生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)

1、BIOCHEM AND MICROBIOEGN 生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)實(shí) 驗(yàn) 指 導(dǎo) 書(shū)指導(dǎo)教師：王志剛 王昌河 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院2序 言隨著國(guó)家經(jīng)濟(jì)社會(huì)及教育改革的發(fā)展，現(xiàn)有的人才培養(yǎng)模式不能滿足當(dāng)今社會(huì)對(duì)綜合型、應(yīng)用型及創(chuàng)新型人才培養(yǎng)的需求，教學(xué)內(nèi)容和課程體系改革是人才培養(yǎng)模式改革的主要落腳點(diǎn)，教學(xué)方法和教學(xué)手段是實(shí)現(xiàn)教學(xué)目標(biāo)、落實(shí)人才培養(yǎng)模式、提高素質(zhì)教育的重要因素，而實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平和實(shí)驗(yàn)教學(xué)層次則直接影響到學(xué)生的知識(shí)水平、專業(yè)技能和綜合素質(zhì)的提升。生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)打破了傳統(tǒng)的單一知識(shí)點(diǎn)單一實(shí)驗(yàn)的作坊式實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，綜合了微生物學(xué)、生物化學(xué)及生物工程的基本知識(shí)和技能，將相關(guān)知識(shí)點(diǎn)自然有

2、序地貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)。為生物科學(xué)專業(yè)開(kāi)設(shè)生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)是學(xué)院進(jìn)行大膽的創(chuàng)新性嘗試，深化本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革，突出學(xué)生綜合應(yīng)用能力及創(chuàng)新能力的培養(yǎng)，探索并建立多學(xué)科交叉融合，具有連續(xù)性、綜合性和設(shè)計(jì)性的大實(shí)驗(yàn)教學(xué)模式，為國(guó)家及地方高校進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)的改革和創(chuàng)新提供方法和依據(jù)。生物技術(shù)大實(shí)驗(yàn)采用集中授課，避免了傳統(tǒng)教學(xué)方式實(shí)驗(yàn)時(shí)間分散、學(xué)生無(wú)法統(tǒng)籌等缺點(diǎn)，更能有效激起學(xué)生學(xué)習(xí)的積極性，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)效率。菌種的篩選與純化、菌種培養(yǎng)條件及產(chǎn)酶條件優(yōu)化、發(fā)酵設(shè)備的構(gòu)造及使用、發(fā)酵過(guò)程的中間分析與控制、發(fā)酵浸提液的固液分離與有效成分的初步提取、層析分離和純化、酶活測(cè)定及成品加工等相關(guān)技術(shù)有機(jī)結(jié)合，實(shí)驗(yàn)過(guò)程

3、連貫有序，學(xué)生的自主性設(shè)計(jì)貫穿于實(shí)驗(yàn)教學(xué)的每個(gè)環(huán)節(jié)，有利于培養(yǎng)學(xué)生初步的科研能力，能有效促進(jìn)學(xué)生整體觀、綜合設(shè)計(jì)能力及創(chuàng)新能力的培養(yǎng)與提高。希望通過(guò)本實(shí)驗(yàn)課程的學(xué)習(xí)，學(xué)生的綜合應(yīng)用能力、實(shí)驗(yàn)操作技能及創(chuàng)新能力能有一定的提高，并能有效提高學(xué)生初步的科研能力。實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)一 枯草芽孢桿菌淀粉酶產(chǎn)生菌的分離與純化1實(shí)驗(yàn)二 枯草芽孢桿菌淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件7實(shí)驗(yàn)三 發(fā)酵浸提液的固液分離及有效成分的初步提取12實(shí)驗(yàn)四 淀粉酶的層析分離和純化15實(shí)驗(yàn)五 -淀粉酶的酶活性質(zhì)研究 20附表 23實(shí)驗(yàn)一 枯草芽孢桿菌淀粉酶產(chǎn)生菌的分離和純化一、目的和要求1.掌握常用培養(yǎng)基的配制方法、操作步驟及高壓蒸汽滅菌的基

4、本原理和方法。2.掌握微生物的分離、純化及菌種保藏的基本原理和方法。3.練習(xí)微生物接種、移植和培養(yǎng)等基本技術(shù)，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。4.了解菌種保藏的基本原理，掌握幾種常用的菌種保藏方法。二、基本原理在土壤、水、空氣或人及動(dòng)、植物體中，混雜生存著大量不同種類(lèi)的微生物，從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過(guò)程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件，如營(yíng)養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求,或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其他微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或平板劃線

5、分離法等方法分離、純化出該微生物，直至得到純菌株。需要注意的是，從微生物群體中經(jīng)分離生長(zhǎng)在平板上的單個(gè)菌落并不能保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)需要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。土壤是微生物生活的大本營(yíng)，這里生活的微生物在數(shù)量和種類(lèi)上都是極其多樣的，因此，土壤中的微生物具有較高的豐富度和多樣性，土壤是我們開(kāi)發(fā)利用微生物資源的重要基地，可以從其中分離、純化到許多有用的菌株。本實(shí)驗(yàn)將采用平板分離法從土壤中分離出-淀粉酶高產(chǎn)菌的枯草芽孢桿菌。三、試驗(yàn)材料1.樣品：新鮮土壤2.培養(yǎng)基2.1 平板篩選培養(yǎng)基

6、 蛋白胨 10g、NaCl 5g、牛肉膏 3g、可溶性淀粉 20g、0.01曲利苯藍(lán) 10ml、蒸餾水 1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min（固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基中加20g瓊脂）。2.2 斜面培養(yǎng)基 可溶性淀粉 1、蛋白胨 0.5、磷酸二氫鉀 0.3、(NH4)2SO4 0.25，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min（固體培養(yǎng)基，則每升培養(yǎng)基中加20g瓊脂）。3.溶液和試劑新鮮土壤、蒸餾水、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、可溶性淀粉、稀碘液、NaCl、K2HPO4、KH2PO4、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液4.儀器或其它用具無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、無(wú)菌三角玻棒、微量移液器

7、、移液器槍頭、恒溫培養(yǎng)箱、無(wú)菌工作臺(tái)、天平、吸耳球、pH計(jì)、量筒、試管、三角瓶、玻璃珠、漏斗、分裝架、玻璃棒、燒杯、鐵絲筐、接種環(huán)、酒精燈、牛皮紙、紗布、鐵架臺(tái)、電爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、冰箱等;四、試驗(yàn)路線稱取土樣梯度稀釋平板篩選分離培養(yǎng)斜面接種菌種保藏五、操作步驟1.實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備1.1 清洗和包裹 玻璃器皿等在滅菌前須進(jìn)行包裹和加塞，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內(nèi)；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結(jié)扎緊；吸管用紙條斜著從吸管尖端包起，逐步向上卷，頭端的紙卷捏扁并擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。 圖1-

8、1 吸管滅菌前的包裝1.2 干燥箱滅菌 將包扎好的物品放入干燥烘箱內(nèi)，不要擺放太密，確?？諝饬魍?；不得使器皿與烘箱內(nèi)層底板直接接觸。將烘箱溫度升至160170并恒溫12h，注意勿使溫度過(guò)高，超過(guò)170，器皿外包裹的紙張、棉花會(huì)被烤焦燃燒。如果僅需烤干玻璃器皿，在120恒溫30分鐘即可。溫度降至6070時(shí)方可打開(kāi)箱門(mén)，取出物品，否則玻璃器皿會(huì)因驟冷而爆裂。用此法滅菌時(shí)，不能使用油、蠟紙包扎物品。1.3 火焰滅菌 直接用火焰灼燒滅菌，迅速?gòu)氐?。?duì)于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過(guò)程中，試管或三角瓶口，也采用通過(guò)火焰而達(dá)到滅菌的目的。1.4無(wú)菌水的制

9、備 250mL三角燒瓶（裝有20個(gè)玻璃珠），裝自來(lái)水90mL，試管中裝9.0mL自來(lái)水，塞上棉塞，包扎、滅菌備用。三角燒瓶和試管須預(yù)先塞好棉塞，并經(jīng)干熱滅菌。2.培養(yǎng)基的制備2.1 稱量 按培養(yǎng)基配方依次準(zhǔn)確稱取各藥品，放入適當(dāng)大小的燒杯中，蛋白胨極易吸潮，稱量應(yīng)迅速；牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿稱量，用熱水溶化后倒入燒杯，也可放稱量紙上，稱量后直接放入水中，這時(shí)如稍微加熱，牛肉膏便會(huì)與稱量紙分離，然后立即取出紙片。2.2 溶化 在燒杯中先加入一定量（約占總量的1/2）蒸餾水，在石棉網(wǎng)上加熱攪拌使其溶解，或在磁力攪拌溶解。將藥品完成溶解后，補(bǔ)充水到所需總體積。配方中有淀粉，則先將淀粉

10、用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補(bǔ)足水分。配制固體培養(yǎng)基，則將所需量的瓊脂放入已溶的藥品中，再邊攪拌邊加熱溶化，最后補(bǔ)足水分（水需預(yù)熱）。2.3 調(diào)節(jié)pH 根據(jù)培養(yǎng)基對(duì)pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測(cè)定pH可用pH試紙或酸度計(jì)等。2.4 過(guò)濾 趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利于某些實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，一般無(wú)特殊要求情況下，這一步是可以省去的。2.5 分裝 過(guò)濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時(shí)注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，固體分裝量為管高的1/5，滅菌后制斜面；分裝三角瓶，其

11、裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。圖1-2 培養(yǎng)基的分裝2.6 加塞 培養(yǎng)基分裝完畢，在試管口或三角燒瓶口塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)而造成污染，并保證有良好的通氣性能。圖1-3 棉塞的正確制作方法1.正確方法 2.管內(nèi)部分太短、外部太松 3.外部過(guò)小 4.整個(gè)棉塞過(guò)松 5.管內(nèi)部分過(guò)緊、外部太松2.7 包扎 加塞后，將全部試管用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤(rùn)濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好.用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別和配制日期，三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結(jié)形式扎好，使用容易解開(kāi)，同樣用記號(hào)筆注明培養(yǎng)基名稱、組別和配制日期。2.8 滅菌 將內(nèi)層鍋取出

12、，再向外層鍋內(nèi)加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜，放回內(nèi)層鍋，并裝入培養(yǎng)基，加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層鍋的排氣槽內(nèi)，加熱，0.103MPa，121并同時(shí)打開(kāi)排氣，使水沸騰以排除鍋內(nèi)的冷空氣，待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸氣壓力增加而逐漸上升；當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開(kāi)始計(jì)算滅菌時(shí)間。20min后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至”0”時(shí)，打開(kāi)排氣，旋送螺銓，打開(kāi)蓋子，取出。將取出的滅菌培養(yǎng)基放入37溫箱培養(yǎng)。24h，經(jīng)過(guò)檢查，若無(wú)菌生長(zhǎng)，既可待用。2.9 擱置斜面 將滅菌的試管培養(yǎng)基冷至50左右，將試管口端擱置在玻棒或其它合

13、適高度的器具上，斜面長(zhǎng)度以不超過(guò)試管總長(zhǎng)的一半為宜。圖1-4 斜面的擺法和冷凝2.10 倒平板 將滅菌后的培養(yǎng)基，于水浴鍋中冷卻到5560，立刻倒平板，倒平板的方法是右手持盛培養(yǎng)基的試管或三角燒瓶，置火焰旁邊，左手拿平皿并松動(dòng)試管塞或瓶塞，用手掌邊緣和小指、無(wú)名指夾住拔出，如果試管內(nèi)或三角燒瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基一次可用完，則管塞或瓶塞不必夾在手指中。試管（瓶）口在火焰上滅菌，然后左手將培養(yǎng)皿蓋在火焰附近打開(kāi)一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可將平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夾住管塞并打開(kāi)培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻后制成

14、平板。最好是將平板放室溫2-3天，或37培養(yǎng)24小時(shí)，檢查無(wú)菌落及皿蓋無(wú)冷凝水后再使用。圖1-5 倒平板的方法3.-淀粉酶產(chǎn)生菌的分離純化3.1采土樣 選擇較肥沃的土壤，鏟去土表層，挖520cm深度的土壤數(shù)10g，裝入滅菌的牛皮紙袋內(nèi)，封好袋口，做好編號(hào)記錄，攜回實(shí)驗(yàn)室備用。3.2 制備土壤稀釋液 稱取土樣l0g，放入盛90ml無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角燒瓶中，振搖20min，使土樣與水充分混合，將菌分散，即為稀釋10-1的土壤懸液。取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的大試管中充分混勻，然后用無(wú)菌吸管從此試管中吸取lml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類(lèi)推制成10-1、10-2

15、、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7不同稀釋度的土壤溶液。注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換一支試管，在土壤稀釋過(guò)程中，應(yīng)用一支吸管由濃到稀，稀釋到底。圖1-6 土壤稀釋液的制備和稀釋液的取樣3.2 涂布平板 取3個(gè)篩選培養(yǎng)基，用記號(hào)筆在培養(yǎng)皿底部貼上標(biāo)簽，分別注明稀釋度（10-4、10-5和10-6）、組別和班級(jí)，然后用無(wú)菌吸管分別由10-4、10-5和10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml，小心地滴在對(duì)應(yīng)平板培養(yǎng)基表面中央位置，右手拿無(wú)菌玻璃涂棒平放在平板培養(yǎng)基表面上，將菌懸液先沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展，使之分布均勻。室溫下靜置5l0min，使菌液浸入培養(yǎng)基。圖

16、1-7 平板涂抹操作3.3 培養(yǎng) 將培養(yǎng)基平板倒置于37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-3日。3.4 挑菌 觀察菌落形態(tài)，并計(jì)數(shù)菌數(shù)。選取菌落周?chē)纬擅黠@透明圈的菌株，測(cè)量水解圈直徑（Dh）與菌落直徑（Dc），挑選d/D值較大的進(jìn)行劃線純化。4.平板劃線分離純化4.1標(biāo)記 每組取無(wú)菌培養(yǎng)皿3付，在皿底貼上標(biāo)簽，標(biāo)明培養(yǎng)基名稱、組別和實(shí)驗(yàn)日期。取已熔化的篩選培養(yǎng)基，倒入平皿，制成平板。4.2 劃線 劃線在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取上述分離出的菌株一環(huán)在平板上劃線。劃線的方法很多，但無(wú)論哪種方法劃線，其目的都是通過(guò)劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使形成單個(gè)菌落。（1）連續(xù)劃線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平

17、板培養(yǎng)基上作連續(xù)劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，于37倒置培養(yǎng)48h。圖1-8 連續(xù)劃線法（2）分區(qū)劃線法：用接種環(huán)挑取相應(yīng)菌液，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線3-4條，再轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿約60°角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過(guò)第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同法通過(guò)第二次平行劃線部分作第三次平行劃線和通過(guò)第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。劃線完畢后，蓋上皿蓋，于37倒置培養(yǎng)48h。圖1-9 分區(qū)劃線法4.3 挑菌 觀察菌落形態(tài)，挑選d/D值大的單菌落再進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)純化數(shù)次，以提高菌落純度，直至獲得純培養(yǎng)。5.斜面接種操作在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行，先點(diǎn)燃酒精燈。將菌種斜面培

18、養(yǎng)基(菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(接種管)持在左手拇指、食指、中指及無(wú)名指之間，斜面向上管口對(duì)齊，斜持試管呈450度角，并能清楚地看到兩個(gè)試管的斜面，注意不要持成水平，以免管底凝集水浸濕培養(yǎng)基表面。以右手在火焰旁轉(zhuǎn)動(dòng)兩管棉塞，使其松動(dòng)，以便接種時(shí)易于取出。將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒，鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，需要徹底灼燒。用右手的小指和手掌之間及無(wú)名指和小指之間撥出試管棉塞，將試管口在火焰上通過(guò)，以殺滅可能沾污的微生物。棉塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無(wú)菌棉塞。將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無(wú)菌苔生長(zhǎng)的培養(yǎng)基上

19、，待冷卻后再?gòu)男泵嫔瞎稳∩僭S菌苔取出，接種環(huán)不能通過(guò)火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上做S形劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過(guò)火焰抽出管口，并迅速塞上棉塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊棉塞。在斜面的正上方距離試管口2-3cm處貼上標(biāo)簽，在標(biāo)簽紙上寫(xiě)明接種的細(xì)菌菌名、培養(yǎng)基名稱和接種日期，于37恒溫箱中培養(yǎng)48h。圖1-10 斜面接種無(wú)菌操作6.純培養(yǎng)的保存（斜面冰箱保藏法）將菌種接在新鮮斜面培養(yǎng)基上，定溫培養(yǎng)長(zhǎng)出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細(xì)菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長(zhǎng)出孢子，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入4冰箱中保藏。一般每隔3個(gè)月至半年用新鮮培養(yǎng)基移植1次。圖

20、1-11 菌種的保存六、注意事項(xiàng)（1）要確保滅菌徹底，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)保證無(wú)菌操作；（2）高壓蒸汽滅菌過(guò)程中，注意不要將待滅菌的物品擺放太密，以免妨礙空氣流通；滅菌結(jié)束后，應(yīng)待壓力降至接近“0”時(shí)，才能打開(kāi)放氣閥，過(guò)早過(guò)急地排氣，會(huì)由于瓶?jī)?nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶?jī)?nèi)液體沖出容器之外；（3）制備土壤稀釋液的過(guò)程中，需使用不同的吸管（可使用微量移液器，稀釋過(guò)程中更換槍頭）。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）檢查培養(yǎng)基滅菌是否完全。（2）觀察淀粉酶產(chǎn)生菌的菌落形態(tài)，簡(jiǎn)述菌落的形態(tài)特征。（3）分析肥沃土壤中淀粉酶產(chǎn)生菌的數(shù)量級(jí)一般為多少？（4）所做涂布平板法和劃線法是否較好地得到了單菌落？如果不是

21、，請(qǐng)分析其原因并進(jìn)一步進(jìn)行分離純化。（5）斜面培養(yǎng)檢驗(yàn)分離純化效果，保存菌種。2.思考題（1）培養(yǎng)基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養(yǎng) 基是否有污染？（2）在土壤稀釋液的制備過(guò)程中，逐級(jí)稀釋的目的是什么？（3）在菌種分離純化過(guò)程中，為什么要把培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？（4）在平板分區(qū)劃線中，為什么每次都需將接種環(huán)上的剩物燒掉？（5）斜面接種過(guò)程中，應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)？（6）純培養(yǎng)保存的方法有哪些？保存過(guò)程中應(yīng)該注意哪些事項(xiàng)？（7）如何確定平板上某單個(gè)菌落是否為純培養(yǎng)？請(qǐng)寫(xiě)出主要的實(shí)驗(yàn)步驟。（8）試設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，從土壤中分離酵母菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)二 枯草芽孢桿菌淀粉酶產(chǎn)生菌的發(fā)酵條件一、目的和

22、要求1.掌握紫外分光光度計(jì)的工作原理和操作方法；2.掌握-淀粉酶酶活的測(cè)定原理和方法；3.掌握微生物生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線的繪制原理和方法；4.了解炭源、氮源、通氣量、底物含量、溫度、發(fā)酵初始pH值等理化因素對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶的影響。二、基本原理1.-淀粉酶活力的測(cè)定-淀粉酶能將淀粉鏈的-1,4葡萄糖苷鍵切斷，使淀粉成為長(zhǎng)短不一的短鏈糊精以及少量麥芽糖和葡萄糖。因此酶反應(yīng)過(guò)程中對(duì)碘呈藍(lán)紫色的特異反應(yīng)逐漸消失，以顏色消失的速度計(jì)算酶活力。2.枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線的繪制由于細(xì)菌懸液的濃度和濁度成正比,因此可以用分光分度計(jì)測(cè)定菌懸液的OD值來(lái)推知菌液的濃度。將種子接入到新鮮的培養(yǎng)基,開(kāi)始記時(shí),每隔一個(gè)小時(shí)取

23、5ml樣,以未接種的培養(yǎng)基為參照,用分光光度計(jì), 660nm的波長(zhǎng)下,測(cè)量吸光度,將其和時(shí)間建立坐標(biāo)關(guān)系描繪出一根曲線,即為生長(zhǎng)曲線。3.枯草芽孢桿菌產(chǎn)酶曲線的繪制 在細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)的不同時(shí)間取出一定量的發(fā)酵液，加入EP管中，離心取上清液，測(cè)定酶活，測(cè)定結(jié)果與時(shí)間相關(guān)即可得到產(chǎn)酶曲線。4.發(fā)酵條件研究環(huán)境因素包括物理因素、化學(xué)因素和生物因素，培養(yǎng)條件對(duì)菌體生長(zhǎng)和酶的產(chǎn)生具有重要影響。培養(yǎng)條件優(yōu)化包括種子種齡和接種量的確定、培養(yǎng)基中炭源和氮源的確定、底物濃度的確定、培養(yǎng)溫度以及培養(yǎng)基起始pH值的確定。在產(chǎn)酶發(fā)酵過(guò)程中，酶的合成是受到一定發(fā)酵條件控制的，條件不同，所產(chǎn)生的酶量有很大變化。將炭源、氮源

24、、通氣量、底物含量、溫度、發(fā)酵初始pH值等因素分別作梯度，對(duì)芽孢桿菌進(jìn)行培養(yǎng)，確定芽孢桿菌產(chǎn)生-淀粉酶的最佳培養(yǎng)條件。三、試驗(yàn)材料1.培養(yǎng)基1.1 液體篩選培養(yǎng)基蛋白胨 10g、NaCl 5g、牛肉膏 3g、可溶性淀粉 20g、0.01曲利苯藍(lán) 10ml、蒸餾水 1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min1.2 參考發(fā)酵培養(yǎng)基黃豆粉 5g、麩皮 10g、可溶性淀粉 2.5g、蒸餾水 1000ml，調(diào)節(jié)PH為8.8，121滅菌20min1.3 基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基蛋白胨 10g、牛肉膏 3g、NaCl 5g、蒸餾水 1000ml，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min1.4 不同碳源培養(yǎng)基

25、以蛋白胨為氮源，分別以葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、纖維素、麩皮、蔗糖、甘油和乳糖（濃度均為1）作為碳源替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min1.5 不同氮源培養(yǎng)基 以麩皮為碳源（濃度為1），以(NH4)2SO4、明膠、NH4NO3、尿素、KNO3、黃豆粉和蛋白胨（濃度均為1）作為氮源替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源配制培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min1.6 不同NaCl含量的培養(yǎng)基 以麩皮為碳源、以黃豆粉為氮源（濃度均為1），改變NaCl的含量，分別以0、0.1、0.3、0.5、0.7%、0.9%的含量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌2

26、0min1.7 不同底物含量的培養(yǎng)基 在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的底物（可溶性淀粉），分別以0、0.25、0.5、0.75、1.0%、2.0%、4.0的含量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)PH為7.0，121滅菌20min1.8 不同初始pH值的培養(yǎng)基 調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，121滅菌20min2.酶活測(cè)定溶液（1）國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法 原碘液：稱取碘化鉀22.0g溶于約300ml水中，加入碘11.0g，在攪拌下使其溶解，然后用蒸餾水定容至500ml，貯于棕色瓶中備用（每月制備一次）；稀碘液：稱取碘化鉀22.0g溶于約300ml水中，準(zhǔn)確加入原

27、碘液2.00ml，用蒸餾水定容至500ml，貯于棕色瓶中備用（每天制備一次）；2可溶性淀粉溶液：稱取可溶性淀粉（以絕干計(jì)）2.000g，精確至0.001g，用少量蒸餾水調(diào)成漿狀物，在攪動(dòng)下傾入70ml沸水中，然后以30ml蒸餾水分幾次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液并入其中，加熱煮沸20min直至完全透明，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至100ml，此溶液必須當(dāng)天配制；緩沖液（pH6.0）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）45.23g和檸檬酸（C6H8O7H2O）8.07g，用蒸餾水定容至1000ml，配好后應(yīng)以酸度計(jì)校正pH 值為6.0；鹽酸溶液0.1ml/L：吸取36的濃鹽酸86.2ml，用水溶

28、解并定容至1000ml，制得1mol/L鹽酸溶液，稀釋10倍后得0.1mol/L鹽酸溶液；（2）蘭值法A液（0.2mol/L磷酸氫二鈉）：稱取磷酸氫二鈉35.61g用蒸餾水定容至1000ml；B液（0.2mol/L磷酸二氫鈉,NaH2PO4H2O）：稱取磷酸二氫鈉27.6g用蒸餾水定容至1000ml;C液（0.2mol/L pH6.6 的磷酸緩沖液）：取A液375ml和B液625ml混合；1.0可溶性淀粉溶液：稱取可溶性淀粉（以絕干計(jì)）1.000g，精確至0.001g，用少量C液調(diào)成漿狀物，在攪動(dòng)下傾入70ml煮沸的C液中，然后以30ml C液分幾次沖洗裝淀粉的燒杯，洗液并入其中，加熱煮沸20

29、min直至完全透明，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至100ml，此溶液必須當(dāng)天配制；0.5mol/L冰乙酸溶液：量取29.15ml冰乙酸，用蒸餾水定容至1000ml；濃碘液（0.15I2-1.5%KI）：稱取碘化鉀15g用少量蒸餾水溶解，稱取1.5g碘加入碘化鉀溶液中振蕩至碘完全溶解，用蒸餾水定容至1000ml；稀碘液（0.015I2-0.15%KI）量取濃碘液100ml，用蒸餾水定容至1000ml3.試劑蛋白胨、牛肉膏、瓊脂、可溶性淀粉、0.01曲利苯藍(lán)、黃豆粉、麩皮、NaCl、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘油、乳糖、(NH4)2SO4、明膠、NH4NO3、尿素、KNO3、黃豆粉、K2HPO4、KH2P

30、O4、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液、碘化鉀、碘、Na2HPO412H2O、檸檬酸、0.1ml/L HCl溶液、NaH2PO4H2O、冰乙酸4.儀器或其它用具無(wú)菌培養(yǎng)皿、無(wú)菌吸管、無(wú)菌三角玻棒、微量移液器、移液器槍頭、恒溫培養(yǎng)箱、無(wú)菌工作臺(tái)、紫外檢測(cè)儀（分光光度計(jì)）、天平、移液管、吸耳球、pH計(jì)、量筒、試管、三角瓶、漏斗、接種環(huán)、涂布棒、酒精燈、牛皮紙或報(bào)紙、紗布、鐵架臺(tái)、電爐、滅菌鍋、干燥箱、水浴鍋、冰箱等；四、試驗(yàn)路線設(shè)置條件梯度發(fā)酵培養(yǎng)（設(shè)置條件剃度）酶活測(cè)定確定最佳培養(yǎng)條件繪制芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線繪制產(chǎn)酶曲線五、操作步驟1.碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響以蛋白胨為氮源，分別以葡萄糖、麥芽糖、可

31、溶性淀粉、纖維素、麩皮、蔗糖、甘油和乳糖（濃度均為1）作為碳源替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后離心取上清液測(cè)定酶活，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇對(duì)產(chǎn)酶最有利的碳源；2.氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響以麩皮為碳源（濃度為1），以(NH4)2SO4、明膠、NH4NO3、尿素、KNO3、黃豆粉和蛋白胨（濃度均為1）作為氮源替換基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后離心取上清液測(cè)定酶活，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇對(duì)產(chǎn)酶最有利的氮源；3.NaCl含量對(duì)產(chǎn)酶的影響以麩皮為碳源、以黃豆粉為氮源（濃度均為1），選擇不同的NaCl加入量進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后離心取上清液測(cè)定酶活，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)選擇最佳NaCl加入量

32、；4.通氣含量對(duì)產(chǎn)酶的影響用100ml三角瓶分別裝10、15、20、25、30ml不同量的發(fā)酵培養(yǎng)基接種發(fā)酵，培養(yǎng)48h后以上清液酶活大小為指標(biāo)，測(cè)定不同裝液量（即通氣量）對(duì)產(chǎn)酶的影響；5.底物（淀粉）含量對(duì)產(chǎn)酶的影響在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同量的底物（可溶性淀粉），分別以0、0.25、0.5、0.75、1.0%、2.0%、4.0的含量配制發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后以上清液酶活大小為指標(biāo)，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳的可溶性淀粉含量；6.溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響100ml三角瓶盛放15ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，從斜面接入1環(huán)菌體，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，200r/min，分別在15、20、25、30、35、40、

33、45、50進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后以上清液酶活大小為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵溫度；7.培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響調(diào)整基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，各取15ml加入100ml三角瓶中，從斜面接入1環(huán)菌體，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，200r/min，30進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后以上清液酶活大小為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基初始pH值；8.生長(zhǎng)曲線的測(cè)定250ml三角瓶盛放50ml種子培養(yǎng)基，從斜面接入1環(huán)菌體，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上，200r/min，30培養(yǎng)，從0h開(kāi)始，每隔1h取5ml樣，直至48h，以空白培養(yǎng)基做對(duì)照，用分光光度計(jì)于660nm波長(zhǎng)下

34、測(cè)定吸光度OD值，將其和時(shí)間建立坐標(biāo)關(guān)系描繪出一根曲線,即為生長(zhǎng)曲線；9.產(chǎn)酶曲線的測(cè)定在細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)的不同時(shí)間，取出發(fā)酵液1.00ml加入1.5ml EP管中，離心取上清，測(cè)定酶活，測(cè)定結(jié)果與時(shí)間建立坐標(biāo)關(guān)系描繪出產(chǎn)酶曲線。10.酶活力的測(cè)定10.1 國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)法（QB/T 2306-97）（1）酶活定義：在70、pH 6.0條件下，1 min 液化可溶性淀粉1mg所需的酶量，即為一個(gè)酶活單位，以u(píng)/ml(u/mg)表示。（2）測(cè)試方法： 吸取2可溶性淀粉溶液20ml和pH6.0緩沖溶液5ml于試管中。在70恒溫水浴中預(yù)熱平衡5min； 加入稀釋好的待測(cè)酶液1.00ml，立即用秒表計(jì)時(shí)，搖

35、勻，準(zhǔn)確反應(yīng)5min； 立即用自動(dòng)吸管吸取反應(yīng)液（b）1.00ml于預(yù)先盛有0.1mol/L鹽酸0.5ml和稀碘液5ml的試管中，搖勻； 以0.1mol/L鹽酸0.5ml和稀碘液5ml的混合液作為空白對(duì)照，于660nm波長(zhǎng)下，用10mm比色皿迅速測(cè)定其吸光度（A）。根據(jù)吸光度查表，求得測(cè)試酶液的濃度（c）。（3）計(jì)算方法：X=c×n×16.67其中，X-樣品的酶活力（u/ml,u/mg）;c-測(cè)試酶液的濃度（u/ml）；n-樣品的稀釋倍數(shù)；16.67-換算倍數(shù)。平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)誤差不得超過(guò)2。10.2 蘭值法（1）酶活定義：酶活力（BV）是指在測(cè)試條件下使淀粉與碘呈色反應(yīng)

36、（藍(lán)色深度下降10時(shí)所相當(dāng)?shù)谋灰夯目扇苄缘矸?mg）來(lái)表示的。（2）測(cè)試方法： 量取1.0的可溶性淀粉溶液（用緩沖液配置）100ml入搖瓶，在70下保溫10min； 吸取酶液1.00ml加入預(yù)熱淀粉溶液中，搖勻，計(jì)時(shí)反應(yīng)30min； 吸取0.5mol/L冰乙酸溶液10ml加入反應(yīng)體系中終止反應(yīng)； 吸取終止反應(yīng)液1.0ml加入10ml稀碘-碘化鉀溶液中搖勻，于660nm波長(zhǎng)下，用分光光度計(jì)測(cè)定吸光值OD1； 以蒸餾水代替酶液重做上面的測(cè)試步驟，所得吸光值為OD0。（3）計(jì)算方法：BV=(OD0- OD1)/ OD1×S×N×100/10其中，S-反應(yīng)體系中的點(diǎn)分量

37、（mg）;N-酶液的稀釋倍數(shù)； OD0-空白吸光值；OD1-樣品的吸光值。六、注意事項(xiàng)（1）接種液體培養(yǎng)物時(shí)應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺(tái)上或其他器 皿上，以免造成污染；如有濺污，可用酒精棉球灼燒滅菌后，再用消毒液擦凈（2）凡吸過(guò)菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)；（3）配制可溶性淀粉溶液必須用沸水或煮沸的緩沖液進(jìn)行配制，煮 沸溶解成透明或半透明的液體，否則不能與碘結(jié)合成紫蘭色的復(fù)合物；（4）吸取酶液時(shí)盡量取澄清后的上清液，因?yàn)榇痔嵛镏泻写罅康牟蝗苄噪s質(zhì)，這些雜質(zhì)在高溫作用下會(huì)干擾淀粉與碘的顯色反應(yīng)，使溶液不變藍(lán)；七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）記錄發(fā)酵過(guò)程中觀察到的現(xiàn)象；（2）測(cè)定

38、不同炭源、不同氮源發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的酶活，并列表記錄，確定最佳炭源和氮源；（3）測(cè)定不同NaCl含量發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的酶活，并繪制NaCl添加量與產(chǎn)酶關(guān)系曲線，確定最佳NaCl含量；（4）測(cè)定不同裝液量下發(fā)酵產(chǎn)物的酶活，并繪制裝液量與產(chǎn)酶關(guān)系曲線，確定最佳通氣量（裝液量）；（5）測(cè)定不同底物含量發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的酶活，并繪制淀粉添加量與產(chǎn)酶關(guān)系曲線，確定最佳底物含量；（6）測(cè)定不同發(fā)酵溫度下發(fā)酵產(chǎn)物的酶活，并繪制發(fā)酵溫度與產(chǎn)酶關(guān)系曲線，確定最佳發(fā)酵溫度；（7）測(cè)定不同初始pH值發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)物的酶活，并繪制初始pH值與產(chǎn)酶關(guān)系曲線，確定發(fā)酵培養(yǎng)基最佳初始pH值；（8）繪制枯草芽孢桿菌的

39、生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線；2.思考題（1）-淀粉酶酶活力測(cè)定中應(yīng)注意哪些因素？（2）試討論在發(fā)酵過(guò)程中都是有哪些因素會(huì)影響枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況？（3）試設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)，確定嗜堿芽孢桿菌支鏈淀粉酶產(chǎn)生菌的最適產(chǎn)酶條件。實(shí)驗(yàn)三 發(fā)酵浸提液的固液分離及有效成分的初步提取一、目的和要求1.熟悉發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及操作方法；2.掌握發(fā)酵浸提液的固液分離的操作步驟和工作原理；3.掌握鹽析法初步分離純化蛋白質(zhì)的原理和方法；4.掌握透析脫鹽濃縮蛋白質(zhì)的原理和方法。二、基本原理1.蛋白質(zhì)的鹽析蛋白質(zhì)是親水膠體，借水化膜和同性電荷（在PH值7.0的溶液中一般蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷）維持膠體的穩(wěn)定性。由于蛋白質(zhì)分子內(nèi)及分子間

40、電荷的極性基團(tuán)有著靜電引力，當(dāng)向蛋白質(zhì)溶液中加入少量堿金屬或堿土金屬的中性鹽類(lèi)如(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl或MgSO4等時(shí)，由于鹽類(lèi)離子與水分子對(duì)蛋白質(zhì)分子上的極性基團(tuán)的影響，使蛋白質(zhì)在水中溶解度增大，因此蛋白質(zhì)、酶等在低鹽濃度下的溶解質(zhì)隨著鹽液濃度升高而增加，此時(shí)稱為鹽溶；當(dāng)鹽濃度不斷上升并達(dá)到一定濃度時(shí)，蛋白質(zhì)表面的電荷大量被中和，水化膜被破壞，于是蛋白質(zhì)就相互聚集而沉淀析出，蛋白質(zhì)和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。由鹽析所得的蛋白質(zhì)沉淀，經(jīng)過(guò)透析或用水稀釋以減低或除去鹽后，能再溶解并恢復(fù)其分子原有結(jié)構(gòu)及生物活性，因此由鹽析生成的沉淀是可逆性沉淀。鹽

41、析法就根據(jù)不同蛋白質(zhì)和酶在一定濃度的鹽溶液中溶解度降低程度的不同而達(dá)到彼此分離的方法。鹽析法對(duì)于許多非電解質(zhì)的分離純化都是適合的，也是蛋白質(zhì)和酶提純工作應(yīng)用最早，至今仍廣泛使用的方法。2.透析脫鹽的原理蛋白質(zhì)的分子很大，其顆粒在膠體顆粒范圍（直徑1100nm）內(nèi)，不能透過(guò)半透膜。選用孔徑合宜的半透膜，使小分子物質(zhì)能夠透過(guò)，而蛋白質(zhì)顆粒不能透過(guò)，這樣就可使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)。把蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，袋的兩端用線扎緊，然后用蒸餾水或緩沖液進(jìn)行透析，這時(shí)鹽離子通過(guò)透析袋擴(kuò)散到水或緩沖液中，蛋白質(zhì)分子量大不能穿透析袋而保留在袋內(nèi)，通過(guò)不斷更換蒸餾水或緩沖液，直至袋內(nèi)鹽分透析完畢。這種方法可除去和

42、蛋白質(zhì)混合的中性鹽及其他小分子物質(zhì)，是常用來(lái)純化蛋白質(zhì)的方法。透析需要較長(zhǎng)時(shí)間，常在低溫下進(jìn)行，并加入防腐劑避免蛋白質(zhì)和酶的變性或微生物的污染。三、試驗(yàn)材料1.培養(yǎng)基1.1 種子培養(yǎng)基KH2PO4 0.05%，MgSO4 0.03%， FeSO4 0.01%，MnSO4 0.01%，CaCl2 0.02%，蛋白胨0.2%，麥芽糖0.1%，可溶性淀粉0.25%，用HCl 調(diào)pH為 3.5；1.2 發(fā)酵培養(yǎng)基與種子培養(yǎng)基相同；2.酶活測(cè)定溶液 參照實(shí)驗(yàn)二3.試劑蛋白胨、牛肉膏、KH2PO4、可溶性淀粉、MgSO4、FeSO4、NaCl、麥芽糖、(NH4)2SO4、NaOH、HCl、碘化鉀、碘、Na

43、2HPO412H2O、NaH2PO4H2O、PEG6000、檸檬酸、冰乙酸、碳酸鈉、Na2·EDTA、EDTA4.儀器或其它用具5L發(fā)酵罐、無(wú)菌吸管、微量移液器、移液器槍頭、透析袋、恒溫培養(yǎng)箱、搖床、紫外檢測(cè)儀（分光光度計(jì)）、離心機(jī)、分析天平、pH計(jì)、量筒、三角瓶、分裝架、記號(hào)筆、紗布、酒精燈、滅菌鍋、干燥箱、恒溫水浴鍋等；四、試驗(yàn)路線發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)粗酶液制備硫酸銨鹽析透析脫鹽濃縮濃縮酶液酶活測(cè)定；五、操作步驟1.菌株發(fā)酵孢子懸浮液接入種子培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)24h，10% 的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，37，180r/min，培養(yǎng)48h；2.粗酶液的制備發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過(guò)濾，過(guò)濾液在8000

44、r/min離心20min，收集上清液即為粗酶液（測(cè)定酶活）；3.硫酸銨鹽析3.1 鹽析條件的確定1）發(fā)酵液上清分裝至4支離心管中，每管4 ml； 2）加硫酸銨至4支離心管中，使其飽和度分別為20%、40%、60%和80%。在加硫酸銨時(shí)需緩慢的加入，同時(shí)不斷的搖晃離心管使硫酸銨完全溶解； 3）40靜置4h； 4）離心，分別取四支離心管中的沉淀，測(cè)量-淀粉酶活性。3.2 鹽析 1）上清液中緩慢加入硫酸銨至40%飽和度； 2）4靜置4h后，8000r/min離心30min，除去部分雜質(zhì)蛋白，收集上清； 3）上清液中繼續(xù)緩慢加入硫酸銨至80%飽和度； 4）4靜置4h后，8000r/min離心30min

45、，棄上清液，得沉淀。4.透析脫鹽濃縮4.1 透析膜前處理透析袋的預(yù)處理方法1：1）戴手套把透析膜剪成適當(dāng)長(zhǎng)度，浸在蒸餾水中 15 min 泡軟。2）浸入 10 mM 碳酸鈉中，并加熱至80，一邊攪拌至少30 min。3）換到 10 mM Na2·EDTA 中浸泡 30 min，以新鮮的 EDTA 同樣方法處理三次。4）再用 80 蒸餾水洗 30 min，然后換到 20% 酒精中，放在 4 冰箱中保存。透析袋的預(yù)處理方法2：1）將透析袋剪成合適的長(zhǎng)度；2）在一只250 mL的玻璃燒杯中，加入200 mL的透析袋處理液，微波爐中預(yù)熱；3）將透析袋裝入其中，電爐上煮沸10 min；4）用蒸

46、餾水徹底洗滌；5）蒸餾水中煮10 min；6）冷卻后4存放，存放過(guò)程中透析袋應(yīng)完全放入0.01mol/L醋酸緩沖液（pH5.0）中；7）使用前用0.01mol/L醋酸緩沖液（pH5.0）清洗透析袋內(nèi)外；4.2 操作沉淀物溶于含0.5% NaCl 的0.01mol/L醋酸緩沖液（pH5.0）中，經(jīng)透析膜袋在20倍量的0.01mol/L醋酸緩沖液（pH5.0）中在4，24h透析脫鹽后，在20倍量的30%PEG6000中濃縮收集，冷藏備用。5.酶活力的測(cè)定參照實(shí)驗(yàn)二中的酶活測(cè)定。六、注意事項(xiàng)（1）硫酸銨飽和度計(jì)算及加入方式：在分段鹽析時(shí)，加鹽濃度一般以飽和度表示，飽和溶液的飽和度為100%。用硫酸銨

47、鹽析時(shí)常用溶液飽和度調(diào)整方法有2種。一種是當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液體積不大所需調(diào)整的濃度不高時(shí)，加入飽和硫酸銨溶液。配制法是加入過(guò)量的硫酸銨，熱至5060保溫?cái)?shù)分鐘，趁熱濾去沉淀，再生0或25下平衡12天，有固體析出時(shí)即達(dá)100%飽和度。鹽析所需飽和度可按下式計(jì)算： S2 - S1V=V0- 1 - S2式中V及V0分別代表所需飽和硫酸銨溶液及原溶液體積，S2和S1分別代表所需達(dá)到的和原溶液的飽和度。嚴(yán)格來(lái)說(shuō)，混合不同體積的溶液時(shí)，總體積會(huì)發(fā)生變化使上式造成誤差，但這由體積改變所造成的誤差一般小于2%，可忽略不計(jì)。另一種是所需達(dá)到飽和度較高而溶液的體積又不再過(guò)分增大時(shí)，可直接加固體硫酸銨，其加入量見(jiàn)附表。

48、（2）清洗透析袋內(nèi)外時(shí)，操作過(guò)程中應(yīng)使用鑷子或戴手套；（3）蛋白質(zhì)溶液用透析法去鹽時(shí)，正負(fù)離子透過(guò)半透膜的速度不同。以硫酸銨為例，NH4的透出較快.在透析過(guò)程中膜內(nèi)SO42-剩余而生成H2SO4，而使膜內(nèi)蛋白質(zhì)溶液呈酸性，足以達(dá)到使蛋白質(zhì)變性的酸度，因此在用鹽析法純化蛋白質(zhì)做透析去鹽時(shí)，開(kāi)始應(yīng)用0.1M的NH4OH透析，或者用緩沖液配制蛋白溶液。七、實(shí)驗(yàn)報(bào)告1.實(shí)驗(yàn)結(jié)果（1）記錄發(fā)酵過(guò)程中觀察到的現(xiàn)象；（2）測(cè)定粗酶液酶活；（3）記錄硫酸銨鹽析及透析脫鹽及濃縮的操作方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果；（4）測(cè)定透析后酶液的酶活力；2.思考題（1）本實(shí)驗(yàn)中硫酸銨飽和度的調(diào)整應(yīng)選用哪種方法方法，為什么？（2）透析時(shí)應(yīng)

49、注意什么才可達(dá)到盡量除去鹽類(lèi)，并防止蛋白質(zhì)變性？（3）透析時(shí)可否維持蛋白質(zhì)溶液的體積不改變？（4）在進(jìn)行蛋白質(zhì)透析時(shí)，為什么要用醋酸緩沖液溶解蛋白沉淀進(jìn)行透析，而不用蒸餾水進(jìn)行透析？實(shí)驗(yàn)四 淀粉酶的層析分離和純化一、目的和要求1.掌握層析法分離純化蛋白溶液的原理和方法；2.掌握蛋白質(zhì)分離純化的方法及其應(yīng)用；3.學(xué)習(xí)和掌握SDS-PAGE垂直板型電泳的基本原理和操作技術(shù)；4.掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測(cè)定蛋白質(zhì)相對(duì)分子量的實(shí)驗(yàn)技術(shù)；二、基本原理1.層析分離原理層析法是利用不同物質(zhì)理化性質(zhì)的差異而建立起來(lái)的技術(shù)。所有的層析系統(tǒng)都由兩個(gè)相組成：一是固定相，它或者是固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的

50、成分；另一是流動(dòng)相，即可以流動(dòng)的物質(zhì)，如水和各種溶媒。當(dāng)待分離的混合物隨溶媒（流動(dòng)相）通過(guò)固定相時(shí)，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對(duì)比）不同，而且隨溶媒向前移動(dòng)，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移動(dòng)的速度快。反之，與固定相相互作用越強(qiáng)的組份，向前移動(dòng)速度越慢。分部收集流出液，可得到樣品中所含的各單一組份，從而達(dá)到將各組份分離的目的凝膠層析又稱分子篩過(guò)濾、排阻層析等。支持物是人工合成的交聯(lián)高聚物，在水中膨脹后成為凝膠。凝膠內(nèi)為內(nèi)水層，凝膠周?chē)乃疄橥馑畬??？刂?/p>

51、交聯(lián)度以形成不同孔徑的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。交聯(lián)度小的孔徑大，交聯(lián)度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質(zhì)中小于孔徑的分子進(jìn)入，相對(duì)分子量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔而只能沿著凝膠顆粒間的空隙，隨著溶劑流動(dòng)，因此流程較短，向前移動(dòng)速度快而首先流出層析柱；相反，相對(duì)分子量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可自由地進(jìn)出凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下推移過(guò)程中，它們從凝膠內(nèi)擴(kuò)散到膠?？紫逗笤龠M(jìn)入另一凝膠顆粒，如此不斷地進(jìn)入與逸出，使流程增長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢而最后流出層析柱，而中等大小的分子，他們液能在凝膠顆粒內(nèi)外分布，部分進(jìn)入顆粒，從而在大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)之間被洗脫，這樣，經(jīng)過(guò)層析柱，混合物中的各物質(zhì)按其分子量大小大致分離成

52、不同的區(qū)帶。選擇不同規(guī)格的凝膠，可把一個(gè)混合物按分子量的差異分成不同的組分。2.蛋白質(zhì)凝膠電泳原理聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺（acrylamide,簡(jiǎn)稱Acr）單體和少量交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺（N,N-methylene- bisacylamide,簡(jiǎn)稱Bis）在化學(xué)催化劑過(guò)硫酸銨（ammonium persulfate,簡(jiǎn)稱AP）和加速劑四甲基乙二胺（N,N,N,N-tetramethyl ethylenedia mine,簡(jiǎn)稱TEMED）的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。聚合后的聚丙烯酰胺凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有濃縮效應(yīng)、電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)。在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中，SDS是一種陰離子表

53、面活性劑，在電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開(kāi)，并結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上，使各種蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物都帶上了相同密度的負(fù)電荷，其數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而掩蓋了不同種類(lèi)蛋白質(zhì)間原有的電荷差別，因此，蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而其他因素對(duì)電泳遷移率的影響幾乎何以忽略不計(jì)。若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量的對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率就可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。三、試驗(yàn)材料1.常用貯存液（1）透析袋處理液：碳酸氫鈉4g，EDTA 0.0744g溶解于200ml去離子水中；（2）凝膠層析洗脫液：稱取12.

54、11g三羥甲基氨基甲烷（Tris），一邊攪拌一邊加入到800ml去離子水中，然后以pH計(jì)實(shí)時(shí)檢測(cè)溶液pH值，用濃鹽酸調(diào)pH至5.8，用去離子水定容至1000ml。（3）SDS加樣緩沖液：稱取1.5g三羥甲基氨基甲烷（Tris），加入到84ml水中，用濃硫酸小心將pH值調(diào)至6.8，再加入40g甘油和0.02g溴酚蘭以及6ml的2-巰基乙醇，4存放；（4）分離膠緩沖液：稱取18.2g Tris，0.4g SDS，溶解在90ml重蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.8，加重蒸水至100ml；（5）濃縮膠緩沖液：稱取6.0g Tris，0.4g SDS，溶解在80ml重蒸水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至6.8，加重

55、蒸水至100ml；（6）電極緩沖液：稱取30.3g Tris，144g甘油和10g SDS，溶解在1L重蒸水中，室溫存放，用前用重蒸水作1：10稀釋；（7）0.1%考馬司亮蘭染色液：稱取0.5g考馬司亮蘭R-250，溶解在250ml的甲醇中，后加入去離子水200ml、冰醋酸50ml；（8）SDS-PAGE電泳脫色液：甲醇100ml與醋酸75ml以及825ml去離子水混溶；（9）30%丙烯酰胺貯液：稱取丙烯酰胺30g，雙叉丙烯酰胺0.82g，溶解在雙蒸水中，至100ml，于4保存；（10）10%SDS：10g SDS，加水定容至100ml，完全溶解后室溫保存；（11）10%過(guò)硫酸銨：0.1g過(guò)硫酸銨，加1ml蒸餾水溶解（現(xiàn)配）；2.酶活測(cè)定溶液參照實(shí)驗(yàn)二3.試劑可溶性淀粉、碳酸氫鈉、EDTA、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、濃鹽酸、濃硫酸、甘油、溴酚蘭、2-巰基乙醇、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）、考馬司亮蘭R-