甲烷單加氧酶的研究進(jìn)展

1、甲烷單加氧酶催化機(jī)理的研究進(jìn)展摘 要：甲烷單加氧酶是甲烷營養(yǎng)細(xì)菌代謝過程中的重要酶系，同時(shí)也是一類能夠很好地催化底物分子單加氧反應(yīng)的生物催化劑，在工業(yè)應(yīng)用、醫(yī)藥和環(huán)境治理方面有著廣泛的應(yīng)用前景。文章綜述了近年來在甲烷單加氧酶催化機(jī)理方面的研究，著重闡述了含非血紅素雙鐵核的結(jié)構(gòu)及活化氧分子和底物的機(jī)理。關(guān)鍵詞：甲烷單加氧酶；活性中心；催化機(jī)理加氧酶：催化分于氧的氧原子與底物結(jié)合的氧化反應(yīng)酶的總稱，屬于氧化還原酶類。梅森等（HSMason et al，1955）用18O2示蹤，根據(jù)18O結(jié)合于其氧化生成物而發(fā)現(xiàn)的，可分成氧分子的雙原子氧與底物結(jié)合的加二氧酶（dioxygenase）和僅結(jié)合一原子氧

2、，且必需有對另一原子氧的氫供體（NADPH等）的單加氧酶（monooxygenase）。后者亦稱混合功能加氧酶（mixedfunction oxygenase）或羥化酶。甲烷單加氧酶：甲烷單加氧酶（methane monooxygenase，MMO）是一類含有雙核鐵活性中心的非血紅素蛋白酶1，是甲烷營養(yǎng)細(xì)菌（methanotrophic bacteria）代謝過程中產(chǎn)生的重要酶系，也是自然界中為數(shù)不多的能夠同時(shí)活化分子氧和小分子烴的酶系之一2-4。MMO 能斷裂非常穩(wěn)定的C-H 鍵，將分子氧中的一個(gè)氧原子插入C-H 中，另一個(gè)氧原子則生成水。反應(yīng)過程見下式： CH4 + NADH + H O2

3、 CH3OH + NAD H2O MMO 催化烷烴發(fā)生單加氧反應(yīng)生成相應(yīng)的醇的過程與其他單加氧酶如細(xì)胞色素P450很類似，但在所有的單加氧酶中，只有MMO 能催化非常穩(wěn)定的甲烷有效氧化生成甲醇，而這個(gè)反應(yīng)在催化化學(xué)上是難以實(shí)現(xiàn)的。甲醇作為一種清潔的汽油替代品，是C1 化學(xué)重要的原料。目前，天然氣作為甲烷的主要來源，一般是通過水蒸氣重整法制成合成氣，然后再進(jìn)一步深度開發(fā)。此法存在投資大、設(shè)備復(fù)雜、能耗高、選擇性差的缺點(diǎn)，且產(chǎn)品不宜直接用來合成甲醇和其他烴類5。如果能夠使用酶直接催化甲烷生成甲醇，就具有速度快、選擇性高、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，對于深度開發(fā)天然氣資源，解決世界能源危機(jī)有著深遠(yuǎn)的影響。除了催

4、化甲烷進(jìn)行單加氧反應(yīng)外，MMO 還有著非常廣泛的底物譜，包括：C8 以下的飽和的、不飽和的、線狀的、分枝的、芳香族的、環(huán)狀的和鹵化的烴類。反應(yīng)生成的產(chǎn)物有：醇類、環(huán)氧化物、苯酚等6。其中MMO 催化烯烴進(jìn)行環(huán)氧化反應(yīng)生成環(huán)氧化物是化學(xué)合成制藥工業(yè)的重要中間體，催化鹵代烴類和芳烴類的氧化在環(huán)境污染的控制中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前研究表明，MMO 還能降解污水中的致癌物質(zhì)N-亞硝基二甲胺7。MMO 的這些特性使其受到了極大地關(guān)注，對其催化機(jī)理的研究也成了國際上引人注目的前沿領(lǐng)域。1.MMO簡介：在甲烷營養(yǎng)細(xì)菌中，存在可溶性甲烷單加氧酶（soluble MMO，sMMO）和顆粒性甲烷單加氧酶（par

5、ticulate MMO，pMMO）?；旧纤械募淄闋I養(yǎng)菌中都含有pMMO，一般存在于細(xì)胞膜上，但是由于pMMO 難以純化和不穩(wěn)定性，目前對其了解還不多。目前研究得比較深入的是來源于Methylococcus capsulatus（Bath）和Methylosinus trichosprium OB3b 兩個(gè)菌株的sMMO。sMMO 是一種三組分的復(fù)合酶體系。三組分蛋白分別是羥基化酶MMOH，還原酶MMOR 和蛋白調(diào)節(jié)酶MMOB。雙核鐵活性中心一般以三種形式存在，氧化態(tài)：FeIIIFeIII，混合態(tài)：FeIIIFeII 和還原態(tài)：FeIIFeII 2。氧化態(tài)和還原態(tài)的MMOH 的結(jié)構(gòu)如圖1

6、所示。由圖1 可以看出，氧化態(tài)的MMOH的兩個(gè)FeIII 是通過1 個(gè)羥基、1 個(gè)雙齒的谷氨酸和1 個(gè)水分子的外源橋構(gòu)成的三重橋彼此聯(lián)接。還原態(tài)的MMOH 中兩個(gè)FeIII 少一個(gè)羥基橋。MMOH 中的鐵離子是以-氧橋連接的雙鐵金屬簇的形式存在。還原態(tài)和混合態(tài)的MMOH 能與底物、分子氧結(jié)合，并使之活化，如還原態(tài)的MMOH 單獨(dú)存在時(shí)能夠催化丙烯的環(huán)氧化反應(yīng)8。在催化過程中，MMOH 被不斷地氧化，當(dāng)其完全轉(zhuǎn)化為氧化態(tài)后就不再有催化活性，只有得到MMOR 輔助，才能使之還原恢復(fù)活性。2 MMO的作用機(jī)理 ：對 MMO 結(jié)構(gòu)的了解，給深入研究MMO 的催化機(jī)制提供了良好的開端。MMO 的催化反應(yīng)

7、過程中，三個(gè)亞基的作用是不同的， MMOH是 MMO的催化活性單元；MMOR 接受 NADH 的電子，并將電子傳遞到 MMOH；MMOB 在 MMOH和 MMOR 之間的電子傳遞中起到調(diào)節(jié)作用； 而 NADH 在催化過程中作為 MMO的電子給體，每轉(zhuǎn)化一分子底物需要消耗一分子 NADH9。2.1 MMOH 的催化機(jī)理：如圖2 所示，MMOH中含有的氧化態(tài)雙核鐵活性中心在催化反應(yīng)過程中首先接受NADH的兩個(gè)電子成為還原態(tài)，然后還原態(tài)MMOH 與氧分子反應(yīng)，經(jīng)過兩個(gè)中間體O、P（過氧橋連MMOH），最終形成FeIV 雙核鐵簇Q。中間體Q 與底物分子結(jié)合，經(jīng)過中間體R、T，釋放出產(chǎn)物并重新回到MMO

8、H 的氧化態(tài)。目前對MMOH 催化反應(yīng)機(jī)理的研究主要集中在兩個(gè)方面：(1)分子氧的活化；(2)烷烴的活化。2.1.1 分子氧的活化機(jī)理 分子氧活化是指在反應(yīng)過程中， 中間體 P轉(zhuǎn)化到中間體 Q的過程中 O-O鍵的斷裂方式。關(guān)于其斷裂方式的爭論目前主要集中在均裂反應(yīng)（homolytic cleavage）和異裂反應(yīng)（heteroliytic cleavage）兩種。 （1）分子氧的異裂機(jī)制 Lee等18在對來源于M. trichosprium OB3b中sMMO的動力學(xué)研究基礎(chǔ)上提出了分子氧異裂的理論。通過對 pH效應(yīng)和質(zhì)子總量的研究表明，在催化反應(yīng)過程中需要兩個(gè)質(zhì)子。氧分子先與雙鐵核中心形成一

9、個(gè)過氧橋，形成中間體 P，此時(shí)加入一個(gè)質(zhì)子，使其中一個(gè)氧原子質(zhì)子化形成單齒的過氧化態(tài)中間體 TS1。另一個(gè)質(zhì)子作用于中間體 TS1 向 Q轉(zhuǎn)換過程中，使 O-O 鍵發(fā)生異裂，形成高價(jià)態(tài)雙核鐵簇。此時(shí)，一個(gè)氧原子作為雙核鐵中心的氧橋，另一個(gè)氧原子形成了水，過程如式所示：（2）分子氧的均裂機(jī)制 均裂機(jī)制大部分的理論，主要是利用理論化學(xué)的方法對中間體 P 和中間體 Q 模型化合物及其相互間轉(zhuǎn)化的研究。但在不同的計(jì)算方法中 P有著不同的結(jié)構(gòu)，均裂機(jī)制的過程見式：與異裂機(jī)制不同的是，在分子氧均裂機(jī)制中，由分子氧衍生的O-O 鍵都保留下來作為中間體Q 的氧橋，形成水分子的氧原子是由雙鐵中心原來保留的橋連氧

10、原子形成的。 烷烴 C-H的活化機(jī)理MMO催化氧化反應(yīng)的分子機(jī)制研究的第二個(gè)重點(diǎn)是烷烴 C-H鍵的活化， 目前有兩種主要的機(jī)制：自由基回彈機(jī)制（radical rebound mechanism）和協(xié)調(diào)的氧插入機(jī)制（concert insertion of an oxygen atom） 。 （1）自由基回彈機(jī)制 自由基回彈機(jī)制最早由Lipsomb等人提出，Rabion等10也通過理論計(jì)算驗(yàn)證了此機(jī)制。據(jù)推測，中間體Q的進(jìn)一步活化形成不對稱的FeIIIFeIV-氧基自由基。這種自由基從烷烴中奪取一個(gè)氫形成FeIIIFeIV-羥基自由基，生成的甲基自由基迅速與四價(jià)鐵中心重組，形成弱的Fe-C鍵。

11、Basch，Lippard，Yazunari等最近用理論研究說明了奪取氫原子的反應(yīng)機(jī)理，從而驗(yàn)證自由基回彈機(jī)制。過程見式：（2）協(xié)調(diào)的氧插入機(jī)制協(xié)調(diào)的氧插入機(jī)制（又稱協(xié)調(diào)的無自由基機(jī)制，concert non-radical mechanism）是由Newcomb等11運(yùn)用甲基立方烷烴作為自由基探針來研究M.capsilalus Bath菌的sMMO后提出的Yoshizawa 等19認(rèn)為甲烷首先和 FeIV配位形成一種五價(jià)碳中心，隨后通過兩步協(xié)調(diào)的氫和甲基轉(zhuǎn)變形成甲醇。過程見式：2.2 MMOB 的作用機(jī)理MMOB 的作用是影響 MMOH和 MMOR 之間的電子傳遞過程。不同的光學(xué)研究方法表明

12、，MMOB 通過靠近 MMOH 的雙核鐵中心，將活性中心結(jié)構(gòu)進(jìn)行輕微的改變從而影響MMOH催化反應(yīng)的速率、區(qū)域選擇性及其氧化還原的能力12。然而 MMOB 作為一個(gè)微小的輔因子如何進(jìn)行調(diào)節(jié) MMO的催化的過程尚不清楚。2.3 MMOR 的催化機(jī)理及電子傳遞過程MMOR 含有一個(gè)Fe2-S2簇和一個(gè) FAD 輔因子，它們的作用是傳遞電子13。上式說明了這個(gè)電子傳遞過程。 NADH 首先和 MMOR 中的 FAD發(fā)生作用，F(xiàn)AD 接受 NADH 的電子，形成了電荷轉(zhuǎn)移（charge-transfer）中間體 CT1，位于 NADH 的煙酰胺分子和 FAD的異咯嗪環(huán)中間。當(dāng)氫離子由 NADH 轉(zhuǎn)移到

13、 FAD 時(shí)，就形成了第二個(gè)電荷轉(zhuǎn)移中間體 CT2。它比 CT1 要活潑，釋放 NAD+同時(shí)將電子從 FADH轉(zhuǎn)移到Fe2-S2ox，再由 FAD還原Fe2-S2中心。這個(gè)單電子轉(zhuǎn)移的步驟產(chǎn)生了黃素半醌和Fe2-S2red 。最后由還原態(tài)的Fe2-S2將電子傳遞給 MMOH 的雙核鐵中心。其電子傳遞鏈為：3結(jié)論與展望：總之，近年來在 MMO的研究方面取得了很大的進(jìn)展，通過動力學(xué)、理論化學(xué)和光譜動力學(xué)等方法，MMO 的催化機(jī)理正被逐步深入了解。MMO 催化反應(yīng)高效、條件溫和、無污染，催化烷烴的羥基化、烯烴的環(huán)氧化和鹵代烴、芳烴的降解反應(yīng)使得 MMO在工業(yè)應(yīng)用、醫(yī)藥和環(huán)境治理上有著廣泛的應(yīng)用前景。

14、只有更加清晰的了解 MMO的催化機(jī)制，才能盡快地使 MMO得到應(yīng)用， 造福人類。 然而目前存在影響 MMO進(jìn)行工業(yè)應(yīng)用的問題主要有： （1）MMO 需要輔酶如 NADH 作為反應(yīng)過程中氫或電子的傳遞體，而輔酶價(jià)格昂貴且不穩(wěn)定，將成為工業(yè)應(yīng)用中的瓶頸因素。 （2）菌種的來源不同，酶的催化機(jī)理可能不同目前還沒有統(tǒng)一的機(jī)理來解釋 MMO的反應(yīng)過程。因此，對 MMO的催化機(jī)理的研究有待深入。同時(shí)，MMO催化過程中輔酶的循環(huán)問題還有待解決。 目前，對 MMO 進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬的模型化合物層出不窮14。模型化合物具有結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定性強(qiáng)，機(jī)理研究容易， 反應(yīng)過程中不需要輔酶等優(yōu)點(diǎn)，為進(jìn)一步了解 MMO和進(jìn)行MM

15、O工業(yè)應(yīng)用指出了一條新的道路。未來所面臨的挑戰(zhàn)就是解決 MMO的工業(yè)應(yīng)用問題，以及利用 MMO的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制合成一些功能型的模型化合物替代 MMO，從而展開工業(yè)應(yīng)用。參考文獻(xiàn)： 1 RYLE M J, HAUSINGER R P. Non-heme iron oxygenases J. Curr Opin Chem Biol, 2002, 6(2):193-201. 2 MERKX M, KOPP D A, SAZINSKY M H, et al. Dioxygen activation and methane hydroxylation by solublemethane monooxyg

16、enase: a tale of two irons and three proteins J. Angew Chem Int Edit, 2001, 40(15): 2782-2807. 3 WALLAR B J, LIPSCOMB J D. Dioxygen activation by enzymes containing binuclear non-heme iron clusters J. Chem Rev, 1996, 96(7): 2625-2657. 4 FEIG A L, LIPPARD S J. Reactions of non-heme iron (II) centers

17、with dioxygen in biology and chemistry J. Chem Rev, 1994, 94(3): 759-805. 5 AYALA M, TORRES E. Enzymatic activation of alkanes: constraints and prospective J. Appl Catal A-Gen, 2004, 272(1-2): 1-13. 6 FOX B G, JAMES G, BORNEMAN D J, et al. Haloalkene oxidation by the soluble methane monooxygenase fr

18、om methylosinus trichosporium OB3b: mechanistic and environmental implications J. Biochemistry, 1990, 29(27): 6419- 6427. 7 SHARP J O, WOODT K, ALVAREZ-COHEN L. Aerobic biodegradation of N-nitrosodimethylamine (NDMA) by axenic bacterial strains J. Biotechnol Bioeng, 2005, 89(5): 608-618. 8 SOLOMON E

19、 I, BRUNOLD T C, DAVIS M I, et al. Geometric and electronic structure/function correlations in non-Heme iron enzymes J. Chem Rev, 2000, 100(1): 235-350.9 NGUYEN H H H, NAKAGANWA K H, HEDMAN B, et al. X-ray absorption and EPR studies on the copper ions associated with the particulate methane monooxyg

20、enase from Methylococcus capsulatus (Bath). Cu(I) ions and their implications J. J Am Chem Soc, 1996, 118(11): 12766-12776. 10 ROSENWEIG A C, FREDERICK C A, LIPPARD S J, et al. Crystal structure of a bacterial non-haem iron hydroxylase. Nature, 1993, 366(6455): 537-543. 11 ROSENWEIG A C, LIPPARD S J, FREDERICK C A. Determining the structure of a hydroxylase enzyme that catalyzes the conversion of methane to methanol in methanotrophic bacteria J. Acc Chem Res, 1994, 27(8): 229-236. 12 LIU