測序知識概述

1、測序知識概述測序知識概述Invitrogen Proprietary & Confidential2ContentContent普通測序及測序相關基礎知識普通測序生產(chǎn)流程介紹困難模板測序相關知識困難模板測序生產(chǎn)流程介紹測序簡單問題解答Invitrogen Proprietary & Confidential3普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識基本概念基本概念什么是DNA以及DNA測序又稱脫氧核糖核酸，是染色體的主要化學成分，同時也是組成基因的材料。 DNA分子極為龐大(分子量一般至少在百萬以上)，主要組成成分是腺嘌呤脫氧核苷酸、鳥嘌呤脫氧核苷酸、胞嘧啶脫氧核苷

2、酸和胸腺嘧啶脫氧核苷酸（簡稱A、T、C、G）。DNA存在于細胞核、線粒體、葉綠體中，也可以以游離狀態(tài)存在于某些細胞的細胞質(zhì)中。大多數(shù)已知噬菌體、部分動物病毒和少數(shù)植物病毒中也含有DNA。除了RNA(核糖核酸)和噬菌體外，DNA是所有生物的遺傳物質(zhì)基礎。生物體親子之間的相似性和繼承性即所謂遺傳信息，都貯存在DNA分子中。Invitrogen Proprietary & Confidential4普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識基本概念基本概念DNA的結構DNA共有四級結構一級結構：一級結構：由多個4種脫氧核苷酸分子通過3，5磷酸二酯鍵連接形成的直線型或環(huán)型多聚體。 二

3、級結構：二級結構：在堿基互補配對的基礎上形成的DNA雙螺旋結構。三級結構：三級結構：在二級結構上，DNA雙螺旋結構通過折疊和扭曲所形成的特定構象。如超螺旋等。四級結構：四級結構：指DNA與蛋白質(zhì)形成的復合物。如染色體（質(zhì)）。DNA測序就是測定DNA的一級結構Invitrogen Proprietary & Confidential5普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識基本概念基本概念DNA結構示意圖單核苷酸及DNA的二級結構4種脫氧核苷酸分子通過3，5磷酸二酯鍵連接形成的直線型或環(huán)型多聚體。Invitrogen Proprietary & Confidentia

4、l6普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識基本概念基本概念DNA結構示意圖DNA的三級結構：雙螺旋DNA進一步扭曲盤繞則形成其三級結構，超螺旋是DNA三級結構的主要形式。 。 Invitrogen Proprietary & Confidential7普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識基本概念基本概念DNA結構示意圖DNA的四級結構： DNA與蛋白質(zhì)形成的復合物。如染色體（質(zhì)）。Invitrogen Proprietary & Confidential8普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識基本概念基本概念DNA測序原理目前DNA測

5、序的原理是Sanger雙脫氧鏈末端終止法，簡單來說，就是單引物擴增的PCR反應，但是將PCR反應體系中的dNTP換成了帶有熒光標記的ddNTP和dNTP的混合物。目前最普遍的DNA測序技術是采用四色熒光分別標記四種ddNTP. 一個樣品的測序反應只需在同一反應體系中同時加入四種ddNTP. 產(chǎn)物無須分離即可在一個泳道中電泳.序列的讀取依靠檢測器對不同熒光的區(qū)分.并需要通過軟件系統(tǒng)的分析.動畫演示：http:/ Proprietary & Confidential9普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識測序模板的要求測序分析軟件A. Sequencing Analysis

6、5.2，用于將測序原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為峰圖文件B.DNAStar,用于將測序得到的結果進行拼接C.Chromas，用于顯示DNA測序峰圖文件測序模板的要求PCRPCR產(chǎn)物直接測序產(chǎn)物直接測序 PCR已純化產(chǎn)物：提供切膠回收純化后的PCR產(chǎn)物20ul (濃度大于50 ng/l), 并請?zhí)峁舛?(濃度須正確) 大于3.2 pmol/l的測序引物1020 l（具體體積視客戶反應數(shù)相應增加）。未純化PCR產(chǎn)物：提供至少40ulPCR擴增原液，送樣前取2ul經(jīng)瓊脂糖膠鑒定目的片斷為明亮的一條帶, 同時請?zhí)峁舛?(濃度須正確) 大于3.2 pmol/l的測序引物1020 l （具體體積視客戶反應數(shù)相應增加）

7、。Invitrogen Proprietary & Confidential10普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識測序模板的要求測序模板的要求注意事項:PCR產(chǎn)物直接測序成功的關鍵是PCR產(chǎn)物的純度，所以我們提倡用膠回收PCR產(chǎn)物。如果有幾條PCR產(chǎn)物長度相近，用電泳膠也無法分開時，此時的PCR產(chǎn)物直接測序會出現(xiàn)雙峰，這種情況建議把PCR產(chǎn)物克隆后測序。PCR已純化產(chǎn)物請用水稀釋不要用elution buffer。PCR產(chǎn)物直接測序成功的另一要因是引物。不是能做PCR反應的引物便一定能測序。測序用引物要求較高,引物的3端必須與模板完全配對，含有Mix堿基的引物一般不能

8、測序 (特別是3端)。此外，測序引物長度一般為20個堿基左右，GC含量必須在5060%左右，TM值在55-65度之間。盡量保證測序引物的純度。并且引物需要用水而非TE溶解。PCR未純化產(chǎn)物最好不要添加染料。Invitrogen Proprietary & Confidential11普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識測序模板的要求測序模板的要求質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA的測序的測序 質(zhì)粒樣品：請注明載體名稱及是否含有特殊結構、插入片段的長度及插入片段的酶切位點情況、請?zhí)峁┲辽?5ul以上的提純的質(zhì)粒DNA ，濃度大于200 ng/l（體積視客戶反應個數(shù)適當增加）。含有質(zhì)粒的

9、菌液/沉淀菌體/平板菌/穿刺菌樣品：請注明菌體的種類及抗生素抗性的情況、所含載體的名稱及結構情況、插入片段的長度及插入片段的酶切位點情況、如果有特殊抗生素添加比例或培養(yǎng)條件特殊須注明。含有噬菌體含有噬菌體DNADNA的樣品的樣品公司均不提供此類抽提服務，請客戶提供質(zhì)粒形態(tài)的樣品20ul ，濃度大于50 ng/l。務必需要客戶注明是含有噬菌體DNA的質(zhì)粒。Invitrogen Proprietary & Confidential12普通測序及測序相關基礎知識普通測序及測序相關基礎知識測序引物的要求測序引物的要求長度在18-25bp之間GC含量在35%-60%之間不含兼并堿基TM值在55-

10、65度之間無引物二聚體、無發(fā)夾結構隨機引物和帶有熒光標記的引物不能測序如果設計引物，最好引物距離目的基因50bp左右Invitrogen Proprietary & Confidential13普通測序生產(chǎn)流程介紹普通測序生產(chǎn)流程介紹客戶樣品送達公司后，需要3個階段A.模板制備階段B.測序反應階段C.報告分析階段Invitrogen Proprietary & Confidential14困難模板測序相關知識困難模板測序相關知識困難樣品的定義和鑒別困難樣品的定義和鑒別困難樣品的定義和鑒別不滿足常規(guī)測序樣品質(zhì)量要求的樣品用常規(guī)測序反應體系無法得到正常結果的樣品分類現(xiàn)象樣品類型樣品

11、鑒別序列結構困難模板中斷/衰減POLY G/C質(zhì)粒：10個連續(xù)單堿基重復PCR產(chǎn)物：5個連續(xù)單堿基重復POLY A/T質(zhì)粒：15個連續(xù)單堿基重復PCR產(chǎn)物：10個連續(xù)單堿基重復二級結構/發(fā)夾結構用于RNAi干擾實驗GC RICH局部75GC堿基富集AT RICH局部80AT堿基富集樣品片段大于10KB測序序列有峰值，但背景信號極高，導致機器無法判讀，用通用測序反應體系（5ul體系）無法得到結果Invitrogen Proprietary & Confidential15困難模板測序相關知識困難模板測序相關知識困難樣品的定義和鑒別困難樣品的定義和鑒別優(yōu)化模板質(zhì)量雙峰非單克?。ㄙ|(zhì)粒）外源插

12、入片段中雙峰模板不純/多條帶PCR樣品中含1100BP差異的多個片段，目前1.5瓊脂糖凝膠無法分離無信號引物模板不匹配1、無結合位點無信號2、測序引物與模板Tm值相差太大，無法結合無信號模板濃度低用通用測序反應體系（5ul）無法得到結果,，預試驗中電泳鑒定模板條帶亮度低于標準50ng/ul的marker雜峰引物特異性差測序序列有峰值，但背景信號極高，導致機器無法判讀，用通用測序反應體系（5ul體系）無法得到結果預試驗失敗菌不長二次搖菌培養(yǎng)，菌液仍清淡不足以抽提質(zhì)粒抽不出質(zhì)粒 兩次抽提質(zhì)粒電泳鑒定無質(zhì)粒條帶或條帶亮度很弱，不足以進行反應多條帶在瓊脂糖膠上看到多條擴增產(chǎn)物帶，目前1.5瓊脂糖凝膠無

13、法分離質(zhì)粒含基因組DNA在瓊脂糖膠上，質(zhì)粒主帶后看到基因組DNA帶Invitrogen Proprietary & Confidential16困難模板測序相關知識困難模板測序相關知識常規(guī)樣品與困難樣品的不同點常規(guī)樣品與困難樣品的不同點正常樣品正常樣品困難樣品困難樣品預預實實驗驗部部分分1、菌液樣品顏色略微偏白 ，培養(yǎng)過夜后，搖蕩新鮮培養(yǎng)液呈漂絮狀2、質(zhì)粒2ul電泳鑒定無雜帶，主條帶亮度達100ng/ul（與標準質(zhì)粒帶對比）3、PCR產(chǎn)物2ul電泳鑒定無雜帶或無彌散狀，主條帶亮度達50ng/ul（與標準Marker對比）1、菌液樣品清澈，二次搖菌培養(yǎng)，菌液仍清淡如培養(yǎng)前，不足以抽提質(zhì)粒

14、2、菌液顏色泛黃，呈泥水狀，兩次抽提質(zhì)粒電泳鑒定無質(zhì)粒條帶或條帶亮度很弱，不足以進行測序反應3、PCR產(chǎn)物在瓊脂糖膠上看到多條擴增產(chǎn)物帶，目前1.5瓊脂糖凝膠無法分離4、PCR產(chǎn)物電泳鑒定時，在瓊脂糖膠上2ul的上樣量看不到擴增產(chǎn)物帶5、質(zhì)粒樣品已降解：電泳鑒定在瓊脂糖膠上看到火箭狀拖尾6、質(zhì)粒樣品含RNA帶：在瓊脂糖膠上，質(zhì)粒主帶前看到較寬的RNA帶7、質(zhì)粒含基因組DNA：在瓊脂糖膠上，質(zhì)粒主帶后靠近點樣孔，看到基因組DNA帶Invitrogen Proprietary & Confidential17困難模板測序相關知識困難模板測序相關知識常規(guī)樣品與困難樣品的不同點常規(guī)樣品與困難樣

15、品的不同點正常樣品正常樣品困難樣品困難樣品測測序序反反應應后后1、菌液、質(zhì)粒樣品測序反應后，測序結果的彩圖是清晰的，背景信號干擾少，峰型是尖的，尖峰與讀取的堿基編碼是一致的，中間波形緊湊均勻的，正常的測序反應能保證達到800Bases以上，見例圖 2、PCR樣品正常測序結果峰值判斷與質(zhì)粒樣品大致相同，唯一區(qū)別是PCR產(chǎn)物測序結束的末端最后一個堿基為A（綠色峰），見例圖 1、測序信號未能延伸到800BP之后，出現(xiàn)信號中止或衰竭2、測序信號為單個峰上再疊一個峰，稱為雙峰3、測序信號只有背景信號，無清晰峰值，稱為無信號4、測序圖譜有樣品峰存在，但背景信號掩蓋了部分樣品峰值信號，稱為雜峰Invitro

16、gen Proprietary & Confidential18測序簡單問題解答測序簡單問題解答術語講解術語講解搖菌搖菌是指將客戶提供的菌液、穿刺菌、平板菌接入液體培養(yǎng)基中，37過夜培養(yǎng)，從而得到足夠用于抽提出一定濃度質(zhì)粒的過程。劃平板平板是將用于細菌培養(yǎng)的固體培養(yǎng)基，倒于平皿之上，待凝固后用于培養(yǎng)細菌。劃平板是用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過分區(qū)劃線而達到純化分離微生物的一種方法。是將微生物樣品在固體培養(yǎng)基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離的目的。用于目的微生物的分離、克隆的活化。（如圖）通知客戶“劃板失敗”，是即使我們通過將客戶的菌液通過劃平板處理，但是平板上沒有菌落生長，證明克隆可

17、能已經(jīng)沒有活力，建議客戶重新提供樣品。Invitrogen Proprietary & Confidential19測序簡單問題解答測序簡單問題解答術語講解術語講解抽質(zhì)粒質(zhì)粒是細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子抽質(zhì)粒是指用質(zhì)粒抽提試劑盒，采用堿裂解法，經(jīng)過裂解去除蛋白等步驟，從細菌中獲得質(zhì)粒DNA的過程。鑒定鑒定是指將抽提出的質(zhì)粒、客戶提供的質(zhì)粒&PCR已純化產(chǎn)物、PCR未純化產(chǎn)物取2ul經(jīng)EB染色，點于1.3%瓊脂糖凝膠上，通過觀察DNA樣品條帶亮度對樣品濃度進行判定的過程。Invitrogen Proprietary & Confidential20

18、測序簡單問題解答測序簡單問題解答術語講解術語講解條帶條帶是DNA樣品（質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物）經(jīng)過EB染色，在瓊脂糖膠上形成的明亮帶，條帶的存在證明客戶的樣品中存在一定量的DNA模板(如圖)。通常，我們通知客戶“無條帶”的意思是：客戶的樣品我們經(jīng)EB染色，在瓊脂糖膠上沒有亮帶，證明客戶提供的樣品中，沒有DNA模板，或模板含量極低，不能用于測序。條帶弱的意思是與DNA Marker相比，條帶亮度弱，無法從膠中回收產(chǎn)物。Invitrogen Proprietary & Confidential21測序簡單問題解答測序簡單問題解答術語講解術語講解PCRPCR是P Polymerase C Chai

19、n R Reaction 的簡稱，即聚合酶鏈鎖反應，是指在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為延伸起點，通過變性、退火、延伸等步驟，體外復制出與母鏈模板DNA互補的子鏈DNA的過程。是一項DNA體外合成放大技術，能快速特異地在體外擴增任何目的DNA。 PCR反應原理演示http:/ Proprietary & Confidential22測序簡單問題解答測序簡單問題解答術語講解術語講解轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒DNA或以其為載體構建的重組DNA導入細菌體內(nèi)，使之獲得新的遺傳特性的一種方法。TA克隆TA克隆即利用Taq聚合酶同時具有的末端連接酶的功能，在每條PCR擴增產(chǎn)物的3端自

20、動添加一個3-A突出端，TA克隆載體提供一個線性含3-T突出端用于直接高效地連接PCR產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物通過轉(zhuǎn)化進入感受態(tài)細胞的過程。我們采用TaKaRa公司（PMD18T克隆載體）和Invitrogen公司TA克隆系統(tǒng)（Topo TA克隆系統(tǒng)）。Invitrogen Proprietary & Confidential23測序簡單問題解答測序簡單問題解答常見問題解答常見問題解答什么是walking測序？對于插入片斷較長的DNA樣品，一個測序反應往往不能達到測通的目的，這個時候需要進行walking測序，即以已經(jīng)測序得到的結果為基礎，在測序得到的序列上設計引物繼續(xù)向下（上）游測序的方法。

21、一般來說，第一個正向walking反應測序部將命名為w1f，第一個反向walking反應測序部命名為w1r，對于未知客戶序列方向的命名為w1p，對于向反向互補鏈進行測序的命名為w1pc。以此類推到第N個反應。如下圖所示Invitrogen Proprietary & Confidential24測序簡單問題解答測序簡單問題解答常見問題解答常見問題解答如何查詢載體與引物？每個公司均會整理常用的載體與引物表，客戶可向相關測序公司索要載體及對應引物表格，以及咨詢公司能提供客戶使用的通用引物。測序結果中怎么找不到測序引物？（用自備引物測序，前面怎么缺了一段？）由于測序引物不被熒光標記，所以不發(fā)射熒光信號，在測序結果中，是不顯示的。不論自備引物還是通用引物，在測序結果中，都是看不到的。由于受到反應體系中殘留的BDT反應底物影響，測序結果前端受到該小分子物質(zhì)的影響，所以不太準確，因而測序引物后大約20-30bp在測序結果中不顯示。測序結果文件名的意義如A04.CS080904823_8037.PQEK834#.W2R(08154