體外抗體形成細(xì)胞的檢測—定量溶血分光光度計(jì)法（QHS）

1、1體外抗體形成細(xì)胞的檢測體外抗體形成細(xì)胞的檢測定量溶血分光光度計(jì)法定量溶血分光光度計(jì)法(QHS)(Quantitative Hemolytic Spectrophotometric determination) 2v用綿羊紅細(xì)胞（用綿羊紅細(xì)胞（SRBCSRBC）免疫）免疫小鼠，然后將免疫活性細(xì)胞小鼠，然后將免疫活性細(xì)胞（小鼠脾臟（小鼠脾臟B B淋巴細(xì)胞）、淋巴細(xì)胞）、SRBCSRBC和補(bǔ)體在液相介質(zhì)中進(jìn)和補(bǔ)體在液相介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)。行反應(yīng)。SRBCSRBC與抗體形成細(xì)與抗體形成細(xì)胞所產(chǎn)生的胞所產(chǎn)生的IgMIgM結(jié)合形成抗結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，原抗體復(fù)合物，激活補(bǔ)體系激活補(bǔ)體系統(tǒng)統(tǒng)，裂解，裂解S

2、RBCSRBC而釋放出血紅而釋放出血紅蛋白，以分光光度計(jì)定量測蛋白，以分光光度計(jì)定量測定。所測值反映了抗體形成定。所測值反映了抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。細(xì)胞產(chǎn)生抗體的功能。SRBC脾臟脾臟B B細(xì)胞細(xì)胞SRBC補(bǔ)體補(bǔ)體補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑補(bǔ)體經(jīng)典激活途徑SRBC裂解裂解分光光度計(jì)檢測分光光度計(jì)檢測3實(shí)實(shí) 驗(yàn)驗(yàn) 步步 驟驟vSRBCSRBC及其制備及其制備 脫纖維防凝處理的脫纖維防凝處理的SRBCSRBC，以，以NSNS洗滌二次，洗滌二次，每次每次2000rpm 2000rpm 離心離心5min5min。棄上清，制成。棄上清，制成SRBCSRBC懸液，然后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，最后懸液，然后用血

3、細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞，最后稀釋成稀釋成1.51.510108 8 sRBC sRBC/ml/ml。4補(bǔ)體補(bǔ)體v新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)新鮮豚鼠血清，用前經(jīng)SRBCSRBC吸收后，用吸收后，用RPMI1640RPMI1640稀釋。稀釋。v（方法在新鮮的豚鼠血清中加入經(jīng)洗滌（方法在新鮮的豚鼠血清中加入經(jīng)洗滌3 3次的次的壓積壓積SRBCSRBC，按血清與，按血清與SRBCSRBC體積比為體積比為5:15:1加入。加入。44吸收吸收30min30min后，后，3000rpm3000rpm離心離心15min15min，吸出，吸出的上清即為的上清即為RBCRBC吸收的豚鼠血清。臨用前吸收的豚鼠血清。臨用前1

4、1：1010稀釋。）稀釋。）5免疫小鼠脾細(xì)胞的制備免疫小鼠脾細(xì)胞的制備v1 1）免疫鼠制備：取上述稀釋的）免疫鼠制備：取上述稀釋的SRBCSRBC，經(jīng)尾靜脈或腹腔，經(jīng)尾靜脈或腹腔內(nèi)注射免疫小鼠內(nèi)注射免疫小鼠 （鼠齡（鼠齡8 81010周），每只周），每只0.2ml0.2ml。v2 2）取脾臟：）取脾臟：7272小時拉頸處死，取出脾臟用小時拉頸處死，取出脾臟用HanksHanks液清洗，去除脂肪和結(jié)締組織。液清洗，去除脂肪和結(jié)締組織。v3 3）收取脾細(xì)胞：）收取脾細(xì)胞：v在在200200目銅網(wǎng)上研磨，并用含目銅網(wǎng)上研磨，并用含5%5%小牛血清的冷小牛血清的冷HanksHanks液液沖洗，制備單個

5、脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移濾液至試管內(nèi)。沖洗，制備單個脾細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移濾液至試管內(nèi)。1500rpm1500rpm離心離心5min5min。v用含有用含有5%5%小牛血清的小牛血清的HanksHanks液洗滌一次，用液洗滌一次，用1.2ml 1.2ml HanksHanks液重懸細(xì)胞。液重懸細(xì)胞。6正式實(shí)驗(yàn)正式實(shí)驗(yàn)脾細(xì)胞懸液脾細(xì)胞懸液SRBC懸液懸液補(bǔ)體補(bǔ)體Hanks液液總體積總體積對照管對照管1ml1ml1ml3ml實(shí)驗(yàn)管實(shí)驗(yàn)管1ml1ml1ml3ml1. 1. 取兩支試管，標(biāo)記取兩支試管，標(biāo)記2. 2. 按下表加試劑按下表加試劑3. 3. 混勻，混勻，3737水浴水浴1 1小時。小時。4. 3000r

6、pm 4. 3000rpm 離心離心 5 min5 min，取上清，取上清5.7215.721分光光度計(jì)測分光光度計(jì)測413nm413nm處處ODOD值（值（HbHb量）量）7v注意事項(xiàng)：注意事項(xiàng)：v1.SRBC1.SRBC要新鮮，無溶血。要新鮮，無溶血。v2.2.離體脾細(xì)胞的制備過程要迅速，以防細(xì)胞離體脾細(xì)胞的制備過程要迅速，以防細(xì)胞死亡，細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)準(zhǔn)確。死亡，細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)準(zhǔn)確。v3.3.紅細(xì)胞裂解是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，應(yīng)用力吹打，紅細(xì)胞裂解是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，應(yīng)用力吹打，時間也要嚴(yán)格控制。時間也要嚴(yán)格控制。8RBCRBCWBCWBCWBCWBCWBCWBCWBCWBC1mm1mm1mm1mm細(xì)胞濃度細(xì)

7、胞濃度/ml/ml = 4 = 4個大方格中的細(xì)胞總數(shù)個大方格中的細(xì)胞總數(shù)/4 /4 10 104 4細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度/ml/ml= 5= 5個中方格中的細(xì)胞總數(shù)個中方格中的細(xì)胞總數(shù) 5 5 10104 491mm1mm0.1mm=0.1mm3=0.110-3ml =10-4ml細(xì)胞濃度細(xì)胞濃度:細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml =5個中格的細(xì)胞數(shù)個中格的細(xì)胞數(shù) 5104（RBC計(jì)數(shù)法）計(jì)數(shù)法）細(xì)胞數(shù)細(xì)胞數(shù)/ml = 4個大格的細(xì)胞總數(shù)個大格的細(xì)胞總數(shù)/4 104 （WBC計(jì)數(shù)法）計(jì)數(shù)法）WWWW1mm10抗體制備原理：原理： 抗原免疫小鼠，激活免疫系統(tǒng)，抗原免疫小鼠，激活免疫系統(tǒng)，B B細(xì)胞活化并分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生針對特細(xì)胞活化并分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生針對特定抗原的特異性抗體。定抗原的特異性抗體。11方法方法v1.1.用移液管吸取脫纖維防凝處理的綿羊血適量用移液管吸取脫纖維防凝處理的綿羊血適量v2.2.加加2-32-3倍體積生理鹽水，混勻，倍體積生理鹽水，混勻，2000rpm2000rpm離心離心5 5分鐘，小心吸盡上清。分鐘，小心吸盡上清。v3.3.重復(fù)第二步操作。重復(fù)第二步操作。v4.4.用生理鹽水配用生理鹽水配20%20%、25%2