質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用

1、質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用2003年人類基因組精細(xì)圖繪制完成，是人類科學(xué)史上一個(gè)里程碑式的事件。后基因組時(shí)代的研究重點(diǎn)自然落在了蛋白質(zhì)頭上。為啥？因?yàn)橹行姆▌t告訴我們，基因的產(chǎn)物蛋白質(zhì)，是生命活動(dòng)的最終執(zhí)行者。與基因組類比，研究生物體內(nèi)全套蛋白質(zhì)的科學(xué)，就是蛋白質(zhì)組學(xué)?；蚪M計(jì)劃完成的同年，人類蛋白質(zhì)組計(jì)劃啟動(dòng)，令人激動(dòng)的是，2014年人類蛋白質(zhì)組的草圖也完成了。而蛋白質(zhì)組學(xué)能夠飛速發(fā)展的大功臣非質(zhì)譜莫屬。質(zhì)譜的應(yīng)用范圍非常廣泛，但這里只討論蛋白質(zhì)組學(xué)中的質(zhì)譜。簡(jiǎn)單地說，質(zhì)譜法（mass spectrometry）就是對(duì)肽段離子的重量（質(zhì)荷比，m/z）進(jìn)行測(cè)量的分析方法。樣品經(jīng)質(zhì)譜儀（mass sp

2、ectrometer）檢測(cè)得到質(zhì)譜圖（mass spectrum），通過對(duì)質(zhì)譜圖的分析就可以對(duì)樣品中的蛋白進(jìn)行鑒定、定量。親，圖1的這種典型的蛋白質(zhì)組學(xué)流程都很熟悉吧。蛋白首先都要被特異性的酶（通常為Trypsin）切割為肽段，再進(jìn)行后續(xù)分析，這在蛋白質(zhì)組學(xué)中被稱為“自下而上”的研究策略（Bottom-up proteomics）。我們平時(shí)見到的質(zhì)譜分析基本都是這種類型。提到蛋白質(zhì)組，即會(huì)聯(lián)想到一系列高大上的名詞，iTRAQ、SWATH、SILAC、Shotgun、Label-free等等。很多概念容易弄混淆，下面我們就來理理清楚。圖1. 典型的蛋白質(zhì)組學(xué)流程大體上，質(zhì)譜研究蛋白主要是鑒定和定

3、量。通過二級(jí)質(zhì)譜圖（MS2或者M(jìn)S/MS）進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索匹配鑒定蛋白。通過各種標(biāo)記或非標(biāo)記的手段對(duì)不同樣品中的蛋白進(jìn)行比較就是定量。蛋白定量比較是質(zhì)譜重要的用途，圖2是對(duì)定量方法的一個(gè)簡(jiǎn)單總結(jié)。非標(biāo)定量（Label-free）不需要標(biāo)記，不同樣品分別處理、分別進(jìn)質(zhì)譜檢測(cè)；優(yōu)點(diǎn)是處理簡(jiǎn)單、無(wú)需標(biāo)記、價(jià)格便宜、可以比較很多組樣品，缺點(diǎn)是對(duì)操作步驟、LC、質(zhì)譜穩(wěn)定性要求嚴(yán)格。SILAC是在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸，在代謝水平標(biāo)記蛋白，一級(jí)質(zhì)譜圖進(jìn)行定量，可以做到三組樣品混合后進(jìn)行比較，定量準(zhǔn)確，但是不能標(biāo)記組織樣本，養(yǎng)細(xì)胞成本也較貴。雙甲基化標(biāo)記是通過化學(xué)反應(yīng)的辦法在肽段水平進(jìn)行標(biāo)記，

4、一級(jí)質(zhì)譜定量，也可以三組對(duì)比，標(biāo)記試劑都比較便宜，而且可以標(biāo)記任何來源的樣品。iTRAQ和TMT是商品化的試劑盒，肽段水平標(biāo)記，二級(jí)質(zhì)譜定量；分別可以做到至多8組和10組樣品間蛋白質(zhì)組的比較。圖2. 質(zhì)譜定量方法 以上這幾個(gè)是一家的，還有幾個(gè)名詞是屬于另外一家，比如Shotgun (DDA)、SWATH/DIA、SRM (MRM)、MRMHR/PRM。質(zhì)譜進(jìn)行數(shù)據(jù)采集的方式大致分為三種：鳥槍法（Shotgun）、選擇反應(yīng)監(jiān)控（SRM）和全景式的SWATH/DIA。下面對(duì)照?qǐng)D3再來簡(jiǎn)單介紹一下。圖3. 質(zhì)譜掃描方式DDA、IDA、Shotgun和鳥槍法說的是相同的東西，意思是質(zhì)譜在每個(gè)循環(huán)的中從

5、一級(jí)里挑選豐度高的TopN個(gè)肽段去打碎做二級(jí)掃描，得到的結(jié)果通過與已知數(shù)據(jù)庫(kù)中的理論蛋白進(jìn)行匹配。DDA簡(jiǎn)單有效，分析流程比較成熟，也是目前質(zhì)譜分析的主流方式。DDA也有其固有的缺陷，即具有一定的隨機(jī)性，偏向于檢測(cè)豐度較高的肽段，而抑制了低豐度肽段的檢測(cè)。靶向策略被稱為質(zhì)譜領(lǐng)域的Western blot。質(zhì)譜只去采集目標(biāo)肽段大小的離子信息，因而提高了靈敏度和特異性。這種方法用來研究感興趣的特定蛋白，定量準(zhǔn)確，但是通量很有限。SWATH/DIA這種全景式的數(shù)據(jù)采集方式近幾年突然火了起來，被認(rèn)為在不遠(yuǎn)的未來可能會(huì)取代DDA的主流位置。該方法采取的策略是將掃描范圍內(nèi)的所有肽段按照質(zhì)荷比分為若干個(gè)窗口

6、，再對(duì)每個(gè)窗口里所有的肽段一起打碎，采二級(jí)，數(shù)據(jù)分析時(shí)通過抽提蛋白的子離子信息進(jìn)行定量。SWATH/DIA解決了DDA中隨機(jī)性選擇肽段的缺陷，所以重復(fù)性更好，定量的準(zhǔn)確性基本達(dá)到了SRM的水平，而且可以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模定量。借用聽來的一個(gè)比喻來說明：DDA就像機(jī)關(guān)槍掃射，數(shù)量多、體積大的目標(biāo)命中的概率要大一些。靶向掃描（SRM或PRM）就像精準(zhǔn)狙擊，排除干擾，目標(biāo)明確，每一槍直指目標(biāo)，但是難以大規(guī)模消滅敵人。SWATH/DIA就是地毯式轟炸，只要暴露在我方攻擊范圍內(nèi)的敵人，不管三七二十一，全部炸完。 圖4. 定量方法與采集方式結(jié)合如果將上述的定量方法（圖2）和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集方式（圖3）結(jié)合起來，就得到

7、了現(xiàn)在基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)研究的各種策略（圖4）。再打個(gè)比方，保證吃貨們一聽就懂：雞、魚、肉、蛋、蔬菜要通過炒鍋、烤箱、高壓鍋、微波爐等烹調(diào)之后才能變?yōu)槊朗常铒柖亲?。同樣的，各種定量方法（非標(biāo)的和標(biāo)記的）處理的樣品，要通過質(zhì)譜各種采集方式變?yōu)殡娔X中的數(shù)據(jù)，才能分析并從中得到蛋白的信息。 本次的介紹就先到這里了，如果其中有什么問題，歡迎您批評(píng)和建議，我們會(huì)努力變得更好；如果需要跟我們進(jìn)行技術(shù)交流和討論，歡迎大家聯(lián)系武漢金開瑞。后續(xù)我們還會(huì)繼續(xù)推出對(duì)質(zhì)譜技術(shù)各方面進(jìn)行解析的文章，敬請(qǐng)期待。References1. A draft map of the human proteome. Nature 509: 575581 (2014)2. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature 509: 582587 (2014)3. A review: Annu. Rev. Biochem. 80: 27399 (2011)4. SILAC: Molecular & Cellular Proteomics 1: 376-386 (2002)5. iTRAQ: Molecular & Cellular