錳對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及半胱天冬酶表達(dá)影響

1、錳對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞及半胱天冬酶表達(dá)影響    【關(guān)鍵詞】  錳;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)摘要： 目的   探討錳對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-304細(xì)胞生長(zhǎng)周期及半胱天冬酶3(caspas3)、半胱天冬酶8(caspase8)表達(dá)的影響。方法   以100800moml/L)的氯化錳分別處理HUVEC-304細(xì)胞2472h后，四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)EVC-304細(xì)胞的生長(zhǎng)活性；流式細(xì)胞儀（FCM）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況；蛋白印跡法（

2、Western blot）檢測(cè)HUVEC-304細(xì)胞在，氯化錳半數(shù)抑制濃度(IC50)400mol/L作用24h時(shí)caspase8、caspase3的表達(dá)。結(jié)果   氯化錳可呈時(shí)間及劑量依賴性抑制HUVEC-304細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,抑制率為2234%9094%，凋亡率為1020%9873%。氯化錳24hIC50約為400mol/L，在此濃度下，HUVEC-304細(xì)胞caspase8、caspase3表達(dá)顯著增高,(P<005)。結(jié)論   氯化錳能夠抑制HUVEC-304細(xì)胞的增殖，呈明顯的時(shí)效和量效關(guān)系。caspase8、caspase3表

3、達(dá)增高在細(xì)胞增殖和凋亡中起重要的作用，可能是其作用機(jī)制之一。關(guān)鍵詞： 錳;人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞;凋亡;半胱天冬酶3(caspase3);半胱天冬酶8(caspase8)Effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and expression of caspase   Abstract： Objective   To investigate the effect of manganese on growth of HUVEC-304 cells and the expression of caspase8、

4、caspase3.Methods   HUVEC304 cells were given with various concentrations of MnCl2.The inhibitory ratio was measured by MTT assay.Apoptosis was observed by flow cytometry(FCM).The expression of caspase3 and caspase8 was measured by Western blot.Results   MTT results revealed that

5、manganese chloride (from 100 to 800mol/L) might suppress the proliferation of HUVEC-304 cells(inhibitory ratio were 22.34%90.94%) and induce apoptosis (apoptosis ratio were 10.20%98.73%) in dose and time-dependent manner.The result of Western Blot showed that manganese inhibited caspase3 and caspase

6、8 expression (P<0.05).Conclusion   Manganese can inhibit proliferation of HUVEC-304 cells with time-and dose-dependent manner.These may be one of important mechanisms that manganese suppressed the proliferation of HUVEC-304 cells and induced apoptosis.Key words： manganese;HUVEC-304 cell

7、s;apoptosis ;caspase3;caspase8      錳可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生不配對(duì)的電子自由基形成大量的過(guò)氧化物及影響細(xì)胞能量代謝等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮毒性作用1,2,但對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因半胱天冬酶8(caspase8)、半胱天冬酶3(caspase3)及蛋白產(chǎn)物的影響研究較少。本研究通過(guò)體外試驗(yàn)，觀察錳對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系HUVEC-304細(xì)胞生長(zhǎng)及caspase8、caspase3表達(dá)的影響，探討錳誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡分子機(jī)制。1   材料與方法11   主要試劑及抗體 

8、0; 氯化錳(天津博迪化工有限公司)，分子量1977,純度>99%,溶解于二甲基亞砜（DMSO），分裝備用。RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清025%的胰酶(中山凌飛公司)；四甲基偶氮噻唑藍(lán)(MTT,美國(guó)Sigma公司)。caspase3、caspase8一抗為鼠抗人，二抗為羊抗鼠(美國(guó)晶美生物工程有限公司)。12   方法   121   細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)   HUVEC-304細(xì)胞株(武漢大學(xué)細(xì)胞保藏中心)。在含有10%的胎牛血清、青霉素100u/ml及鏈霉素100mg/ml的RPMI

9、-1640培養(yǎng)基中37、5%CO2條件下傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)良好、細(xì)胞活性大于98%的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。122   細(xì)胞生長(zhǎng)活性檢測(cè)   采用MTT比色法，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC304細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將不同濃度的氯化錳100800mol/L加入10%胎牛血清（FCS）的RPMI-1640的培養(yǎng)基中，調(diào)細(xì)胞濃度為5×105/ml，接種于96孔，每種劑量濃度為一組，每個(gè)濃度3個(gè)平行孔，置37、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)不同時(shí)間（24，48，72h）后，每孔加20lMTT，培養(yǎng)4h，棄MTT，每孔加DMSO 150l，充分溶解。選擇490nm波長(zhǎng)，酶聯(lián)

10、免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值。HUVEC-304細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對(duì)照組平均A值）×100%。123   流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡   用熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V(Annexin-V-FITC)及碘化丙啶（PI）雙標(biāo)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，分為不同濃度實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組。分別加入終濃度為100800mol/L的氯化猛作用24h，用70%乙醇4固定2h，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液洗3次，離心去上清。用結(jié)合緩沖液37孵育60min，195l細(xì)胞懸液加5l Annexin-V-FITC，混勻，室溫10min。用緩沖液洗滌細(xì)胞1次

11、，在190l結(jié)合緩沖液中重懸，然后再加10l20g/mlPI，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。124   細(xì)胞蛋白質(zhì)樣品制備及蛋白定量   經(jīng)處理后的細(xì)胞立即棄去培養(yǎng)液,洗滌,離心,加預(yù)冷的細(xì)胞裂解液(01mol/LNaCl,001mol/LTrisHCl,pH76,0001mol/L乙二胺四醋酸（EDTA）,100g/ml蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF),2g/mL，亮肽素(Leupeptin) 01ml,裂解30min,然后于10000g離心10min,取上清備用。以上所有操作均在4下進(jìn)行。測(cè)定蛋白,并調(diào)各組蛋白濃度一致。125   蛋白印跡

12、法(WesternBlot)   Western Blot方法檢測(cè)caspase3、caspase8,X線曝光顯影,軟件進(jìn)行掃描定量,每個(gè)濃度組重復(fù)3次,取均值代表測(cè)定結(jié)果。13   統(tǒng)計(jì)分析   應(yīng)用SPSS110統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析(ANOVA)。百事通 2   結(jié)果21   錳對(duì)HUVEC-304細(xì)胞增殖的影響   錳對(duì)HUVEC-304細(xì)胞生長(zhǎng)呈時(shí)間劑量依賴性,錳染毒培養(yǎng)24，48，78h后，HUVEC-304細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為100mol/L(223

13、4±822)%，(2747±851)%，(3807±986)%；200mol/L(3362±969)%，(4256±095)%，(5935±236)%；400mol/L(5503±620)%，(6212±195)%，(6960±377)%；800mol/L(7606±151)%，(8129±154)%，(9094±128)%，各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001),24hIC50為400mol/L。22   錳誘導(dǎo)HUVEC-304細(xì)胞凋亡情況(表1

14、)   錳對(duì)HUVEC-304細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用,濃度為100mol/L MnCl2培養(yǎng)HUVEC-304細(xì)胞24h,即可引起細(xì)胞明顯凋亡,并隨氯化錳劑量的增加呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。表1   不同濃度氯化錳誘導(dǎo)HUVEC-304細(xì)胞的凋亡率（略）注：與對(duì)照比較，* P001；n=323   錳對(duì)HUVEC-304細(xì)胞caspase3、caspase8表達(dá)的影響   Western blot蛋白印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示,濃度為400mol/L氯化錳染毒培養(yǎng)HUVEC-30細(xì)胞24h后，caspase8和caspase3表達(dá)均

15、明顯升高,A值分別為(48803±216)，(47631±205),與對(duì)照組比較(9013±161)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<001)。3   討論caspase活性的變化是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。研究表明caspase是一切凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的共同通路3，4。其中caspase8是死亡受體途徑中最重要的啟始因子之一,該酶啟動(dòng)后可以直接激活效應(yīng)caspase的級(jí)聯(lián)反應(yīng),誘導(dǎo)caspase3、caspase6的活化,還可以作用于Bid(Bcl-2家族促凋亡成員),被剪切后的Bid轉(zhuǎn)位至線粒體內(nèi),誘導(dǎo)線粒體膜電位的喪失和細(xì)胞色素C的釋放,后者與凋亡蛋

16、白酶激活因子-1Apaf-1(apoptosis associated factor-1)和caspase9形成凋亡小體,啟動(dòng)下游caspase效應(yīng)酶的激活,最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡5。有研究表明，錳可通過(guò)改變相關(guān)基因的調(diào)控及表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯化錳對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用,并能誘導(dǎo)調(diào)亡呈明顯的量效和時(shí)效的關(guān)系。當(dāng)氯化錳染毒濃度為400mol/L時(shí)，HUVEC-304細(xì)胞培養(yǎng)24h,其caspase8、caspase3的蛋白水平明顯升高,說(shuō)明氯化錳可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞caspase8、caspase3基因的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)其凋亡誘導(dǎo)。由于細(xì)胞凋亡受多基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié),因此氯化錳誘導(dǎo)

17、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚需深入的研究。參考文獻(xiàn)1   Malecki EA.Manganese toxicity is association in ras primary striatal neuronsJ.Brain Res Bull,2001,55(2):225-228.2   王悅,段春禮,張海燕,等.錳對(duì)多巴胺能神經(jīng)元毒性的研究J.神經(jīng)解剖學(xué)雜志,2001,17(1):57-61.3   Fujiura S,Suzumiya J,Yamada Y.Downregulation of Bcl-xl and activati

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