轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展.docx

1、DOI：10.3969/j.issn.1005-1678.2017.06.169轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)研究進(jìn)展洪奇陽(yáng)'，畢行建2,王大寧I李子真二命海頃夏寧邵3,李少偉12(1.廈門(mén)大學(xué)國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心生命科學(xué)學(xué)院，福建廈門(mén)361102；2.廈門(mén)大學(xué)分子疫苗學(xué)與分子診斷學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室公共衛(wèi)生學(xué)院，福建廈門(mén)361102)摘要伴隨高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)技術(shù)在各個(gè)研究領(lǐng)域已經(jīng)得到廣泛的運(yùn)用。RNA-Seq通過(guò)分析不同細(xì)胞或者組織轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況來(lái)揭示細(xì)胞的基因表達(dá)情況，結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和調(diào)控規(guī)律。近年來(lái)基于高通量測(cè)序技術(shù)的RNA-Seq分析方法發(fā)展迅

2、速，涌現(xiàn)出一大批相關(guān)的分析方法和工具，如何根據(jù)實(shí)際需求選擇合適的工具和分析流程，成為廣大科研人員面臨的問(wèn)題。本文參照近幾年在RNA-seq技術(shù)研究領(lǐng)域發(fā)表的文獻(xiàn)，綜述了RNA-Seq應(yīng)用實(shí)際過(guò)程中涉及的分析方法、軟件工具及其選用標(biāo)準(zhǔn)，為相關(guān)的研究和應(yīng)用提供信息和參考。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)錄組；高通量測(cè)序；數(shù)據(jù)處理與分析中圖分類(lèi)號(hào)S813：S8X)5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼AResearchprogressonRNA-SeqtechnologyHONGQi-yang1,BIXing-jian2,WANGDa-ning*,LIZi-zhen1,YUHail,2A,XIANing-shao1*2,LIShao-wei1(1.

3、NationalInstituteofDiagnosticsandVaccineDevelopmentinInfectiousDisease,SchoolofLifeSciences,XiamenUniversity,Xiamen361102,China；2.StateKeyLaboratoryofMolecularVaccinologyandMolecularDiagnostics,schoolof.PublicHealth,XiamenUniversity,Xiamen361102,China)AbstractWiththeremarkableadvancesofhigh-throughp

4、utsequencingtechnology,transcriptomesequencing(RNA-Seq)technologyhasbeenwidelyusedinvariousresearchfields.RNA-Seqcandisclosegeneexpressionspectrum,structurefeatureandregulationnetworkinlivecellsbydifferentialRNA-Seqonwholecellsindifferentconditionsorfromdistincttissues.Whiletherapidapplicationofhigh

5、-throughputsequencingtechnology,therearealargenumberofemerginganalyticalmethodsandtoolsfbrRNA-Seq,whichsometimespuzzlestheresearchershowtomakeachoiceonanappropriatealgorithmanalysisandcorrespondingtool.Here,theanalyticalmethods,softwaretoolsandselectioncriteriaforpracticalRNA-Seqanalysiswerereviewed

6、intheliterature,andthenprovideinformationandinsightsforrelatedresearchandapplication.Keywordstranscriptome;highthroughputsequencing；dataprocessingandanalysis近年來(lái)，隨著轉(zhuǎn)錄組學(xué)與高通量測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)在研究生物體表型和基因表達(dá)方面占據(jù)了重要的地位。在眾多的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法中，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)以新一代高通量測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)，具備測(cè)序通量高、速度快、價(jià)格低、信噪比高等優(yōu)勢(shì)，目前已超越傳統(tǒng)的基于雜交技術(shù)的芯片法和基

7、于一代Sanger測(cè)序的SAGE、MPSS、全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)、EST文庫(kù)等方法，成為轉(zhuǎn)錄組分析的主要手段。轉(zhuǎn)錄組從廣義上是指特定條件下單個(gè)細(xì)胞或者細(xì)胞群體所轉(zhuǎn)錄的所有RNA集合，包括編碼蛋白的mRNA和一些功能性的RNA,如rRNA、miRNA、ncRNA、tRNA等，從狹義上則單指編碼蛋白的mRNA。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)通過(guò)將樣本中提取的總體RNA反資助項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金(81571996)作者簡(jiǎn)介：洪奇陽(yáng)，男，碩士在讀，研究方向：生物信息學(xué)，E-mail：qiyanghong2020;俞海,通信作者，男，博士,副教授,研究方向：生物信息學(xué)|E-mail：yuhaio轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行高通量

8、測(cè)序來(lái)確定樣品中整體轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)情況。2005年以來(lái)，以Roche公司的454技術(shù)Jllumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLiD技術(shù)為代表的新一代測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)改變了以往基于雜交技術(shù)和Sanger測(cè)序技術(shù)的低效轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析方法，使得一次的測(cè)序就能實(shí)現(xiàn)快速、大批量轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)，同時(shí)也極大的擴(kuò)充了轉(zhuǎn)錄組分析的應(yīng)用范圍?，F(xiàn)階段的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序應(yīng)用包括轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)研究、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究、基因表達(dá)水平研究、非編碼區(qū)域功能研究、低豐度全新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)等。根據(jù)不同的研究目的，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相關(guān)的分析方法和流程不盡相同,需要研究者根據(jù)實(shí)際情況選擇適宜的分析方法來(lái)開(kāi)展研究工作。目前基本的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析流程可

9、分為為實(shí)驗(yàn)沒(méi)汁與上機(jī)、數(shù)據(jù)預(yù)處理、序列定位與轉(zhuǎn)錄本識(shí)別、轉(zhuǎn)錄本定量與功能分析、差異基因表達(dá)分析、差異基因功能注釋。本文將圍繞RNA-Seq基本的分析流程綜述各步驟的分析方法進(jìn)展、相關(guān)軟件以及需要注意的事項(xiàng)，為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的普及和應(yīng)用提供有利的參考。1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與上機(jī)過(guò)去的十年中，高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，隨著各種測(cè)序平臺(tái)不斷更新，測(cè)序時(shí)間、測(cè)序成本已經(jīng)顯著下降，測(cè)序通量和準(zhǔn)確度顯著提高。現(xiàn)有的高通量測(cè)序方法可分為邊連接邊測(cè)序(sequencingbyligalion,SBL,BGI公司)、邊合成邊測(cè)序(sequencingbysynthesis,SBS,Illumina公司)、單分子實(shí)時(shí)測(cè)序(s

10、ingle-moleculereal-timesequencing,PacBio公司)和依賴(lài)于已有短讀長(zhǎng)技術(shù)在計(jì)算機(jī)內(nèi)構(gòu)建長(zhǎng)讀長(zhǎng)的合成法(constructlongreadsinsilico,Illumina公司)。其中Illumina公司的測(cè)序平臺(tái)技術(shù)最為成熟、穩(wěn)定性高、數(shù)據(jù)可靠、平臺(tái)間交叉性互補(bǔ)性好，其市場(chǎng)份額也最大。但I(xiàn)llumina測(cè)序平臺(tái)由于采用單一的測(cè)序方法，可能產(chǎn)生的系統(tǒng)偏好性問(wèn)題也不容忽視。在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中，需要根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠淼倪x擇實(shí)驗(yàn)樣本。此外根據(jù)高通量測(cè)序自身特點(diǎn)在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要注意的地方包括:單端或雙端測(cè)序的選擇。單端測(cè)序成本較低，能滿(mǎn)足注釋完整的基因組大

11、部分后期分析需求，對(duì)于注釋不完整的基因組則選用雙端測(cè)序效果更好"。mRNA的提取方法。細(xì)胞內(nèi)90%以上的RNA都是rRNA,真核生物mRNA在3,端具有poly(A)結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)這個(gè)特點(diǎn)使用Oligo(dT)富集mRNA,而原核生物由于不具備polyA則需通過(guò)去除rRNA的方式來(lái)獲取mRNA。無(wú)論是真核還是原核細(xì)胞，對(duì)于樣本量較少的樣本則統(tǒng)一采用去除rRNA的方法，以減少mRNA的損失。測(cè)序深度或庫(kù)大小。測(cè)序深度越深識(shí)別的轉(zhuǎn)錄本越多,定量也越準(zhǔn)確，但過(guò)多的測(cè)序量也會(huì)帶來(lái)噪音導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄本的錯(cuò)誤檢測(cè)，潼慎的做法是使用飽和曲線(xiàn)來(lái)評(píng)估合適的測(cè)序深度。一般情況下，可以根據(jù)基因組大小取其三倍的有

12、效測(cè)序數(shù)據(jù)，如人類(lèi)基因組大小3G,測(cè)序數(shù)據(jù)量以812G為宜。基于鏈特異文庫(kù)獲取的測(cè)序數(shù)據(jù)能區(qū)分正反鏈，可減少后續(xù)分析的復(fù)雜度并提升分析準(zhǔn)確度，但價(jià)格較高讀長(zhǎng)越長(zhǎng)對(duì)后續(xù)的定位和轉(zhuǎn)錄本識(shí)別越有利。生物學(xué)重復(fù)數(shù)不應(yīng)該少于3個(gè),足夠的生物學(xué)重復(fù)是后期統(tǒng)計(jì)學(xué)分析的前提。注意批次效應(yīng)，無(wú)論是樣品還是測(cè)序儀，不同的批次產(chǎn)生的數(shù)據(jù)都會(huì)存在偏差，需要在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)避免0當(dāng)樣本量過(guò)多或者其他原因?qū)е虏坏貌环峙螠y(cè)序時(shí)，應(yīng)在測(cè)序操作過(guò)程盡可能減少操作差異性，并對(duì)測(cè)序后的數(shù)據(jù)使用批次矯正方法，如COMBATc，11uJcARSyN121o2數(shù)據(jù)預(yù)處理測(cè)序產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)是一系列以fastq格式存儲(chǔ)的讀段(Read),其中

13、包含了堿基質(zhì)量信息和相關(guān)測(cè)序信息，如測(cè)序儀器名稱(chēng),單雙端，正反鏈等。原始數(shù)據(jù)在建庫(kù)過(guò)程或者測(cè)序過(guò)程中由于多方面的因素，例如污染、錯(cuò)誤操作、測(cè)序平臺(tái)等，常常會(huì)存在低質(zhì)量或者錯(cuò)誤數(shù)據(jù)。如果不對(duì)這些存在問(wèn)題的數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，對(duì)后續(xù)分析(例如讀段組裝、定位和定量等)的質(zhì)量和可信度將會(huì)產(chǎn)生很大影響。目前數(shù)據(jù)過(guò)濾中常用的質(zhì)控軟件是FastQC和NGSQCI3,其中FastQC是Illumina平臺(tái)上最常用的軟件,NGSQC13J則被用于更多平臺(tái)。其他的質(zhì)控軟件有Qualimap2U4，HTQCW,QC.chain16,almostSignificanf17,fastq_clean18,FaQCs19-等。數(shù)

14、據(jù)預(yù)處理階段包含的檢測(cè)內(nèi)容為測(cè)序質(zhì)量、GC含量、接頭、過(guò)表達(dá)的k-mers和重復(fù)序列等。根據(jù)這些檢測(cè)結(jié)果可以對(duì)原始數(shù)據(jù)集進(jìn)行低質(zhì)量讀段去除，切除部分低質(zhì)量的堿基，去除接頭，去除重復(fù)序列和過(guò)短序列等操作。相應(yīng)的常用的軟件為FASTX.Toolkit(Version0.0.14)20J和Trimmomatic(Version0.36)2,o值得注意的是越靠近讀段的3'端，堿基質(zhì)量會(huì)越差，這是由于測(cè)序策略引起的，和長(zhǎng)時(shí)間PCR引入雜信號(hào)和酶活力衰減有關(guān)】。另外,VictorKunin等】在研究E.coli的16S核糖體時(shí)發(fā)現(xiàn),5糖端的幾個(gè)起始?jí)A基ATGC比例常會(huì)存在較大波動(dòng)，這是由于聚合前誤

15、讀導(dǎo)致，但不會(huì)對(duì)后續(xù)分析產(chǎn)生太大影響。3讀段定位在獲得預(yù)處理過(guò)的原始數(shù)據(jù)后，需將讀段定位到參考基因組上(無(wú)參考基因組的物種,則需要先將讀段組裝成scaffolds,作為參考序列，常用軟件為T(mén)rinity：24】)，這是后續(xù)數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)E】。RNA在原核生物中只是簡(jiǎn)單的基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，能與基因一一對(duì)應(yīng)。但在真核生物的基因組中可能存在RNA的可變剪接，即單個(gè)基因產(chǎn)生的pre-mRNA通過(guò)不同的剪接形式形成多種mRNA異構(gòu)體(isoforms),而來(lái)自這些異構(gòu)體的讀段有可能跨越兩個(gè)外顯子，常常無(wú)法定位到參考基因組上。按照是否考慮可變剪接可將現(xiàn)有讀段定位軟件分為兩類(lèi)：第一類(lèi)軟件用于處理具有可變剪接的

16、情況，這類(lèi)軟件首先采用常規(guī)的比對(duì)方法將讀段定位到基因組上，對(duì)于無(wú)法成功定位的讀段嘗試將其分割后再重新與基因組定位，同時(shí)記錄分割信息為后續(xù)的轉(zhuǎn)錄本查找提供依據(jù)，相關(guān)的軟件為Hisat226!,HPGAligner”】,STAR：28,TopHat229和MapSplice刈o(hù)I.Medina等利用多套測(cè)序數(shù)據(jù)分別對(duì)這幾款軟件從單端、雙端、讀段長(zhǎng)度、分析數(shù)據(jù)量、靈敏度等方面進(jìn)行了綜合評(píng)估，研究發(fā)現(xiàn)在讀段長(zhǎng)度較短時(shí)(測(cè)試讀段為100bp)Hisat2的定位速度和準(zhǔn)確度最優(yōu)，當(dāng)讀段為長(zhǎng)片段時(shí)(測(cè)試讀段為100bp)HPGAligner表現(xiàn)最優(yōu)。第二類(lèi)軟件不考慮可變剪接的情況，這類(lèi)軟件直接把讀段定位到參

17、考基因組上，不對(duì)讀段進(jìn)行分割，此類(lèi)方法的優(yōu)勢(shì)是速度快。當(dāng)參考基因組的注釋信息比較完整時(shí)，還可以直接提取感興趣的完整轉(zhuǎn)錄組序列作為參考序列，使用此類(lèi)軟件進(jìn)行讀段定位，可以節(jié)省分析成本。常用的軟件有bowtie2m、BWA、"、NovoAlign33Smalt'34】和Stampy"。SubaziniThankaswamy-Kosalai等頃】采用五種不同物種，在不同讀段長(zhǎng)度和數(shù)據(jù)量的測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)這五款軟件從定位敏感度、定位速度、串聯(lián)重復(fù)對(duì)準(zhǔn)確定位的影響等方面進(jìn)行了綜合評(píng)估，結(jié)果顯示在運(yùn)算速度上最快的是BWA,其次是bowtie2和Smalt,在定位敏感度上，五款軟件對(duì)于

18、長(zhǎng)讀段(>lOObp)都表現(xiàn)良好,NovoAlign則無(wú)論讀段長(zhǎng)短都有較優(yōu)的表現(xiàn)。在RNA-Seq的實(shí)際應(yīng)用中最常用的是bowtie2,因其對(duì)插入、缺失和錯(cuò)誤堿基的容錯(cuò)率較好】，上述第一類(lèi)軟件中的Hisat2和TopHat2也是基于bowtie開(kāi)發(fā)的。讀段定位后產(chǎn)生的文件為文本形式的SAM文件或者其二進(jìn)制形式的BAM文件°對(duì)讀段定位效果的質(zhì)控能夠發(fā)現(xiàn)測(cè)序過(guò)程、樣本提取過(guò)程和建庫(kù)過(guò)程的錯(cuò)誤，而這類(lèi)錯(cuò)誤只能在讀段定位后才能被發(fā)現(xiàn)。讀段定位效果的重要質(zhì)控指標(biāo)是定位率，在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中一般預(yù)期70%的讀段能夠定位到基因組上，對(duì)于包含大量質(zhì)粒表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組分析,30%以上定位率也在可接受范圍

19、之內(nèi)如果單個(gè)讀段被定位到多個(gè)位置上(multimappingreads)，則提示重復(fù)序列和同源基因的存在，在后續(xù)的分析過(guò)程中這類(lèi)序列往往會(huì)被丟棄，避免其對(duì)定量分析產(chǎn)生干擾。另一個(gè)重要的質(zhì)控指標(biāo)是定位的均一度，如果讀段在內(nèi)含子區(qū)或者基因間區(qū)有過(guò)多異常分布情況那么很有可能建庫(kù)過(guò)程存在問(wèn)題或者樣本受到污染瑚。常用的質(zhì)控軟件包括Picard.RSeQC、Qualimap：40】、FastQC4,、SAMStatt42、RNA-SeqQC(431和QuaCRS；44)o各種質(zhì)控軟件都各有所長(zhǎng)，例如SAMStat能對(duì)讀段定位情況做更深入分析，區(qū)分未定位、較差定位和精確定位讀段;RSeQC能對(duì)已知、半已知、

20、新發(fā)現(xiàn)的剪接情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析;Qualimap的圖形化展示效果最直觀(guān)等，因此綜合使用這些軟件能夠?qū)崿F(xiàn)更全面的質(zhì)控?；谶@一理念,QuaCR對(duì)三款質(zhì)控軟件RNA-SeQC,RSeQC和FastQC進(jìn)行了整合，使讀段定位后的質(zhì)控更加全面和易于操作。4轉(zhuǎn)錄本識(shí)別與定量讀段定位到基因組后，根據(jù)讀段在轉(zhuǎn)錄本上的分布情況對(duì)基因表達(dá)豐度進(jìn)行定量。轉(zhuǎn)錄本分布信息可從基因組的注釋文件中獲取,或者根據(jù)讀段定位情況識(shí)別新的轉(zhuǎn)錄本。注釋完整的基因組(如人、老鼠和斑馬魚(yú))往往不需要進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本識(shí)別，可直接進(jìn)行基因定量分析皿】。但對(duì)于注釋信息并不完整的基因組則需要進(jìn)行新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)。在RNA-Seq分析中，根據(jù)短讀段識(shí)別

21、新轉(zhuǎn)錄本是最具挑戰(zhàn)性的分析之一。，因?yàn)槎套x段很少能夠跨越多個(gè)剪接位點(diǎn)，而且不同轉(zhuǎn)錄本間存在各種外顯子共享情況，外顯子中也存在共享序列的情況，同時(shí)現(xiàn)階段去除核糖體RNA的方法存在偏好性,導(dǎo)致讀段分布不均一心】，給讀段定位造成很大干擾。為了應(yīng)對(duì)這些挑戰(zhàn)，研究人員開(kāi)發(fā)了大量的轉(zhuǎn)錄本識(shí)別軟件:Stringtie.cufflinks48,CIDANEf49j、GRIT俱、TransComb""、iReckon"2】、SLIDE'")'Montebello'54】、Augustus、IsoLasso56】、§0向也此、Traph弱、

22、MITIE、CLASS和FlipFlop等。目前使用最為廣泛的是cufflinks,但KatharinaE.Hayer等在綜合分析了上述軟件中的幾款后，認(rèn)為StringTie識(shí)別轉(zhuǎn)錄本的準(zhǔn)確性高最高,其次是Cufflinks,然而研究結(jié)果提示所有的轉(zhuǎn)錄本識(shí)別方法都并不精確。最近StefanCanzar等發(fā)表了新的轉(zhuǎn)錄本識(shí)別方法CIDANE,其轉(zhuǎn)錄本識(shí)別能力優(yōu)于StringTie.Cufflinks.GRIT.MITIE和iReckon等常用軟件。目前新轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)仍然是一項(xiàng)難題，各種預(yù)測(cè)軟件間也存在顯著的不一致性，而提高讀段、讀長(zhǎng)是解決這一難點(diǎn)的突破口0轉(zhuǎn)錄本定量包括對(duì)基因的表達(dá)量定量和對(duì)轉(zhuǎn)錄

23、本表達(dá)量的定量，這是RNA-Seq實(shí)驗(yàn)的最基本的目的。考慮到基因大小、樣本測(cè)序深度和批次效應(yīng)等因素對(duì)讀段量的影響，在定量時(shí)應(yīng)使用標(biāo)準(zhǔn)化的方法來(lái)消除差異，最常用的樣本內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化方法包括RPKM(readsperkilobaseofexonmodelpermillionreads)八、FPKM(fragmentsperkilobaseofexonmodelpermillionmappedreads)、TPM(transcriptspermillion)和KPKM(K-mersPerKilobaseperMillionmappedk-mers)，這些標(biāo)準(zhǔn)化方法消除了基因、轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度差異和測(cè)序庫(kù)大小的差

24、異，其中FPKM的值可以通過(guò)一個(gè)簡(jiǎn)單的公式直接轉(zhuǎn)化成TPM(59JO需要注意的是無(wú)論是RPKM、FPKM還是TPM,當(dāng)比較不同樣本間基因的表達(dá)量時(shí)，如果這兩個(gè)樣本存在顯著差異表達(dá)的基因那么會(huì)影響整體的表達(dá)量評(píng)估【如。這點(diǎn)導(dǎo)致使用RPKM、FPKM或TPM做樣本間相同基因差異表達(dá)分析變得不夠準(zhǔn)確，但在對(duì)不同基因進(jìn)行表達(dá)最比較時(shí)，RPKM、FPKM或TPM仍然是目前較好的標(biāo)準(zhǔn)化方法。轉(zhuǎn)錄本定量的常用軟件有HTSeq611featureCounts621、StringTie、Cufflinks、RSEMf63、Sailfish泌、kallistof63J、IsoLasso和NURD：66。其中HTS

25、eq和featureCounts根據(jù)定位到基因組后的文件和基因組注釋信息在基因水平直接計(jì)算未標(biāo)準(zhǔn)化的讀段數(shù),StringTie和Cufflinks使用最大期望法，根據(jù)基因組定位數(shù)據(jù)，同時(shí)考慮讀段分布偏好性、雙端信息和注釋信息得出經(jīng)過(guò)樣品內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)化的轉(zhuǎn)錄本水平定量值,NURD能夠高效的對(duì)單端讀段進(jìn)行低內(nèi)存和低計(jì)算量的轉(zhuǎn)錄本水平定量,Sailfish則無(wú)需定位直接根據(jù)讀段k-mer值進(jìn)行定量戚婭】04.1差異基因表達(dá)分析現(xiàn)有的差異基因表達(dá)分析軟件可以分為兩大類(lèi)，第一類(lèi)是以讀段計(jì)數(shù)矩陣為起始文件,先進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法計(jì)算表達(dá)差異，使用的標(biāo)準(zhǔn)化方法包括:TMM69、DESeq"&

26、#176;'PoissonSeq71或UpperQuartile72等。這類(lèi)軟件能有效地避免樣本間顯著差異表達(dá)的基因?qū)φw表達(dá)量計(jì)算的影響。表1列舉了這類(lèi)軟件的相關(guān)信息。VedbarS.Khadka等使用測(cè)序質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)集SEQC74：對(duì)12款最常用的的這類(lèi)軟件進(jìn)行了假陽(yáng)性分析，結(jié)果顯示DESeq2,edgeR和limma-voom表現(xiàn)最好。第二類(lèi)軟件直接以FPKM、RPKM或TPM標(biāo)準(zhǔn)化后的數(shù)據(jù)進(jìn)行表達(dá)差異的比較，代表軟件為cufflinks和ballgown0這類(lèi)軟件由于標(biāo)準(zhǔn)化方法本身存在的缺陷(前文已述)，其結(jié)果可信度較差。Fatemeh、Seyednasrollah等，XiaoWa

27、ng等湎對(duì)這2類(lèi)軟件分別進(jìn)行比較分析后進(jìn)一步驗(yàn)證了第二類(lèi)軟件在差異基因表達(dá)分析能力上較第一類(lèi)差。表1基因讀段計(jì)數(shù)的基因表達(dá)差異分析軟件Tab.1Softwarefbrdifferentialexpressedgenesanalysisbasedonreadcounts軟件分布模型標(biāo)準(zhǔn)化方法統(tǒng)計(jì)模型參考文獻(xiàn)DESeq2(v1.14.1)負(fù)二項(xiàng)分布Median-of-ratios沃特檢驗(yàn)；似然比檢驗(yàn)77】edgeR(v3.16.5)負(fù)二項(xiàng)分布TMM費(fèi)舍爾精確檢驗(yàn);廣義線(xiàn)性模型(7Slimma-voom(v3.30.13)廣義線(xiàn)性模型TMMt檢驗(yàn)；F檢驗(yàn)-mbaySeq(v2.8.0)負(fù)二項(xiàng)分布Up

28、perQuartile經(jīng)驗(yàn)貝葉斯方法1»0：EBScq(v1.14.0)泊松線(xiàn)性回歸模型mediannormalization最大期望算法1SAMseq(v2.11)非參數(shù)模型PoissonSampling威爾科克森符號(hào)秩檢驗(yàn)g針對(duì)基因差異表達(dá)的分析軟件如今層出不窮，經(jīng)證實(shí)采用不同的軟件和方法分析得到的結(jié)果都會(huì)不同，甚至相同的軟件不同的版本分析的結(jié)果也會(huì)存在差異E】。因此在實(shí)際應(yīng)用時(shí),在每一次分析時(shí)都應(yīng)詳細(xì)記錄所用的軟件和版本號(hào)，對(duì)于關(guān)鍵性的實(shí)驗(yàn)可以綜合分析多種方法的結(jié)果廠(chǎng)4.2差異基因功能富集分析對(duì)差異基因進(jìn)行功能富集分析是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的主要目的，相關(guān)工具眾多，根據(jù)不同的富集分析

29、方法可以分為四大類(lèi)：(1)過(guò)表達(dá)分析(over.representationanalysis,ORA),常用工具有DAVID,GOstat,GenMAPP等。ORA方法理論完備，結(jié)果穩(wěn)健、可靠，但忽視了基因表達(dá)水平、基因間相互調(diào)控和低顯著性基因的信息；(2)功能集打分(functionalclassscoring,FCS)，常用工具有GSEA、GSA、PADOG等。FCS方法較ORA方法在理論上有所突破，考慮了基因表達(dá)水平的影響，檢測(cè)靈敏度更強(qiáng)，但仍然忽略了基因間的相互調(diào)控;(3)基于通路拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，常用工具有MetaGorePathway-Express.SPIA等。該方法對(duì)注釋完善的通路分析

30、結(jié)果較好,但對(duì)于CP注釋不完整的通路穩(wěn)健性較差;(4)基于網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，常用工具有NEA.EnrichNet、GANPA等，考慮了基因間的相互作用網(wǎng)絡(luò),在系統(tǒng)層面進(jìn)行基因功能富集分析,結(jié)果相比傳統(tǒng)分析更為可靠，但由于考慮信息過(guò)多導(dǎo)致計(jì)算速度較慢。王瀟等我對(duì)這四大類(lèi)方法涉及到的原理和軟件的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了較為詳盡的介紹，研究者需要在理解這些方法的基礎(chǔ)上,根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮侠磉M(jìn)行選擇。除了標(biāo)準(zhǔn)差異表達(dá)分析外,RNA.Seq技術(shù)還可用于分析融合基因、smallRNAs(18-34核昔酸長(zhǎng)度的RNA,包括miRNA.siRNA.piRNA)、可變剪接等，也經(jīng)常與其他技術(shù)相結(jié)合，例如DNA測(cè)序、DNA甲基化、C

31、hIP.seq、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等。MiriamF等如通過(guò)RNA-Seq與DNA測(cè)序相結(jié)合的方法驗(yàn)證了0RMD13相關(guān)基因突變有導(dǎo)致兒童哮喘的風(fēng)險(xiǎn)。JungHKim等通過(guò)RNA-Seq與DNA甲基化相結(jié)合的方法揭示了前列腺癌DNA甲基化的不同模式。AnshulKundaje等版通過(guò)ChlP-seq和RNA-Seq相結(jié)合的方法分析了111種人類(lèi)細(xì)胞和組織的表觀(guān)基因組。5挑戰(zhàn)與展望目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)主要來(lái)自三個(gè)方面：(1)準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄本識(shí)別。基于短讀長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序很難對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別，解決這一技術(shù)難點(diǎn)除了進(jìn)一步改善識(shí)別算法外關(guān)鍵還在于增加讀長(zhǎng)。但現(xiàn)今基于長(zhǎng)讀長(zhǎng)的三代測(cè)序技術(shù)如Pac

32、Bio(Pacific-Biosciences)SMRTXOxfordNanopore和Moleculo雖然發(fā)展迅速，可測(cè)序錯(cuò)誤率仍然偏高。目前比較好的做法是通過(guò)三代測(cè)序和二代測(cè)序相結(jié)合的方式來(lái)提高RNA-Seq的準(zhǔn)確性;(2)小樣本量的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。常規(guī)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)需要大量的細(xì)胞作為起始樣本,對(duì)起始量極少的樣本難以進(jìn)行測(cè)序分析。目前單細(xì)胞RNA-Seq(single-cellRNA-Seq)技術(shù)為小樣本量的轉(zhuǎn)錄組分析提供了有效的分析手段。特別是對(duì)于異質(zhì)性較強(qiáng)的組織樣本，需要在單細(xì)胞水平進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析,單細(xì)胞RNA-Seq更顯示了其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì);(3)測(cè)序費(fèi)用。伴隨高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，測(cè)

33、序費(fèi)用也在急劇下降。據(jù)美國(guó)國(guó)家人類(lèi)基因組研究所(NHGRI)統(tǒng)計(jì)2001年個(gè)人基因組測(cè)序成本為9500萬(wàn)美元,2011年已快速下降至2萬(wàn)美元o到2014年IlluminaHiSeqX10測(cè)序平臺(tái)的出現(xiàn)更是將個(gè)人全基因組測(cè)序價(jià)格降到1000美元，標(biāo)志著千元基因組時(shí)代的開(kāi)始。2017年Illumina測(cè)序平臺(tái)NovaSeq的推出，則意味著個(gè)人基因組測(cè)序的費(fèi)用有望降到100美元。近年來(lái)，伴隨著后基因組時(shí)代的高速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)以其高效、準(zhǔn)確的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，已被廣泛的運(yùn)用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、生物學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域，并帶來(lái)了革命性的變革。生物體的基因調(diào)控是多水平、多層次的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)為研究該復(fù)雜

34、的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了有效的研究手段，相信在不久的將來(lái)，隨著三代測(cè)序技術(shù)的逐漸成熟、單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展和測(cè)序價(jià)格的不斷降低,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在各研究領(lǐng)域的應(yīng)用會(huì)越來(lái)越普遍,為人類(lèi)探究各種生命現(xiàn)象的本質(zhì)帶來(lái)極大的幫助。參考文獻(xiàn)祁云霞，劉永斌，榮威恒.轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù)：RNA-Seq及其應(yīng)用J.遺傳，2011,33(11)：1191-202.1 GOODWINS,MCPHERSONJD,MCCOMBIEWR.Comingofage：tenyearsofnext-generationsequencingtechnologiesJ.NatRevGenet,2016,17(6)：333-351.2 R1EBE

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