無菌檢查和微生物限度檢查操作規(guī)范

1、無菌檢查和微生物限度檢查操作規(guī)范 （中國藥品生物制品檢定所）一、無菌室的要求：無菌室是無菌檢查、微生物限度檢查的重要設(shè)備，面積不小于 6 平米，高度 2.4-2.8m 為宜。建筑材料要光潔，不 吸潮，無凸起，耐腐蝕，易清洗。無菌室內(nèi)部應(yīng)六面光滑，無縫隙，里面連接處應(yīng)呈凹凸形，不留死角。操作間和緩 沖間的門不應(yīng)直對，緩沖間兩個。無菌室內(nèi)采光面積要大，照明燈應(yīng)鑲嵌在天花板內(nèi)，光照應(yīng)分布均勻，光照度不低于 300lux ，電源開關(guān)應(yīng)設(shè)在室 外。無菌室、緩沖間和操作間均應(yīng)設(shè)置紫外線殺菌燈，每立方米 2-2.5 瓦，距實驗臺高度不超過 1 米，并應(yīng)定期檢查輻 射強度，距1米處應(yīng)不低于70微瓦/平方厘米，

2、無菌室內(nèi)應(yīng)安裝空氣除菌過濾層流裝置及調(diào)溫裝置，控制溫度18-26 C,相對濕度 40%-60%，操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應(yīng)保持與相臨環(huán)境形成正壓，不低于4.9 帕。操作區(qū)潔凈度 100級，操作間潔凈度 10000 級，潔凈度定期檢查。無菌室及緩沖間不得存放其他雜物，如培養(yǎng)箱。 用消毒液清潔無菌室操作臺面，開啟無菌室紫外燈和層流空氣過濾30 分鐘以上。無菌室的無菌程度，常用的沉降菌測定方法為：取營養(yǎng)肉湯瓊脂平板3個，置無菌室的操作區(qū)臺面左、中、右位置上，開蓋暴露30分鐘，在30-35C培養(yǎng) 2 天后，計算菌落數(shù)。用于無菌檢查的無菌室或微生物限度檢查的無菌室，細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于3 個，浮游菌每立方

3、米應(yīng)小于 5 個，否則，不能用于無菌檢查和微生物限度檢查。二、培養(yǎng)基的準(zhǔn)備1 、培養(yǎng)基的制備： 配制培養(yǎng)基的蒸餾水或去離子水應(yīng)符合規(guī)定。再稱取需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基的干燥培養(yǎng)基，加水溶化后，調(diào)節(jié) PH 值，使滅菌后需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基的 PH 值為 7.0-7.3 ，真菌培養(yǎng)基的 PH 值為 6.2-6.6，分裝、蓋塞、 滅菌，待用。2、培養(yǎng)基靈敏度試驗： 培養(yǎng)基是無菌試驗的基準(zhǔn)物質(zhì)，關(guān)系到無菌試驗結(jié)果的科學(xué)、準(zhǔn)確、可信度，因此，培養(yǎng)基靈敏度試驗是無菌試驗的重要組成部分。只有使用靈敏度試驗合格的培養(yǎng)基，才能保證無菌試驗結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。培養(yǎng)基靈敏度試驗操作如下：取藤黃微球菌、生孢梭菌、

4、白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)液，分別10 倍遞增稀釋，制成每 ml含 10-100 個菌，并作菌落記數(shù)。將制備好的菌液分別加至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基、真菌培養(yǎng)基各3 管。至規(guī)定溫度培養(yǎng) 5 天，每株菌接種的培養(yǎng)基不少于 2 管生長，則改培養(yǎng)基的靈敏度試驗合格。3、培養(yǎng)基用前的檢查：（ 1 ）無菌檢查：各種培養(yǎng)基在規(guī)定溫度培養(yǎng)3 天，應(yīng)無菌生長。（2）新鮮程度檢查：需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基氧化層的顏色用前不能超過1/5，否則，不能使用。應(yīng)煮沸去氧，只限加熱一次。4、培養(yǎng)基的保存時限： 配制好的無菌試驗用培養(yǎng)基在 2 周內(nèi)用完。三、菌種復(fù)蘇和保藏1 、菌種復(fù)蘇：先將凍干菌種的封口端用砂輪刻痕，在刻痕處過火焰數(shù)次

5、，用無菌濕棉球炸裂后打開，然后，加入0.3-0.4ml 稀釋液于菌種管底部，將菌種稀釋、混勻，并吸出菌液，接種于適宜的培養(yǎng)基。培養(yǎng)時間和溫度根據(jù)不同的菌種而定。仔 細(xì)檢查菌種的有關(guān)特性，如無發(fā)現(xiàn)異常，即可傳代、使用。2、藥品微生物用的菌種傳代方法： 取復(fù)蘇好的菌種一支，接種于規(guī)定的培養(yǎng)基數(shù)管，培養(yǎng)后，置冰箱中保藏。取出使用的菌種，經(jīng)一段時間后即可 廢棄。為防止微生物突變，菌種應(yīng)盡量避免不必要的接種和傳代。3、菌種保藏：常用的菌種保藏方法有多種。一般微生物實驗室常用瓊脂斜面和半固體低溫保藏法。大型實驗室常用冷凍真空干 燥法和液氮超低溫保藏法。4、菌種保藏的注意事項： 破傷風(fēng)梭菌、生孢梭菌選用胞肉

6、培養(yǎng)基；銅綠假單孢菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡，可用半固體法室溫保存。四、陽性對照菌液的制備 陽性對照試驗的目的是根據(jù)陽性菌在加入供試品的培養(yǎng)基中能否生長，以驗證供試品有無擬菌活性和試驗條件是 否符合要求。中國藥典規(guī)定，使用的陽性菌為金黃色葡萄球菌( CMCCB26003 )、生孢梭菌( CMCCB64941 )、白色 念珠菌( CMCCF98001 )。所有對照菌液的制備及陽性對照菌試驗，必須在另一專用凈化臺上操作，應(yīng)與其他無菌室 分開。對照菌液制備方法：通常根據(jù)供試品抗需氣菌、抗厭氧菌或抗真菌的特性，選取相應(yīng)的陽性對照菌培養(yǎng)物，制成 菌液?，F(xiàn)以金黃色葡萄球菌為例，說明對照菌液配制的方法：

7、取營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物 1 白金耳，接種于營養(yǎng)肉湯 培養(yǎng)基中，在30-35C培養(yǎng)18-24小時，用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋至每ml含10-100個菌作為對照菌液。同時，分別取對照菌液 1ml 加至雙碟中，傾入適量的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，制備兩個平板。培養(yǎng)后，以平均結(jié)果記數(shù)。制備的對照菌 液應(yīng)在當(dāng)日使用。五、擬細(xì)菌擬真菌實驗中國藥典 2000 年版增訂了擬細(xì)菌擬真菌實驗，在實驗前必須對供試品的擬菌性有一些了解。取需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基 4管，真菌培養(yǎng)基 2管，其中 2管需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基分別加 10-100 個金黃色葡萄球菌，另 2管分別加生孢梭 菌。真菌培養(yǎng)基 2管分別加 10-100 個白色念

8、珠菌，其中 1 管加定量供試品。所有培養(yǎng)基管置規(guī)定溫度培養(yǎng) 3-5 天，觀 察結(jié)果，如各培養(yǎng)基管 24 小時內(nèi)微生物生長良好，則供試品無擬菌作用；如加供試品的培養(yǎng)基管與未加供試品的培養(yǎng) 基管對照比較，微生物生長微弱、緩慢或不生長，均判供試品有擬菌作用。供試品如無擬菌作用，可采用直接接種法。 對有擬菌作用的供試品，可采用稀釋法、中和法或薄膜過濾法。六、操作人員的準(zhǔn)備操作人員準(zhǔn)備進(jìn)入無菌室：操作人員關(guān)閉紫外燈，用洗手液洗手，進(jìn)入緩沖間換工作鞋、消毒手、戴帽、穿無菌 衣、口罩、手套，不得戴裝飾物。在緩沖間著無菌裝時，袖口不能翻轉(zhuǎn)折疊，嚴(yán)防暴露手腕。七、無菌檢查無菌檢查法包括直接接種法、薄膜過濾法，前

9、者適用于非抗菌作用的供試品，后者適用于有抗菌作用或大容量的供試品。1 、直接接種法：取供試品 11 支，用消毒液浸泡或擦拭，劃痕，用75%酒精消毒棉球或碘伏棉球擦拭，過火焰，搬斷，用無菌玻璃注射器或一次性注射器取規(guī)定量供試品，接種至需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基6管，接種真菌培養(yǎng)基 5管，同時取供試品稀釋液接種需氣菌、 厭氣菌培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基各 1 管做陰性對照， 其中 1 管接種 10-100個對照菌作陽性對照。 需氣菌、 厭氣菌培養(yǎng)基管置 30-35C，真菌培養(yǎng)基管置 20-25C,培養(yǎng)7天，逐日觀察記錄結(jié)果。接種供試品后或培養(yǎng)過程中， 如培養(yǎng)基中出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，培養(yǎng) 7 天后，不能從外觀上判斷有無

10、微生物生長，可取該培養(yǎng)液適量，轉(zhuǎn)種至同種新鮮培 養(yǎng)基中或斜面培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)菌培養(yǎng) 2 天，真菌培養(yǎng) 3 天，觀察是否再出現(xiàn)渾濁或斜面有無菌生長，或用接種 環(huán)取培養(yǎng)液涂片、染色，用顯微鏡觀察是否有菌。2、薄膜過濾法： 將滅菌的排液槽安裝好，取三元一次性集菌培養(yǎng)器，將濾器導(dǎo)管放在集菌儀的移動泵管槽內(nèi)，進(jìn)液導(dǎo)管的雙星針 頭插在 0.9%的無菌氯化鈉沖洗液的膠塞上，啟動集菌儀，將沖洗液瓶倒置在支架上，沖洗液自濾器下孔流出即可。關(guān) 集菌器。取供試品 6 瓶，用消毒液浸泡或擦拭，去鋁蓋或塑料蓋，瓶塞過火焰，用注射器取氯化鈉注射液適量注入瓶 中，使供試品充分溶解。用注射器將供試液分別轉(zhuǎn)移至100ml

11、稀釋液中，搖勻，盡快將進(jìn)液導(dǎo)管上的雙星針頭插入該瓶塞上，同時啟動集菌器，過濾，直到濾膜上無藥液。將 6 瓶供試品稀釋液全部過濾。用 1000ml 的氯化鈉溶液沖洗薄 膜，每沖洗 100ml 適當(dāng)搖動濾器，抽濾干凈，沖洗 3 次。用夾子加緊濾器上一個進(jìn)液導(dǎo)管的前端，將每個濾器上的排 氣孔膠帽取下，堵在濾器底部的排液孔上，各加入 100ml 需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基于 2 個濾器內(nèi)，取下第一個夾子，再 用兩個夾子加緊另外 2 個濾器進(jìn)液導(dǎo)管的前端，加入 100ml 真菌培養(yǎng)基于第三個濾器內(nèi)，前兩元濾器中的一個要加入 金黃色葡萄球菌 10-100 個，作陽性對照。 另取兩元一次性集菌培養(yǎng)器安裝于集菌儀上

12、， 用 200ml 氯化鈉溶液沖洗薄膜， 用夾子加緊一個濾器的進(jìn)液導(dǎo)管的前端，然后加入 100ml 需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基。取下夾子，再用夾子加緊另一個濾 器進(jìn)液導(dǎo)管的前端，加入100ml真菌培養(yǎng)基，作陰性對照。需氣菌、厭氣菌培養(yǎng)基管置 30-35 C,真菌培養(yǎng)基管置20-25 C, 培養(yǎng) 7 天，逐日觀察記錄結(jié)果。3、無菌檢查結(jié)果判斷： 當(dāng)陽性對照管顯渾濁并確有菌生長，陰性對照管呈陰性時，可根據(jù)觀察所得結(jié)果判定。如需氣菌、厭氣菌及霉菌培養(yǎng) 管均為澄清或渾濁，但經(jīng)證明并非有菌生長，均為供試品合格；如需氣菌、厭氣菌及霉菌培養(yǎng)基管中任何一管顯渾濁， 并確有菌生長，應(yīng)取樣并分別依法復(fù)試。除陽性對照管外

13、其他各管均不得有菌生長，否則，應(yīng)判定供試品為不合格。八、微生物限度檢查1、供試液的制備：（ 1 ）固體供試品固體供試品包括片劑、丸劑、膠囊劑。稱取供試品 10g 放入滅菌好的勻漿杯中，加稀釋劑 100ml ，啟動勻漿儀 ,以 每分鐘 3000 轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn) 3分鐘，使供試液均勻，制成 1：10 供試液。（ 2 ）液體供試品取供試品 10ml 放入已滅菌錐形瓶中，加入 90ml 稀釋劑，使均勻，制成 1：10供試液。（3）非水溶性供試液制備稱供試品5g,加入裝有已滅菌融化的溫度約45C的司盤-80 5g，單硬脂酸甘油3g和聚山梨酸10g混合物錐形瓶中,搖勻，加 0.9%滅菌氯化鈉溶液 80ml 使供

14、試品充分乳化，制成 1：20 供試液。2、細(xì)菌霉菌（酵母菌）計數(shù)：以固體供試液為例，供試液以 1 0倍遞增稀釋，將勻漿杯中內(nèi)容物搖勻，取 2-3支滅菌中試管，分別加入 9ml 滅菌 稀釋劑。另取一支1ml滅菌吸管，吸取供試液 1ml，加入第一支試管中，混勻，制成1: 100的供試液，以此類推，作10倍遞增稀釋。根據(jù)供試品污染的程度可稀釋至 10-3或 10-4，一般取連續(xù)三級稀釋液檢驗。取吸管分別吸取 1ml 10-1 供試液加入4平皿中。再取另一支吸管分別取第二級稀釋液1ml加入4個平皿中，第三級稀釋液同樣操作。將45C左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按每一級稀釋液倒入2個平皿，每個平皿15-20ml，

15、立即搖勻。再取玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基按每一級稀釋液倒入 2 個平皿，同樣操作。細(xì)菌數(shù)和滅菌數(shù)的陰性對照試驗：分別吸取稀釋劑各 1ml 加入到 4個平皿中，再分別加入營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和玫瑰 紅鈉瓊脂培養(yǎng)基各制成 2 個平板。檢查細(xì)菌的平板倒置于 30-35C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 2天。檢查霉菌的平板倒置于 25-28C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 3天。逐日 觀察并記錄結(jié)果。陰性對照的平板培養(yǎng)后均不得長菌。3、大腸桿菌檢查：取膽鹽乳糖培養(yǎng)基 3份，每份100ml，兩份分別加入規(guī)定量的供試液，其中一份加對照菌50-100個作陽性對照。第三份加入與供試液等量的稀釋液作陰性對照，培養(yǎng) 18-24小時。陰性對照應(yīng)無菌生長。取上述

16、三份培養(yǎng)物各 0.2ml， 分別接種至 5mlMUG 培養(yǎng)基管內(nèi)培養(yǎng)，分別于 5 小時與 24 小時時取未接種的 MUG 培養(yǎng)基管作本底對照。將各管置 366nm 紫外燈下 5cm 處觀察有無藍(lán)白熒光，然后，加靛基質(zhì)試液 4-5 滴于上述 MUG 培養(yǎng)基管內(nèi)，適當(dāng)震搖后，觀察 液面顏色。如供試液、MUG陽性有熒光，靛基質(zhì)陽性呈紅色， 報告1g或1ml供試品檢出大腸桿菌；MUG陰性無熒光， 靛基質(zhì)陰性為無色，報告 1g 或 1ml 供試品未檢出大腸桿菌；如 MUG 陽性靛基質(zhì)陰性或 MUG 陰性靛基質(zhì)陽性時，將 上述膽鹽乳糖增菌液搖勻，取培養(yǎng)液劃線于 EMB 或 MCC 瓊脂平板。培養(yǎng)觀察結(jié)果：

17、平板上無可疑菌生長，當(dāng)陽性對照平板呈典型菌落生長時，可報告供試品未檢出大腸I 細(xì)菌。平板上有可疑菌落生長，應(yīng)取 2-3 個可疑菌落，接種營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)。作革蘭染色、鏡檢和IMVIC 試驗。IMVIC 試驗取可疑菌落培養(yǎng)物接種于蛋白胨水培養(yǎng)基管1支，磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基管 2 支，枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面 1 支，培養(yǎng)規(guī)定時間。沿蛋白胨水培養(yǎng)基管壁加靛基質(zhì)試液 4-5 滴，液面呈玫瑰紅色為靛基質(zhì)試驗陽性，呈試劑本色為陰性。 在 1 支磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基管內(nèi)加入甲基紅指示液數(shù)滴，立即觀察，呈鮮紅色或桔紅色為甲基紅實驗陽性，呈黃色為陰性。在另1支磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基管內(nèi)加入a-萘酚試液1ml，

18、混勻，再加入40%氫氧化鉀溶液0.4ml，充分震搖。在 4 小時管內(nèi)出現(xiàn)紅色為乙酰甲基甲醇生成實驗陽性， 無紅色反應(yīng)為陰性。 枸櫞酸鹽培養(yǎng)基的斜面上， 培養(yǎng) 48-72 小時， 有菌落生長， 培養(yǎng)基由綠色變?yōu)樘m色時為枸櫞酸鹽利用實驗陽性， 培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮浴?大腸桿菌、 IMVIC 試驗大部分為陽性、陽性、陰性、陰性，少部分為陰性、陽性、陰性、陰性。產(chǎn)氣桿菌IMVIC 實驗為陰性、陰性、陽性、陽性。結(jié)果判斷：如上述 MUG 陽性、靛基質(zhì)陽性，報告供試品檢出大腸桿菌； MUG 陰性、靛基質(zhì)陰性，報告供 試品未檢出大腸桿菌。如 MUG 陽性、靛基質(zhì)陰性、 EMB 瓊脂平板有菌生長、 IMVI

19、C 實驗為陰性、陽性、陰性、陰性， 判檢出大腸桿菌。如 MUG 陰性、靛基質(zhì)陽性、 EMB 瓊脂平板有菌生長、 IMVIC 實驗為陽性、陽性、陰性、陰性，判 檢出大腸桿菌。否則，判未檢出大腸桿菌。4、沙門菌檢查：取四硫磺酸鹽培養(yǎng)基 18-24 小時增菌培養(yǎng)物劃線于膽鹽硫乳瓊脂平板或 MCC 瓊脂平板，培養(yǎng) 18-24 小時，當(dāng)陽性 對照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時，供試品的平板無菌落生長或有菌落但不同于典型菌落形態(tài)特征時，可判為未檢出沙門菌。 如供試品的膽鹽硫乳瓊脂平板上典型菌落形態(tài)為無色至淺橙色半透明，菌落中心帶黑色或全部黑色或無黑色，在MCC瓊脂平板上典型菌落為無色至淡紅色、半透明或不透明，菌落中

20、心有時帶黑色或可疑者，均應(yīng)挑選可疑菌落2-3 個接種三糖鐵瓊脂片面上，陽性對照同時接種該培養(yǎng)基，培養(yǎng)18-24 小時后，陽性對照斜面應(yīng)為紅色，底層為黃色。硫化氫陽性而供試品的疑似菌斜面未見紅色，底層未見黃色，可判為未檢出沙門菌，否則，應(yīng)繼續(xù)作以下試驗：靛基質(zhì)實驗：照大腸桿菌項下操作并判斷結(jié)果。 脲酶試驗：取可疑菌落培養(yǎng)物接種于脲瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)24 小時，斜面變?yōu)榧t色為陽性，培養(yǎng)基顏色無改變?yōu)殛幮浴Ｇ杌浽囼灒悍謩e用白金耳蘸取可疑菌株的營養(yǎng)肉湯液一環(huán)接種至對照培養(yǎng)基及氰化鉀培養(yǎng)基，立即用橡膠塞塞緊，培養(yǎng) 24-48 小時。對照管應(yīng)有菌生長，試驗管有菌生長者為陽性，無菌生長者為陰性。 賴氨

21、酸脫羧酶試驗：取可疑菌落培養(yǎng)物分別接種于賴氨酸脫羧酶培養(yǎng)基及對照培養(yǎng)基培養(yǎng)24-48 小時，對照管應(yīng)為黃色，陰性，試驗管呈紫色為陽性。動力檢查： 取可疑菌培養(yǎng)物穿刺接種于半固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中， 培養(yǎng) 24 小時， 細(xì)菌沿穿刺外周生長為動力陽性， 否則為陰性。陰性培養(yǎng)物應(yīng)在室溫保留 2-3 天后再判斷。血清凝集試驗：在潔凈載玻片一端取沙門菌屬 O 多價 1 血清 2-3 環(huán)，再取培養(yǎng)物少許，與血清混合，將玻片前后 側(cè)動，如出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，于0.9%氯化鈉溶液和同株培養(yǎng)物作對照試驗，無凝集現(xiàn)象時，判為血清凝集陽性，必要時應(yīng)取斜面培養(yǎng)物制成濃菌懸液，在100C水浴中保溫30分鐘，待冷，再作凝集試驗，

22、如出現(xiàn)凝集，應(yīng)判為陽性，否則為陰性。結(jié)果判斷：如血清凝集試驗陽性，生化試驗符合硫化氫陽性，靛基質(zhì)試驗陰性，脲酶試驗陰性，賴氨酸脫羧酶試 驗陽性，動力檢查陽性，判檢出沙門菌；血清凝集試驗陰性，生化試驗不符合，判未檢出沙門菌。上述各項試驗任何 一項不符合有可疑反應(yīng)的培養(yǎng)物，均應(yīng)進(jìn)一步鑒定后作出結(jié)論。5、銅綠假單孢菌檢查：取供試液 18-24 小時的培養(yǎng)液劃線接種于溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng) 18-24 小時。 當(dāng)陽性對照的平板出現(xiàn)陽性菌落時供試品的平板無菌落生長或無可疑菌落生長，可判為未檢出銅綠假單孢菌。銅綠假單孢菌典型菌落呈扁平、無定形、周邊擴(kuò)散、表面濕潤、灰白色，周圍時有藍(lán)綠色素

23、擴(kuò)散，如生長菌落具 有上述特征或可疑者，應(yīng)挑選 2-3 個菌落純培養(yǎng)，取 18-24 小時的純培養(yǎng)物，革蘭染色，并作氧化酶試驗。氧化酶試驗：取潔凈濾紙片放在平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒取斜面培養(yǎng)物涂于濾紙片上，再滴加新鮮配制的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在 30 秒內(nèi)呈粉紅色逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。如證實非革蘭陰性，芽孢桿菌或氧化酶試驗陰性，均可判為未檢出銅綠假單孢菌，否則應(yīng)進(jìn)行綠膿菌素試驗。綠膿菌素試驗：取上述純培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng) 24小時后， 在試管內(nèi)先加氯仿 3-5ml，攪碎培養(yǎng)基并充分震搖，靜置片刻，加氯仿移至另一試管中，加入1mol鹽酸試液約1

24、ml，震搖后靜置片刻。如在鹽酸溶液層內(nèi)出現(xiàn)粉紅色，即為綠膿菌素陽性。試驗同時應(yīng)作陰性對照。當(dāng)陰性對照試驗呈陰性時，并為革蘭陰性桿菌， 氧化酶試驗陽性及綠膿菌素試驗陽性，可判檢出銅綠假單孢菌。綠膿菌素試驗陰性的培養(yǎng)物應(yīng)繼續(xù)作以下試驗：硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：取可疑菌培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時。如在培養(yǎng)基的肚試管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性。42C生長試驗：取可疑菌的菌懸液接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面，立即置41 1C的水浴中培養(yǎng) 24-48小時，有菌苔生長者為陽性，否則為陰性。明膠液化試驗：以接種針蘸取同上培養(yǎng)物穿刺于明膠培養(yǎng)基內(nèi)，培養(yǎng)24小時，取出置冰箱內(nèi) 10-30 分鐘，如果培 養(yǎng)基仍呈溶液狀，為陽性。銅綠假單孢菌硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、42 C生長試驗、明膠液化試驗均為陽性。6、金黃色葡萄球菌檢查：取供試液的亞銻酸鈉肉湯 18-24 小時的培養(yǎng)液劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板培 養(yǎng) 24-72 小時，當(dāng)陽性對照的平板呈現(xiàn)陽性菌落時，供試品的平板如無菌落生長或有菌落但不典型，可判為未檢出金 黃色葡萄球菌；如卵黃氯化鈉瓊脂平板上有金黃色圓形突起、邊緣整齊、外圍有卵磷脂分解的乳濁圈，甘露醇氯化鈉 瓊脂平板上有金黃色圓形突起、 邊緣整齊、 外圍有黃色環(huán)， 應(yīng)挑選 2-3個菌落純培養(yǎng)。 取 18-24 小時純培養(yǎng)物革蘭染色， 鏡檢并作血漿凝固酶試驗。血