阿霉素合用化療耐受逆轉(zhuǎn)劑對(duì)腎癌細(xì)胞的體外逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)

1、    阿霉素合用化療耐受逆轉(zhuǎn)劑對(duì)腎癌 細(xì)胞的體外逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)        【摘要】目的探討逆轉(zhuǎn)腎癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐受。方法采用四種不同類(lèi)型的逆轉(zhuǎn)劑：異博定、Buthionine sulfoximine (BSO)、三苯氧胺、環(huán)孢素A，以單藥或多藥組合的方式與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用，與腎癌細(xì)胞共同培養(yǎng)。MTT染色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。結(jié)果單藥應(yīng)用中以異博定的逆轉(zhuǎn)效果最好，對(duì)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率達(dá)34%(P0.05)，多藥組合中以異博定+BSO+三苯氧胺更為有效，對(duì)腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)

2、抑制率達(dá)50.8%(P0.05)。結(jié)論多藥組合逆轉(zhuǎn)較單藥應(yīng)用更為有效。兩種不同逆轉(zhuǎn)機(jī)制的逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用，較兩種同為P-170的逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用效果更好?！娟P(guān)鍵詞】腎腫瘤癌藥物耐受性 Combined use of doxorubicin and modulators to revert the multidrug resistance of renal cancer cell lineREN Laicheng,XUE Zhaoying,YU Lizhang.Department of Urology,the Second Affiliated Hospital,Shanxi Medical Univer

3、sity,Taiyuan 030001【Abstract】ObjectiveTo revert the multidrug resistance of renal cancer cell line (GRC-1).Mathods4 modulators (verapamil,tamoxifen,buthionine sulfoximine (BSO),cyclosporin A) have been used combinedly with doxorubicin in culturing with GRC-1.MTT staining assay was carried out to mea

4、sure the reversal of the drug resistance by the modulators.ResultsAmong the single modulator regimens,ve-rapamil revealed the strongest reversal effect on drug resistance,the human renal cancer cell line inhibition rate being 34% (P0.05).Among the multimodulator regimens,verapamil+tamoxifen and BSO

5、was the more effective,the inhibition rate being 50.8% (P0.05).ConclusionsMultimodulator regimen was more potent than the single modulator regimen.Using 2 modulators with different reverse mechanism would be more potent than using modulators of the same reverse mechanism.【Key word】Kidney neoplasmsCa

6、rcinomaDrug tolerance近10年來(lái)對(duì)腫瘤的耐藥機(jī)制和各種逆轉(zhuǎn)劑分別進(jìn)行了大量的研究1，2。雖然在細(xì)胞株和動(dòng)物模型上取得良好逆轉(zhuǎn)效果，但在臨床實(shí)驗(yàn)中都未獲理想療效。本實(shí)驗(yàn)用四種不同類(lèi)型逆轉(zhuǎn)劑，并采用不同組合方案，以探索一種理想的逆轉(zhuǎn)方案。材料與方法一、材料腎癌細(xì)胞株GRC-1來(lái)自北京醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所，RPMI1640培養(yǎng)液為美國(guó)GIBCO產(chǎn)品，SLT spectra酶標(biāo)儀、CO2培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板均為美國(guó)產(chǎn)品，觀察用日本Olympus倒置顯微鏡。阿霉素(ADM，上海聯(lián)誼制藥廠)；3-4，5甲基-2-噻唑基-2，5-二苯基溴化四氮唑(MTT)、異博定(VPM)、Buthi

7、onine sulfoximine(BSO)均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；環(huán)孢素A(CsA，瑞士Sandoz)；三苯氧胺(Tamoxifen,北京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)藥廠)；二甲基亞砜(DMSO，北京化學(xué)試劑廠)。二、實(shí)驗(yàn)方法96孔培養(yǎng)板，每孔接種1×104細(xì)胞(0.1ml)，BSO實(shí)驗(yàn)組同時(shí)加入BSO。5% CO2，37培養(yǎng)14小時(shí)后單用組分別加入異博定(10mol/ml)、BSO(200mol/ml)、三苯氧胺(10mol/ml)、環(huán)孢素A(10mol/ml)。多藥組合組分別加入異博定+BSO；異博定+BSO+三苯氧胺；異博定+環(huán)孢素A；環(huán)孢素A+BSO。各藥濃度同單用組。對(duì)照組加入等體積

8、RPMI 1640。再培養(yǎng)10小時(shí)后，每孔加入10g/ml阿霉素0.1ml，對(duì)照組加入等體積RPMI 1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)48小時(shí)后，吸出培養(yǎng)液，然后以MTT法檢測(cè)細(xì)胞生存率3三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析檢測(cè)結(jié)果做q檢驗(yàn)。結(jié)果單用阿霉素細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(16.7±2.8)%，阿霉素、異博定聯(lián)用為(34.0±2.6)%，阿霉素、BSO聯(lián)用為(21.5±0.4)%，阿霉素、三苯氧胺聯(lián)用為(25.6±3.5)%，阿霉素、環(huán)孢素A聯(lián)用為(22.9±2.7)%。異博定的逆轉(zhuǎn)效果明顯強(qiáng)于其它三藥(P0.05)，BSO、三苯氧胺、環(huán)孢素A三藥的逆轉(zhuǎn)效果差異無(wú)顯著性(P0.

9、10)。四種逆轉(zhuǎn)劑相互組合與阿霉素合用，單用阿霉素細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為(16.7±2.8)%，阿霉素、異博定、BSO聯(lián)用為(48.5±0.4)%，阿霉素、異博定、BSO、三苯氧胺聯(lián)用為(50.8±1.9)%，阿霉素、異博定、環(huán)孢霉素A聯(lián)用為(32.9±3.2)%，阿霉素、環(huán)孢霉素A、BSO聯(lián)用為(24.9±3.3)%。以異博定、BSO、三苯氧胺聯(lián)用的逆轉(zhuǎn)效果優(yōu)于其它方案(P0.05)。討論多藥耐藥現(xiàn)象(MDR)主要由多藥耐藥基因(MDRI)編碼、相對(duì)分子質(zhì)量為170 000的穿膜糖蛋白(P-170 glycoprotein、P-170、P-gp)所

10、引起，P-170被認(rèn)為是一耗能的“藥物外排泵”，能迅速地將細(xì)胞內(nèi)的藥物排出，使化療藥物不能發(fā)揮其作用，從而導(dǎo)致MDR4。Tsuruo等2首先報(bào)道異博定可逆轉(zhuǎn)MDR后，許多藥物被相繼報(bào)道具有逆轉(zhuǎn)作用5，它們主要是鈣通道阻滯劑(VPM等)、環(huán)孢素類(lèi)、激素類(lèi)(Tamoxifen等)以及其它藥物。這些藥物都是P-170的作用底物，競(jìng)爭(zhēng)性地與P-170結(jié)合而抑制化療藥物與P-170的結(jié)合，抑制化療藥物的“外排”，從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物的聚集，逆轉(zhuǎn)MDR。文獻(xiàn)報(bào)道上述幾類(lèi)逆轉(zhuǎn)效果有所不同6-8。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明上述幾類(lèi)逆轉(zhuǎn)劑中以異博定逆轉(zhuǎn)效果最好，其余三類(lèi)逆轉(zhuǎn)效果差異無(wú)顯著性。MDR現(xiàn)象除由P-170引起外，谷

11、胱甘肽(GSH)和它的相關(guān)酶谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GP)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(GST)也是原因之一4。GSH在細(xì)胞的防御、解毒、運(yùn)轉(zhuǎn)、代謝等方面具有重要作用9，GSH可單獨(dú)或在GP、GST的催化下與一些自由基、烷化基、外源性生物活性物質(zhì)等結(jié)合，起到解毒作用10。而一些化療藥的自由基、烷化基正是其細(xì)胞毒效應(yīng)基團(tuán)，被GSH結(jié)合后喪失抗癌作用而導(dǎo)致MDR。BSO抑制GSH生物合成的限速酶-谷胺酰半胱氨酸合成酶，從而抑制GSH生物合成，降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量11，逆轉(zhuǎn)MDR。我們選用異博定、BSO這兩種不同作用機(jī)制的藥物聯(lián)用逆轉(zhuǎn)MDR，結(jié)果顯示逆轉(zhuǎn)效果優(yōu)于兩種同為P-170抑制劑的合用。目前對(duì)腫瘤多藥耐藥的

12、逆轉(zhuǎn)研究，在動(dòng)物模型、體外實(shí)驗(yàn)中取得了理想的效果，但在臨床應(yīng)用中效果甚微，主要原因有(1)逆轉(zhuǎn)劑的毒副作用限制其大劑量應(yīng)用，使血漿藥物難以達(dá)到體外逆轉(zhuǎn)所需濃度。(2)血漿蛋白的影響，與血漿蛋白親和性低的逆轉(zhuǎn)劑，很容易擴(kuò)散到細(xì)胞發(fā)揮生物活性；相反，血漿蛋白親和性高的逆轉(zhuǎn)劑要在體內(nèi)達(dá)到逆轉(zhuǎn)濃度，所需劑量較大，毒副作用也大。(3)逆轉(zhuǎn)劑與化療藥物相互作用，使藥物代謝、清除發(fā)生改變，影響療效。(4)有數(shù)種耐藥機(jī)制參與MDR，而只對(duì)一種機(jī)制逆轉(zhuǎn)很難發(fā)揮作用。以上幾點(diǎn)在臨床設(shè)計(jì)逆轉(zhuǎn)方案時(shí)應(yīng)予重視。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，阿霉素與逆轉(zhuǎn)劑結(jié)合應(yīng)用可逆轉(zhuǎn)MDR，單種逆轉(zhuǎn)劑中以異博定逆轉(zhuǎn)效果最好，兩種逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用以異博定+

13、BSO效果最佳，兩種逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用效果比單劑逆轉(zhuǎn)效果更好，兩種不同逆轉(zhuǎn)機(jī)制的逆轉(zhuǎn)劑聯(lián)用，較兩種P-170的抑制劑聯(lián)用效果更佳。作者單位：任來(lái)成（030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科）薛兆英俞莉章（北京醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科）參考文獻(xiàn)1Pastan I,Gottesman MM.Multiple drug resistance in human cancer.N End J Med,1987,3161388-1397.2Tsuruo T,Iida H,Tsukagoshi S,et al.Increased accumulation of vincristine and adriamy

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