實(shí)驗(yàn)中常用蛋白檢測方法VIP

1、.蛋白的檢測方法.Western Blot免疫熒光免疫熒光ELISA免疫組化免疫組化.Western Blot 原理：經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變）。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色、化學(xué)發(fā)光或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。 特點(diǎn)：組織、細(xì)胞來源均可；半定量. 原理：抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和

2、蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。 特點(diǎn)：是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和組織學(xué)技術(shù)（組織的取材、固定、包埋、切片、脫蠟、水化等），通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色，來對組織（細(xì)胞）內(nèi)抗原進(jìn)行定位、定性及定量的研究(主要是定位)。樣本是細(xì)胞或組織，要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。免疫組化/免疫熒光. 原理：酶聯(lián)免疫法，它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。 特點(diǎn)：免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測的樣品多是血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液，需將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，從而使后來形成的抗原-抗體-酶

3、-底物復(fù)合物粘附在載體上，這就是“吸附”的含義。ELISA.蛋白檢測方式蛋白檢測方式免疫組化法免疫組化法Western blotWestern blot法法ELISAELISA試劑盒法試劑盒法相同點(diǎn)相同點(diǎn)抗體-抗原結(jié)合反應(yīng)不同點(diǎn)不同點(diǎn)樣品類型樣品類型組織或細(xì)胞組織或細(xì)胞血清、血漿、尿液、細(xì)胞或組織培養(yǎng)上清液分析方式分析方式定位、定性及定量的研究(主要是定位，定位敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Western blot法)可以用于定性和半定量，定量較免疫組化法準(zhǔn)確多用于定量分析，其靈敏度非常高觀察結(jié)果觀察結(jié)果免疫組化圖（膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性）電泳圖（著色的位置和著色深度）蛋白濃度應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍組織標(biāo)本，細(xì)胞中

4、蛋白交互作用以及信號通路。檢測蛋白質(zhì)特性、表達(dá)的一種最常用的方法。組織、細(xì)胞。分泌性蛋白檢測3種蛋白檢測水平的比較種蛋白檢測水平的比較.蛋白的交互作用蛋白的交互作用.尋找目標(biāo)蛋白.驗(yàn)證兩蛋白間作用.驗(yàn)證蛋白交互作用方法經(jīng)典的方法有：經(jīng)典的方法有：CO-IPCO-IPGST-pulldownGST-pulldown酵母雙雜交系統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng).CO-IPCO-IP，又叫免疫共沉淀（，又叫免疫共沉淀（Co-ImmunoprecipitationCo-Immunoprecipitation）其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質(zhì)

5、X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)Z也能沉淀下來。目前多用proreinA預(yù)先結(jié)合固化在瓊脂糖微珠上，Protein A是一種金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁蛋白質(zhì)，能特異性地與人和哺乳動物抗體的Fc區(qū)結(jié)合，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，瓊脂糖微珠上的proreinA/G與抗體Fc特異性結(jié)合，由于抗體抗原特異性，沉淀蛋白X；溶液中有和蛋白X相互作用的物質(zhì)，就能沉淀下來。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。.Pull-down實(shí)驗(yàn) 跟免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)很像，不同的是免疫共沉淀是在細(xì)胞里進(jìn)行的，在眾多的蛋白里，拉住A蛋白的同時(shí),把B蛋白也給拉出來了，這還不能證明是直接的結(jié)合，很有可能是A 拉住了C，而C拉住了B，這樣拉住A蛋白的同時(shí)也能把B蛋白也給拉出來。要證明直接的結(jié)合就是Pull-down實(shí)驗(yàn)。提純所要研究的兩個(gè)蛋白（一般是在BL21等菌種表達(dá)提純），這兩個(gè)蛋白帶上不同的標(biāo)簽（提純蛋白一般帶GST或者HIIS標(biāo)簽），然后將他們放在同一個(gè)體系里，使用GST-beads或者NI-beads,把其中一個(gè)蛋白拉下來，用WB檢測另一個(gè)蛋白的存在。.研究某分子研究某分子A A在椎間盤退變中作用在椎間盤退變中作用椎間盤標(biāo)本 切片，HE，特殊染色 免疫組化 基質(zhì)、退變酶、目的