腫瘤疫苗的作用機制及研究進展

1、腫瘤疫苗的作用機制及研究進展    【關鍵詞】  腫瘤；腫瘤免疫；腫瘤疫苗    0引言一直以來，對于腫瘤的治療多采用手術，放療和化療三大常規(guī)方法. 一百多年前，Caley用細菌疫苗免疫機體時，觀察到腫瘤縮小. 此后人們認識到腫瘤可以誘發(fā)免疫反應，而機體免疫系統(tǒng)對腫瘤也具有監(jiān)視作用. 腫瘤疫苗的產(chǎn)生正是基于這種認識，運用增強腫瘤特異性抗原的免疫原性的基本方法，誘發(fā)機體的抗腫瘤免疫應答，以達到縮小和消除腫瘤的目的.    1腫瘤特異性免疫機制及腫瘤的免疫逃逸機制腫瘤在機體內能引發(fā)體液免疫

2、應答和細胞免疫應答，而以后者為主. 腫瘤抗原在細胞內加工成肽段后與細胞表面的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex, MHC)類分子結合并呈遞給CD8+細胞毒性T淋巴細胞，或先從腫瘤細胞上脫落，再由抗原提呈細胞攝取、加工成肽段后與表面MHC類分子結合并呈遞給CD4+輔助性T淋巴細胞，進而誘發(fā)機體的抗腫瘤細胞免疫應答. 值得注意的是CD4+ T淋巴細胞和CD8+ T淋巴細胞的激活都需要MHC抗原肽復合物和免疫共刺激分子的協(xié)同刺激作用，而共刺激分子的缺失正是腫瘤引發(fā)的機體外周免疫耐受的可能機制之一. 腫瘤由于其極大的異質性和遺傳不穩(wěn)定性，在機體環(huán)境長

3、時間的免疫選擇壓力下，會啟動一系列的免疫逃避機制，對抗機體的抗腫瘤免疫反應. 這些機制分別針對T細胞對腫瘤的識別階段和效應階段，包括腫瘤抗原的丟失、MHC類分子表達下調、抗原加工缺陷、表達干擾細胞毒作用的蛋白酶及表達FasL等.    2腫瘤疫苗的設計策略    2.1總體思路針對腫瘤抗原在機體內免疫原性下降，造成特異性細胞免疫激活不足，外周免疫耐受的狀況，腫瘤疫苗設計策略的總體思路是應用各種技術，增強免疫系統(tǒng)對腫瘤抗原的識別能力，改善免疫微環(huán)境 ，引發(fā)有力的特異性抗腫瘤細胞免疫，阻止腫瘤進展，最終消除腫瘤.  &

4、#160; 2.2腫瘤細胞疫苗腫瘤細胞疫苗是將整個腫瘤細胞作為抗原導入患者體內，誘導特異性的抗腫瘤免疫應答. 由于腫瘤細胞帶有腫瘤的全部抗原，無需考慮分離腫瘤特異性抗原（tumor specific antigen, TSA），而且由于自體腫瘤細胞具有和正常組織相同的人類白細胞抗原，不會引發(fā)機體的免疫排斥反應，因此被認為是理想的腫瘤疫苗方案. 但是自體腫瘤組織來源十分有限，并且考慮到TSA的表達具有一定的組織特異性，因此這種方法的應用受到了限制. 后來，人們開始使用人工培養(yǎng)的同種異體腫瘤細胞系進行腫瘤疫苗的研究. 不同腫瘤細胞的混合能夠提供一系列的TSA，有利于增加腫瘤疫苗的免疫原性，減小其發(fā)

5、生抗原丟失的幾率. 但是，單獨使用自體或異體的腫瘤細胞難以產(chǎn)生足夠強度的免疫應答，免疫佐劑的使用極大地改善了這種情況. 隨著基因工程的進展，人們開始對腫瘤細胞進行基因修飾，將編碼免疫共刺激分子如CD80，CD86的基因，導入腫瘤細胞中，為T細胞活化提供第二信號，有效地打破了腫瘤的外周免疫耐受. 近年來，也有人將編碼一些細胞因子如IL2， IL12，粒巨噬細胞集落刺激因子（granulocytcmacrohage colony stimulatihy factor,GMCSF）等的基因導入腫瘤細胞，期望通過細胞因子蛋白的表達，改善腫瘤組織局部免疫微環(huán)境，增強T細胞的抗腫瘤免疫效應. 然而，近些年

6、來臨床實驗表明，即使在實驗中能夠誘發(fā)滿意免疫反應的腫瘤細胞疫苗，在轉化成臨床有效的治療性腫瘤疫苗時都遇到了困難. Fifis等5的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠結腸癌細胞系經(jīng)體外培養(yǎng)后免疫同源小鼠，引發(fā)了免疫反應和腫瘤保護效應. 然而，當他們對荷瘤小鼠進行同樣處理時，卻大大促進了腫瘤的生長，提示腫瘤細胞能夠通過一系列機制抑制機體的抗腫瘤免疫反應，包括分泌免疫抑制因子IL10，腫瘤生長因子阻止有效的免疫反應；分泌血管內皮細胞生長因子，GMCSF等因子活化具有免疫抑制作用的骨髓源性細胞；激活特異的調節(jié)性CD4+CD25+T細胞以下調細胞毒性T淋巴細胞的效應等.    2.3腫瘤抗原疫

7、苗腫瘤能夠引起機體特異性免疫反應的現(xiàn)象引發(fā)了對腫瘤抗原的研究. 腫瘤抗原包括多個層次：完整的蛋白質分子、抗原肽及純化的DNA. 關于腫瘤DNA疫苗，下文將另行討論. 目前將腫瘤抗原分為TSA和腫瘤相關抗原（tumorassociated,TAA）. TSA是指只存在于腫瘤細胞，而TAA并非腫瘤細胞特有的抗原，只是在發(fā)生腫瘤時此類抗原的表達明顯上調. Tabi等認為，腫瘤抗原必須在全部或大多數(shù)患有相同腫瘤患者的大部分腫瘤細胞中呈普遍的高表達狀態(tài). 他將腫瘤抗原分為5類： 突變抗原； 腫瘤細胞過度表達抗原； 癌睪抗原; 組織特異性分化抗原； 病毒抗原.    單獨應用

8、腫瘤抗原蛋白存在免疫原性差的問題，這是由于腫瘤細胞可通過抗原、HLA缺失等機制發(fā)生逃逸. 劉宏利等6結合了肽疫苗和DNA疫苗各自的特點，以P815腫瘤細胞的CTL表位（P815A3543）為模型，合成該表位加多聚賴氨酸的顆粒性多肽，并制備含有編碼此表位和GMCSF基因的表達質粒，制成了新型的顆粒性肽DNA復合疫苗，這種疫苗利于APC的攝取加工，可誘導有效的CTL應答，從而預防小鼠致命性P815腫瘤細胞攻擊，并可部分根除腫瘤.    超抗原能夠激活全部攜帶T細胞抗原識別受體V片段的T細胞,激活的T細胞克隆數(shù)約是普通抗原的1000倍,產(chǎn)生強大的殺傷靶細胞的作用. 馬文

9、學等7用已構建的重組跨膜型超抗原的表達載體pET28aTMSEA轉化E.coli BL21(DE3)pLysS宿主菌,并誘導其表達跨膜型超抗原融合蛋白，實驗結果顯示，跨膜型超抗原融合蛋白能夠錨定在腫瘤細胞膜上，顯著抑制荷瘤小鼠腫瘤的生長，并延長其生存期,為腫瘤抗原疫苗的研究提供了新思路.    熱休克蛋白（heat shock protein, HSPs）作為細胞內的分子伴侶，通過其多肽結合結構域與一系列腫瘤相關抗原形成復合物，同時HSPs通過HSP受體CD91和LOX1介導被APC攝取8-9，于是，將腫瘤抗原與HSPs在基因或蛋白水平進行連接，可使機體提高特異性

10、和非特異性抗腫瘤免疫的水平. 自體腫瘤HSPgp96抗原肽疫苗已進入臨床期，但是由于這種疫苗具有很強的個體特異性，因此只對同源腫瘤起作用，而且由于自體腫瘤HSP抗原肽復合物需要從腫瘤患者體內提取，來源受到了很大限制. 目前研究方向是體外合成HSP抗原肽疫苗，如將HSP與肽或全蛋白進行連接；將HSP的DNA與抗原DNA連接后表達融合蛋白10；或將HSP基因直接注入腫瘤細胞提高其免疫原性11.    獨特型(idiotype，Id)單抗原顯著優(yōu)點在于它能引發(fā)針對相應自身抗原的體液免疫應答，抗Id的抗體(Ab2)能夠模擬TAA，并作為TAA的內影像誘發(fā)抗腫瘤免疫. Ch

11、ang等12研究了小鼠抗獨特型mAb MK223模擬人類高分子量黑色素瘤相關抗原（HMWMAA）的結構基礎，發(fā)現(xiàn)MK223重鏈的互補決定區(qū)（CDR）3（H3）、輕鏈的CDR1（L1）在三維結構上緊密相連，該區(qū)域的部分氨基酸序列與HMWMAA核心蛋白的相似折疊區(qū)具有同源性，同時發(fā)現(xiàn)組成MK223 H3環(huán)的15氨基酸殘肽在體內和體外均可與HMWMAA引發(fā)相似的免疫反應. 抗Id抗體已進入臨床研究階段，在淋巴瘤、結腸癌、乳腺癌、黑色素瘤的治療中表現(xiàn)出了較好效果. CD55是表達在結直腸癌細胞表面的糖蛋白，可保護腫瘤細胞免受補體的攻擊，Ullenhag等13用模擬CD55的人類抗Id mAb 105A

12、D7對67例結直腸癌患者進行了免疫，大多數(shù)患者在酶聯(lián)免疫斑點試驗和免疫細胞增殖反應中表現(xiàn)出了抗腫瘤免疫反應.    2.4腫瘤DNA疫苗腫瘤DNA疫苗的原理就是將編碼腫瘤特異性抗原的裸DNA分子直接注入機體或者經(jīng)載體攜帶后注入機體，腫瘤DNA被體內腫瘤細胞或正常細胞識別并攝入，在細胞內表達腫瘤特異性抗原，引發(fā)機體持久的細胞和體液免疫. 腫瘤DNA疫苗由質粒DNA骨架、抗原DNA和真核細胞基因調控序列組成.    腫瘤特異性DNA分子在體內被肌肉、皮膚、黏膜等易感處的細胞攝取后，表達出抗原蛋白，經(jīng)加工處理后與MHC分子結合呈遞于細胞表面

13、，激活CD8+T細胞，刺激CTL的形成和分化，產(chǎn)生細胞免疫作用；還有一部分抗原蛋白分泌至細胞外，被抗原提呈細胞吞噬加工后與MHC分子共同表達于細胞表面，呈遞給CD4+T細胞，激活體液免疫應答14-15. DNA疫苗不僅激活了腫瘤特異性體液免疫應答，產(chǎn)生了大量抗體，還激活了被認為是         人體抗腫瘤免疫關鍵細胞的CD8+T細胞16，這無疑是腫瘤DNA疫苗的一大優(yōu)勢. 而且由于DNA疫苗分子進入人體后才開始其抗原蛋白的合成表達，因此DNA疫苗能夠模擬病毒感染的自然過程，合成蛋白被降解加工，作為內源性分子由MH

14、C分子提呈給CD8+T細胞，激活強有力的細胞免疫應答，較之腫瘤抗原肽進入人體經(jīng)APC加工提呈給CD4+T細胞，再激活體液免疫要有效得多. 同時，攜帶腫瘤抗原基因的質粒DNA可長期在宿主細胞內控制表達腫瘤抗原蛋白，因此具有長期持續(xù)的效果，有望使機體獲得持久的抗腫瘤免疫功能.    Niethammer等17用攜帶編碼癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）基因的沙門氏菌感染小鼠，聯(lián)合抗體IL2融合蛋白，觀察到MHC的表達，大量CD8+T細胞被激活，100%的小鼠皮下腫瘤完全消除，75%的小鼠肺轉移得到抑制. CD2，CD25，CD28以

15、及CD48，CD80水平的明顯上調表明CTL和負責抗原提呈的DCs在接受DNA疫苗的免疫刺激后得到了有效的激活. 然而在臨床研究中，DNA腫瘤疫苗沒有達到令人滿意的效果. Conry等18用表達CEA和HBV表面抗原的質粒DNA免疫17例結腸癌轉移患者，未見明顯的臨床變化，患者產(chǎn)生針對CEA的淋巴細胞增殖但未檢測到CEA特異性抗體. 然后,人們對DNA疫苗做了一系列改進，主要從遞送系統(tǒng)和免疫佐劑兩方面加強質粒DNA的免疫原性. 基因槍運載質粒DNA的效率遠遠高于普通注射器和生物注射器，在 Trimble等19對此進行的比較中，基因槍運載質粒DNA的方法誘導出了最多的CD8+T細胞和最佳的抗腫瘤

16、免疫反應. 由于這種途徑能直接轉染組織局部的Langerhans細胞20，因此誘導免疫所需要的質粒DNA用量可大大減少，同時，免疫佐劑也被用于質粒DNA. 研究證明，將編碼細胞因子、細菌毒素、蛋白佐劑的DNA 與攜帶抗原基因的質粒DNA有機融合后，能加強質粒DNA的免疫原性21. 然而，Lima等22的研究發(fā)現(xiàn),用CEA和GMCSF融合DNA疫苗免疫小鼠后，高劑量組CEA引發(fā)的特異性體液和細胞免疫得到大大激活，但同時也產(chǎn)生了大量抗GMCSF的自身抗體，而用單獨的CEA DNA疫苗免疫小鼠，腫瘤生長被完全抑制. 這提示腫瘤抗原基因和細胞因子基因的融合疫苗在增強疫苗免疫效能的同時打破了機體對于細胞

17、因子的免疫耐受,從而降低細胞因子的免疫佐劑功能,甚至可能對致敏宿主造成長期的損害22.除了質粒DNA外,病毒載體的DNA疫苗也進入了臨床研究階段. 病毒載體的DNA疫苗有更強的激活固有免疫反應的能力，通過TLR依賴和非依賴途徑募集和活化抗原特異性T細胞，同時病毒載體激活的炎癥信號能夠影響IFN1依賴的CD8+T細胞的局部擴增和免疫記憶的形成. 最常用的病毒載體是重組腺病毒和重組痘病毒載體23，重組腺相關病毒、病毒、口腔泡狀病毒、單純皰疹病毒還處于早期研究階段. ATP依賴的抗原呈遞相關轉運蛋白（TAP1）在抗原直接提呈給CD8+T細胞和外源性抗原在樹突狀細胞（DCs）中交叉提呈的過程中發(fā)揮著重

18、要作用. 由于TAP1在腫瘤細胞中表達極度低下，腫瘤細胞表面抗原的表達缺失造成其極易發(fā)生免疫逃逸. Lou等24給惡性黑色素瘤小鼠注射編碼人TAP1的重組不復制腺病毒，誘導出了有效的抗腫瘤CTL反應，腫瘤浸潤性的DCs細胞增加，記憶性T細胞亞類增多，動物存活期延長. 而在此病的研究中，攜帶表達MAGE1和MAGE3迷你基因的重組ALVAC在30例黑色素瘤患者中僅有1例出現(xiàn)免疫反應，2例病情穩(wěn)定25 . 這可能與患者血清中存在的抗病毒載體的抗體有關.    2.5樹突狀細胞（dendritic cell, DCs）腫瘤疫苗DCs是體內最強大的專職抗原提呈細胞，它能夠

19、識別、捕獲、加工、提呈抗原引發(fā)初始免疫反應. 將TAA直接導入DCs，使其發(fā)揮提呈抗原并激活T細胞的功能，成為腫瘤免疫治療的有效途徑. 方法有用腫瘤細胞裂解產(chǎn)物、腫瘤抗原蛋白、腫瘤抗原多肽、合成腫瘤抗原肽沖擊DCs細胞，或用腫瘤來源的RNA沖擊DCs，也可以將腫瘤細胞與DCs細胞進行融合，或用腫瘤抗原病毒載體轉染DCs.    近年來，熱休克蛋白抗原肽復合物激活DCs誘導抗腫瘤免疫受到了廣泛關注. HSP70抗原肽復合物負載的DCs比單獨用抗原肽或HSP負載的DCs能更有效地激活細胞、抑制腫瘤生長，而且HSP輔助提呈腫瘤抗原時使用更小量的抗原肽26. Moran等

20、27將委內瑞拉馬腦炎病毒復制子轉染DCs細胞，用其免疫過表達neu原癌基因蛋白的荷瘤小鼠，結果轉基因高水平表達，DCs細胞成熟并分泌前炎癥因子，誘導活化NEU特異性CD8+T細胞，產(chǎn)生抗NEU的IgG抗體. 有趣的是，耗竭小鼠CD4+T細胞而非CD8+T后，T細胞完全失去了抑制腫瘤生長的能力，提示CD4+T細胞在腫瘤生長抑制中發(fā)揮了重要作用. 腫瘤組織來源的RNA轉染DCs被證明具有強大的抗原性、更多的作用靶點和更高的安全性，經(jīng)過一系列動物實驗，目前已進入臨床研究. Su等28將PSA mRNA轉染DCs，免疫治療轉移性前列腺癌，檢測了患者外周血PSA水平和癌細胞數(shù)量，證明疫苗可引起有效的抗原

21、特異性免疫反應，未見明顯毒副作用.    3問題與展望隨著對腫瘤免疫機制研究的深入，腫瘤疫苗成為臨床預防和治療腫瘤有效方法的趨勢日益明顯. 盡管腫瘤疫苗的有效性在動物實驗中取得了振奮人心的效果，但其在臨床研究中的治療結果尚未令人滿意. 如何尋找和篩選有效的腫瘤抗原，激活機體的細胞和體液免疫應答；如何打破機體對腫瘤的外周耐受從而更有效的行使其免疫監(jiān)視功能；如何改善免疫微環(huán)境，減少腫瘤對機體免疫反應的抑制；以及后續(xù)腫瘤疫苗進入機體的有效途徑，免疫方法等均需要進一步的研究. 使用佐劑、細胞因子及其它有效的方法，如利用DCs強大的抗原提呈能力，大大增加了腫瘤疫苗的免疫原性

22、；抗腫瘤T細胞的活化需要雙信號，共刺激分子B7通過激活T細胞表面的CD28分子活化免疫反應，通過激活細胞溶解性T淋巴細胞相關抗原4（CTLA4）分子則抑制免疫反應，有人已設想通過阻斷T細胞表面的CTLA4以利于腫瘤殺傷性T細胞克隆的激活；近年來CD4+CD25+自身調節(jié)T細胞（Treg）在腫瘤免疫中的抑制作用受到了關注，如何拮抗Treg細胞對抗腫瘤免疫的抑制，優(yōu)化局部免疫微環(huán)境，從而活化免疫細胞識別、排斥腫瘤的作用也是研究的方向. 有研究證明，不同的疫苗接種途徑及程序會對腫瘤疫苗的治療效果產(chǎn)生有意義的影響，據(jù)此尋找最佳的免疫程序，發(fā)揮腫瘤疫苗的優(yōu)勢也值得研究. 此外，實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤疫

23、苗對早期腫瘤、手術切除腫瘤或經(jīng)放化療已明顯縮小的腫瘤具有更好的治療效果，提示將腫瘤疫苗與手術、化療、放療及移植等手段結合起來應用，以達到滿意的治療效果.    隨著基礎研究和臨床試驗進一步的開展，我們對腫瘤疫苗的認識也將更加深入，有理由相信，新的安全、有效、抗原性更強、適應范圍更廣的腫瘤疫苗終將為廣大腫瘤患者帶來福音.【參考文獻】  林文棠，朱平. 臨床免疫學M. 西安:第四軍醫(yī)大學出版社，2002：100-102.Tabi Z, Man S. Challenges for cancer vaccine developmentJ. Adv Drug De

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