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文檔簡介
1、第二節(jié)真核生物基因組DNA序列的復雜度一、重復序列的檢測真核生物基因組DNA C值的巨大差異提出了一個重要的問題,是否C值愈大的物種就含有更多的基因?還是基因數(shù)目并未增加而是含有大量不編碼蛋白質的重復序列DNA?如果是基因數(shù)目隨著C值大小而增加,那么編碼這些結構基因的單一DNA序列的數(shù)量也應隨之增加,相反如基因組中DNA含大量不編碼的重復序列,那么基因的數(shù)目就不一定與C值成比例增加。為此可通過復性動力學來檢測基因組DNA序列的復雜性(sequence complesity of DNA poputation)。也就是通過DNA的變性(denaturation)和復性(renaturation)
2、反應的動力學過程分析DNA序列的性質,由于復性的速率取決于互補的DNA序列之間的隨機碰撞,所以DNA復性是一個雙分子二級反應。單鏈消失速度其中:C為單鏈DNA的濃度(單位是每升的核苷酸摩爾數(shù));t為時間(單位為s);k為重組速率常數(shù)(單位是Lmol·s),k取決于陽離子濃度、溫度、片段大小和DNA序列的復雜性。當t=0時,CC0,表明所有DNA都是單鏈,C0為DNA總濃度。復性的分數(shù)CC0是起始濃度和經(jīng)過時間的乘積C0t的函數(shù),這樣的函數(shù)繪成圖稱為C0t曲線(圖7-3)。從方程式可見控制復性反應的參數(shù)是C0t,如當tt1/2時,即如果基因組中每一種基因只有一個,即都是單拷貝序列,那么
3、基因組愈大則基因組的復雜性愈大,復性速率愈小,k也愈小,所以C0t1/2與非重復序列的基因組大小呈正比。即圖6-3表明,C0t1/2與基因組的大小成正比。其中polyUpolyA,其kC0t1/2=1個核苷酸對,因而復性最快;MS2是RNA噬菌體,T4為DNA噬菌體,每個基因組的大小用箭頭標于圖的上方。二、DNA序列的類別不同生物基因組的C0t1/2是不相同的,C0t1/2的位置除了決定于基因組的大小以外,還取決于每個基因的核苷酸序列的重復次數(shù),重復次數(shù)愈少則復性愈慢,C0t1/2的位置愈后,重復次數(shù)愈多,C0t1/2位置愈前。真核生物基因組的復性曲線往往出現(xiàn)兩個或3個明顯不同的C0t1/2位
4、置,說明這類基因組中包含著重復次數(shù)顯然不同的幾個成分(圖7-4),該圖是假設的一個真核生物基因組復性曲線。從上圖可以看出,最后復性這部分DNA的C0t1/2630,它占全部DNA的45,相當于3.0×108bp,重復頻率為1;中間這部分DNA的C0t1/2=1.4,占全部DNA的30,相當于60×105bp,該DNA序列重復頻率為350;復性最快部分DNA的C0t1/20.0013,占基因組DNA的25,相當于340bp,重復頻率為5×105。顯然第一部分,即復性最慢的部分是單拷貝DNA序列,第二部分為少量重復或中度重復DNA序列,第三部分為高度重復DNA序列。因
5、此真核生物基因組序列大致可分為許多類型。(一)單拷貝序列(unique sequence)亦稱非重復序列(nonrepetitive sequence)在一個基因組中只有一個拷貝或2-3個拷貝。真核生物的大多數(shù)基因在單倍體中都是單拷貝的。不同生物基因組中單拷貝序列所占的比例是不同的(圖7-5)。原核生物中一般只含有非重復序列,較低等的真核生物中大部分DNA也是單拷貝的。動物細胞基因組中將近50DNA是中度或高度重復的,特別是植物和兩棲類生物中單拷貝DNA序列降低,而中度和高度重復序列增加。從圖中還可看出,隨著生物的基因組大小的增加,非重復DNA片段長度也隨之增加,通常單拷貝序列比較短,只有10
6、00bp左右,故所占的DNA的百分比也很低。兩棲類和植物基因組C值的增加并非是單拷貝序列的增加,而是重復序列DNA比例的增加。非重復DNA很少達到2×109bp的。由此可見,非重復DNA含量和生物的相對復雜程度是一致的。而且大多數(shù)結構基因是位于基因組的非重復DNA序列之中。單拷貝的基因編碼許多重要的蛋白質,例如,絲心蛋白單拷貝基因能夠合成高達104的mRNA分子,每個mRNA分子又可合成出105個蛋白質分子,這充說明單拷貝基因的高度表達能力。當然也不是所有的單拷貝序列都是編碼多肽鏈的結構基因,因為真核生物基因組中編碼的序列不過只有百分之幾。(二)中度重復序列(moderately r
7、epetitive sequence)中度重復序列中的重復單位平均長度約300bp,重復次數(shù)為10102,人的珠蛋白(紅血蛋白)基因屬于這種少量重復序列,人的珠蛋白基因中除了包括已確定的8個珠蛋白功能基因和3個珠蛋白假基因外,還有一個近年發(fā)現(xiàn)的基因。假基因也屬于少量重復序列。另一類中度重復序列的重復次數(shù)為103105,該序列常以回文序列方式出現(xiàn)在基因組的許多位置上,一些回文序列中間間隔著單拷貝序列,另一些中間不存在單拷貝序列,所以經(jīng)變性復性后,前者可觀察到莖-環(huán)結構,后者則形成發(fā)夾圖像(圖7-6)。中度重復序列一般是不編碼的序列,這種重復序列和非重復序列一樣都不是一個長序列,它們都要被其他組分
8、所隔斷。(三)高度重復序列(highly repetitive sequence)顧名思義,高度重復序列就是在基因組中存在大量拷貝的序列,一般重復次數(shù)在106以上。通常這些序列的長度為6200bp,如衛(wèi)星DNA。這些重復序列大部分集中在異染色質區(qū),特別是在著絲粒和端粒附近。高度重復序列中常有一些AT含量很高的簡單串聯(lián)重復序列。因序列簡單,缺乏轉錄所必需的啟動子,故沒有轉錄能力。然而DNA復制能力卻和單一序列復制得一樣快。大多數(shù)高等真核生物DNA都有20以上的高度重復序列,而且數(shù)目變化很大,這類序列的多少對C值的影響可能最大。一般認為大多數(shù)重復序列是過剩的DNA,但其中某些重復序列具有特殊的功能
9、,如調節(jié)基因的表達,增強同源染色體之間的配對和重組,維持染色體結構的穩(wěn)定性,調節(jié)mRNA前體的加工過程,參與DNA復制等,此外重復序列還可能是進化的源泉之一。但是,重復序列的確切生物學意義尚有待闡明。三、衛(wèi)星DNA衛(wèi)星DNA(satellite DNA)是一類高度重復的DNA序列。各種DNA在氯化銫梯度離心中,平衡時的浮力密度決定于它的GC含量,GC含量越高,浮力密度越大。真核生物的DNA一般含有3050GC含量,在DNA的不同區(qū)段,GC含量約相差10。對一個物種來說,當基因組DNA切斷成數(shù)百個堿基對的片段進行超離心時,其浮力密度曲線是覆蓋一定浮力密度范圍的一條寬帶,但是有些DNA片段都含有異
10、常高或低的GC含量,常在主要DNA帶的前面或后面有一個次要的DNA帶相伴隨,這些小的區(qū)帶就像衛(wèi)星一樣圍繞著DNA主帶,故稱衛(wèi)星DNA。有的高度重復序列的堿基組成與基因組DNA總體的堿基組成差異不大,接近于平均值,因而并非所有的高度重復序列都能形成衛(wèi)星DNA。復性動力學鑒定發(fā)現(xiàn)高度重復的DNA與衛(wèi)星DNA一樣,具有串聯(lián)集中分布的特點。因此有時把這種高度重復序列稱為隱蔽衛(wèi)星DNA(cryptic satellite DNA)。衛(wèi)星DNA的重復單位長短不一,牛的衛(wèi)星DNA是1400bp,某些猴的衛(wèi)星DNA是172bp,蟹的衛(wèi)星DNA大部分是AT的重復序列,有時在30個左右的堿基對中才偶爾插入一個GC
11、對,因而AT含量達到97。果蠅(Dvirilis)有3條衛(wèi)星DNA區(qū)帶,也是多為AT對,并且還有一個隱蔽衛(wèi)星(表7-2)。Miklos 1985年的研究指出,果蠅Dnasutoides基因組的60由衛(wèi)星DNA構成,而它們?nèi)慷继幵?對染色體的一對最大的染色體上,而這對染色體看來幾乎不含別的DNA。根據(jù)衛(wèi)星DNA的浮力密度可以分成、4類,它們的浮力密度分別是1.687、1.693、1.647和1.700gcm3。衛(wèi)星DNA在染色體上的位置可以用放射性標記探針作DNA分子原位雜交(in situ hybri dization)來鑒定,發(fā)現(xiàn)4類衛(wèi)星DNA都能與人的各條染色體雜交,而且雜交的帶型也很相
12、似。說明這4類衛(wèi)星DNA也存在于人的染色體上,而且分布的狀況也相同。衛(wèi)星DNA分布于著絲粒附近的異染色質區(qū)。由于異染色質區(qū)是高度螺旋化的,DNA是不表達的。衛(wèi)星DNA在著絲粒處的集中分布可能與細胞分裂時染色體的運動有關。哺乳動物的衛(wèi)星DNA常常是多等級的,即一個大的重復單位是由若干個彼此相似的小重復單位串聯(lián)組成,每個小重復單位又由若干個彼此相似的更小的重復單位串聯(lián)組成。如小鼠衛(wèi)星DNA用限制性內(nèi)切酶EcoR切割,得到234240bp的一系列片段,序列分析發(fā)現(xiàn)其中234bp的帶在6070的衛(wèi)星DNA里都有這種序列。若將234bp的左、右各一半的各117bp排列起來進行比較,發(fā)現(xiàn)只有22個bp不同
13、,差異為19。說明234bp的重復單位是由117bp亞重復單位重復而來,由于突變而積累了差異。117bp的亞單位又可分成兩個58bp的14亞單位。4個58bp亞單位之間的差異達到40。58bp的亞單位又可分成兩個18的亞單位,其中之一是28bp(亞單位),另一部分是30bp(亞單位)。8個18亞單位之間的差異達61。如果再將18亞單位分成3個部分,每一部分都含有GAAAAACGT、GAAAAATGA、GAAAAAACT近似序列。由此推測小鼠的234bp高度重復序列可能是由一個9bp的祖先序列例如GAAAAATGT演化而來的。其演化原理可能是在某特定時刻由于某種原因使一個DNA序列橫向擴增產(chǎn)生多
14、個串聯(lián)重復單位,經(jīng)92758117234bp4輪的橫向擴增和突變積累過程,在這個過程中,使不同的重復單位失去同一性,也可能產(chǎn)生插入突變,致使現(xiàn)在的234bp的重復序列也并不完全相同。一般說衛(wèi)星DNA不受任何選擇壓的影響,因為它不編碼蛋白質或RNA,因而小鼠衛(wèi)星DNA各個拷貝的序列有相似性而不完全相同。然而有些衛(wèi)星DNA如節(jié)肢動物的衛(wèi)星DNA是由幾乎相同的重復單位組成的。值得注意的是在人的第17號染色體上串聯(lián)分布的U2snRNA基因有1020個拷貝。每個重復單位約6000bp,而其編碼序列卻只有188bp。選擇壓作用于編碼序列而使其保持相同,這是不言而喻的。難以理解的是其余5800bp的間隔序列為什么也會保持相同?雖然其中有100bp左右的轉錄起始、終止
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