于1983

7、年建立，它是一個(gè)能在試管內(nèi)模仿細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制過(guò)程，也就是能在體外特異地?cái)U(kuò)增一段特定核酸序列的技術(shù)；2. PCR的根本原理：根據(jù)DNA半保存復(fù)制的機(jī)理和體外DNA分子于不同溫度下可變性，復(fù)性的性質(zhì)，通過(guò)人為控制體外合成系統(tǒng)的溫度，通過(guò)變性、退火、延伸三個(gè)步驟擴(kuò)增目的DNA片段；3. PCR的根本過(guò)程： 1變性：將被復(fù)制的DNA片段在高于其熔點(diǎn)溫度Tm的條件下9495加熱，使DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的氫鍵斷裂而解螺旋，形成兩條單鏈分子作為擴(kuò)增反響的模板，以便與引物結(jié)合； 2退火：將反響體系的溫度降低至引物的熔點(diǎn)溫度以下<Tm 5，以便使引物能與模板DNA序列互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈； 3延伸：將反響體系

8、的溫度升至72，此時(shí)反響體希按照模板鏈的序列以堿基互補(bǔ)配對(duì)的原那么依次把dNTP加至引物的3端，在Taq DNA聚合酶的存在下，雜交鏈不斷延伸，直至形成新的DNA雙鏈；4. 當(dāng)溫度升至其熔點(diǎn)溫度Tm時(shí)熒光量急劇下降而形成熔點(diǎn)曲線，其波峰所在溫度即代表被檢DNA分子的Tm值。Tm值的大小取決于DNA分子的長(zhǎng)度和其序列中G/C堿基含量；第六章：核酸實(shí)時(shí)定量檢測(cè)技術(shù)1. 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)：指在PCR反響體系中參加熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反響過(guò)程，最后通過(guò)相關(guān)數(shù)據(jù)分析方法對(duì)目的基因進(jìn)行定量分析的技術(shù)；2. 擴(kuò)增曲線：指在實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增過(guò)程中，對(duì)整個(gè)PCR反響擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了

9、實(shí)時(shí)的檢測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào)，隨著反響時(shí)間的進(jìn)行，檢測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條以循環(huán)數(shù)為橫坐標(biāo)，以PCR反響過(guò)程中實(shí)時(shí)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)所做的曲線；3. 熒光閾值：指在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在指數(shù)擴(kuò)增階段的任意位置上；4. 循環(huán)數(shù)：PCR擴(kuò)增過(guò)程中擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的熒光閾值所經(jīng)過(guò)的循環(huán)次數(shù)；5. 擴(kuò)增效率：指PCR反響一個(gè)循環(huán)后的產(chǎn)物增加量與這個(gè)循環(huán)的模板量的比值，其值在01之間；6. 7. 第七章：核酸序列分析1. 雙脫氧鏈終止法測(cè)序原理：ddNTP比普通的dNTP在3位置缺少一個(gè)羥基，可以通過(guò)其5三磷酸基因摻入到正在增長(zhǎng)的DNA

10、鏈中，但由于缺少3-OH，不能同后續(xù)的dNTP形成3，5-磷酸二酯鍵。因此，正在增長(zhǎng)的DNA鏈不在延伸，使這條鏈的延伸終止于這個(gè)異常的核苷酸處；2. 人類基因組測(cè)序的步驟：第八章：蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)1. 蛋白質(zhì)組：包括一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織或一個(gè)機(jī)體的基因所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)；2. 蛋白質(zhì)組學(xué)：以蛋白質(zhì)為研究對(duì)象，從整體水平揭示細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成、結(jié)構(gòu)、表達(dá)水平和修飾狀態(tài)，研究蛋白質(zhì)間，蛋白質(zhì)與生物大分子之間的相互作用，揭示蛋白質(zhì)的功能與生命活動(dòng)的規(guī)律；3. 雙向凝膠電泳：第一向電泳是依據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同，通過(guò)等電聚焦將帶不同凈電荷的蛋白質(zhì)在PH梯度介質(zhì)中外加電場(chǎng)作用形成別離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。第一

11、向等電聚焦完成后，將凝膠包埋在SDSPAGE凝膠板上端，依據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同，在垂直或水平方向進(jìn)行SDSPAGE，即第二次別離；4. 雙向凝膠電泳用于確定差異，質(zhì)譜法用于鑒別結(jié)構(gòu)；第十三章：?jiǎn)位蜻z傳病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)1. 單基因遺傳病分類：常染色體遺傳，X連鎖遺傳，Y連鎖遺傳；2. 在分析基因結(jié)構(gòu)的變化時(shí)，通常用DNA作為檢測(cè)材料；在檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平異常時(shí)在，將RNA作為檢測(cè)材料；當(dāng)基因較大時(shí)，突變區(qū)不甚明了時(shí)，也可直接從cDNA水平開(kāi)始進(jìn)行篩檢；3. 鐮刀細(xì)胞貧血的分子機(jī)制：患者由于珠蛋白基因中第6位密碼子存在單個(gè)堿基的突變，由原來(lái)的GAG變?yōu)镚TG，結(jié)果使珠蛋白鏈的第6位氨基酸殘基由原來(lái)的谷氨酸變?yōu)槔i氨酸，紅細(xì)胞發(fā)生鐮狀；4. 珠蛋白生成障礙性貧血的分子機(jī)制：第十五章：線粒體病的分子生物學(xué)檢驗(yàn)：1 母系遺傳：在一個(gè)家系中，有缺陷的遺傳性狀通過(guò)母系成員從親代連續(xù)穩(wěn)定傳遞到子代的現(xiàn)象，即母親可以將有缺陷的遺傳性狀傳遞給子代，男性子代個(gè)體不再繼續(xù)傳遞，而女性子代個(gè)體可繼續(xù)將此有缺陷的遺傳性狀往下一代傳遞；2 遺傳早發(fā)：指越是嚴(yán)重的線粒體功能異常，其個(gè)體發(fā)病的年齡也將越早；3 遺傳瓶頸：線粒體在卵母細(xì)胞成熟時(shí)數(shù)目會(huì)出現(xiàn)銳減的現(xiàn)象；4 線粒體基因表達(dá)系統(tǒng)及特點(diǎn)：第十六章：腫瘤的分子生物學(xué)檢驗(yàn)1. 原癌基因：指人類或其他動(dòng)物細(xì)胞固有的一類