熒光原位雜交技術

1、碩 士 學 位 論 文熒光原位雜交技術及其在環(huán)境領域內的應用Fluorescence in situ hybridization technology and its application in the field of environment作 者 姓 名： * 學科、 專業(yè)： 環(huán)境科學與工程 學 號： * 指 導 教 師： * 完 成 日 期： 2014/3/26 大連理工大學Dalian University of Technology摘 要熒光原位雜交（FISH）是現(xiàn)代分子生物學及基因工程中廣泛應用的新技術，本文概述了FISH實驗原理、實驗流程以及技術問題等。總結了一些實驗關鍵步驟的

2、操作要點和注意事項，并對熒光原位雜交技術在環(huán)境微生物監(jiān)測方面的應用做了綜述。利用FISH技術在環(huán)境樣品上直接原位雜交，不僅可以測定不可培養(yǎng)微生物的形態(tài)特征及豐度，而且可原位分析它們的空間及數(shù)量分布。并且展望了FISH技術的未來。關鍵詞：熒光原位雜交技術；探針；環(huán)境微生物；監(jiān)測AbstractFluorescence in situ hybridization （FISH） is a new technology which is widely used in modern molecular biology and genetic engineering. This article summa

3、rizes the experimental principle, process and technical issues of FISH .Also we summarize some operation points and matters needed attention of key steps, and review application of FISH in environmental microbe monitoring. Using FISH technology directly in the environmental samples, can not only mea

4、sure the morphology and abundance of uncultured microorganisms, but also analyse their spatial distribution and quantity in situ. And look forward to the future of FISH.Key Words：Fluorescence in situ hybridization technology; Probe; Environmental microbes; monitoring目 錄摘 要IAbstractII1 熒光原位雜交技術簡介41.1

5、 FISH發(fā)展歷史41.2 FISH原理51.3 FISH基本過程51.3.1 探針制備61.3.2 探針的標記7雜交前處理71.3.4 雜交8熒光檢測與結果分析91.4 FISH技術特點91.5 常見的技術問題及解決措施91.5.1 FISH檢測的假陽性91.5.2 FISH檢測的假陰性102 FISH技術在環(huán)境領域的應用102.1 對硝化細菌的監(jiān)測102.2 對除磷細菌的監(jiān)測112.3 FISH技術在絲狀微生物研究中的應用112.4 對厭氧顆粒污泥中微生物的監(jiān)測122.5 對自然環(huán)境中微生物多樣性的監(jiān)測123 未來展望13參 考 文 獻141 熒光原位雜交技術簡介熒光原位雜交（fluore

6、scence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發(fā)展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術，以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法，探針首先與某種介導分子結合，雜交后再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料。FISH技術是將DNA（或RNA）探針用特殊的核苷酸分子標記，然后將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上，再用與熒光素分子偶聯(lián)的單克隆抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析。具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優(yōu)點。同時在熒光原位雜交

7、基礎上又發(fā)展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術。1.1 FISH發(fā)展歷史1986年人們用異硫氰酸鹽熒光素來標記探針，并在熒光顯微鏡下進行分析，從而建立了熒光原位雜交技術。1988年，Giovannoni等1首次將原位雜交技術引入細菌學研究中，使用放射性標記rRNA 寡核苷酸探針檢測微生物。然而由于放射性物質對人體有害，加上實驗周期長，操作比較繁雜，人們開始研究使用非放射性物質取代同位素來標記探針，如使用生物素和地高辛標記探針，由此建立了非放射性原位雜交技術。1989年，Delong2首次使用熒光標記寡核苷酸探針檢測單個微生物細胞。從此，人們越來越多地使用熒光原位雜交技術來檢測

8、環(huán)境中的微生物樣品。進入20世紀90年代以后,FISH技術在方法上逐步形成了從單色向多色- FISH的發(fā)展趨勢，靈敏度和分辨率也有了大幅度的提高。多色熒光原位雜交（M- FISH）的最大特點是可將多次繁瑣的FISH實驗和多種不同基因的定位在一次FISH實驗中完成。Cremer等3用生物素和汞或氨基乙酰熒光素標記探針建立了雙色FISH技術。 最近，多種標記的探針和熒光染料可以同時測多個靶序列，最新的多色FISH可同時用7種顏色進行檢測。熒光染料具有不同的激發(fā)和散射波可以同時檢測一個或更多微生物。FISH技術由于靈敏度高，具有較好的分辨力，實驗周期短，操作安全，特別是可以同時分析一種以上的探針，它

9、將成為微生物系統(tǒng)發(fā)育學、微生物生態(tài)學、微生物診斷學和環(huán)境微生物學研究的有力工具，同時FISH技術本身也得到快速發(fā)展。1.2 FISH原理熒光原位雜交是利用熒光標記的特異核酸探針按照堿基互補的原則，與細胞內相應的靶DNA分子或RNA分子雜交，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，通過在熒光顯微鏡或共聚焦激光掃描儀下觀察熒光信號，來確定與特異探針雜交后被染色的細胞或細胞器的形態(tài)和分布，或者是結合了熒光探針的DNA 區(qū)域或RNA 分子在染色體或其它細胞器中的定位，圖1.1顯示的是熒光原位雜交原理。圖1.1熒光原位雜交原理圖FISH技術的目標分子通常是16S rRNA，因為它在微生物體內具有較高的拷貝數(shù)，分布廣

10、泛、功能穩(wěn)定，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具有適當?shù)谋Ｊ匦?。根?jù)待測微生物體內16S rRNA中某段特異性序列，設計相應的寡核苷酸探針，就可實現(xiàn)對目標微生物的原位檢測，而選取在分子遺傳性質上保守性不同的特異序列，就可在不同水平（如屬、種等） 上進行檢測。目前，公共和商業(yè)數(shù)據(jù)庫中已發(fā)布的16S rRNA序列逐漸增多，因此，基于16S rRNA的FISH技術的應用也越來越廣泛，對環(huán)境樣品中微生物的原位研究也越來越方便和準確。除16S rRNA 外，還可以23S rRNA 或mRNA 等作為研究的目標分子。1.3 FISH基本過程熒光原位雜交技術基本過程如圖所示，主要包括探針制備、探針標記、雜交、熒光檢測與結果

11、分析。圖1.2所示的是熒光原位雜交方法標記細胞的基本流程： 圖1.2熒光原位雜交方法標記細胞的基本流程1.3.1 探針制備進行熒光原位雜交試驗首先需要有熒光探針。它是一段帶有熒光色素的核酸序列。探針有很多種，包括：DNA探針，RNA探針，寡核苷酸探針等。每種探針的特點如表所示。表1.1各種探針優(yōu)缺點4探針類型優(yōu)點缺點DNA探針制備簡單，放射比活性好，信號特異性強，雜交體穩(wěn)定變性后才能使用，要基因克隆，穿透性差，易于退火RNA探針信號特異性強，不需變性，信噪比高，雜交體非常穩(wěn)定易被降解，易吸附于器皿上，穿透性差，要做亞克隆寡核苷酸探針易制備，使用方便，穿透力強 ，不用克隆，不會退火需核酸合成儀，

12、需明確mRNA序列，雜交體不穩(wěn)定，信噪比低寡核苷酸探針是一種人工合成的、根據(jù)探針靶序列的堿基順序用化學方法合成的單鏈DNA，其長度為15-50個核苷酸。由于分子小，因此更容易滲透到細胞的目標區(qū)域，但也正由于分子小，限制了其所能攜帶的熒光基團或報告分子的數(shù)目，并最終導致雜交后熒光信號較弱。1.3.2 探針的標記對探針的標記是通過把熒光素標記的核苷酸引入探針序列來實現(xiàn)的，根據(jù)引入的過程不同，標記方法可分為缺口平移法、隨機引物法、PCR法等；缺口平移法：基本方法是通過酶的作用在5-3核酸鏈上產(chǎn)生隨機缺口，再通過酶將核苷酸添加到缺口的3端，從而把帶有熒光色素的核苷酸引入核酸鏈。隨機引物法是以變性后的探

13、針DNA鏈為模板，在隨機引物的引導下，利用酶活性把標記核苷酸引入DNA鏈。PCR法是把熒光色素標記的核苷酸引入DNA鏈中。FISH 技術的目標分子通常是 16S rRNA，因為它在微生物體內具有較高的拷貝數(shù)，分布廣泛、功能穩(wěn)定，而且在系統(tǒng)發(fā)育上具有適當?shù)谋Ｊ匦?。根?jù)待測微生物體內 16S rRNA中某段特異性序列，設計相應的寡核苷酸探針，就可實現(xiàn)對目標微生物的原位檢測，而選取在分子遺傳性質上保守性不同的特異序列，就可在不同水平（如屬、種等） 上進行檢測。1.3.3雜交前處理（1） 增強細胞通透性熒光原位雜交實驗的程序中，如何增強細胞通透性，保證核酸探針能與目標核苷酸結合是一個重要的問題。該步驟

14、根據(jù)應用固定劑的種類，雜交樣品的種類和核酸探針的長度來決定。某些固定劑能影響細胞的通透性，因此需要利用一些試劑如稀釋后的酸、乙醇等進行處理。另外，使用表面活性劑對樣品處理能夠較好地增加細胞的通透性。（2）降低背景熒光原位雜交中背景的染色是由多種因素造成的，雜交后的洗滌能夠降低背景染色。預雜交也是降低背景染色的一種有效手段，預雜交液與雜交液的不同是在于前者不含有探針。將玻片浸入到預雜交液中可達到封閉特異性雜交點的目的，從而降低背景染色。（3）變性單鏈的DNA/RNA探針不需要變性。雙鏈DNA探針雜交前需要變性為單鏈，一種方式是樣本與探針分別變性，其中雙鏈DNA變性是在70-80條件下變性10分鐘

15、左右，然后立刻轉移到冰浴中。而樣本是放置在70-80的變性液中5-10分鐘，用70%，85%，100%的系列乙醇脫水，吹干。另一種方式是共同變性：樣本經(jīng)過70%，85%，100%系列乙醇脫水快速吹干后，將探針溶液加至玻片上，蓋上蓋玻片，封片液封固邊緣，放置在70-78的加熱板上10分鐘左右，然后立即轉入37的濕盒中。1.3.4 雜交雜交前的一切準備工作都是為了能讓熒光探針在雜交這一步驟中能夠進入到細胞內，與目標核苷酸結合。雜交能否實現(xiàn)決定了整個實驗的成敗，因此，雜交是熒光原位雜交中最重要也是最關鍵的一步。在已經(jīng)預處理好的樣品上滴加雜交液，加蓋蓋玻片就可以完成雜交。在雜交區(qū)域，探針與目標核苷酸復

16、性，形成DNA-RNA的合體。蓋玻片的作用是防止在雜交過程中的高溫情況致使雜交液和探針的揮發(fā)。同時，整個雜交環(huán)境應當保持黑暗、潮濕，可在暗盒內灑一定量的雜交液，同時暗盒也必須耐高溫不會影響雜交的順利進行。蓋玻片必須清潔無雜質，同時也要光滑不會產(chǎn)生氣泡，還必須不會影響樣品細胞與雜交液的接觸。在實驗中還必須注意以下環(huán)節(jié)。（1）探針的濃度及長度探針的濃度必須給于該實驗最大的信噪比，探針濃度過高會造成背景染色過高，探針濃度過低會導致熒光信號的不足。因此，最低的探針濃度應達到與靶核酸最大飽和結合度的程度。根據(jù)國內外多數(shù)專家學者的經(jīng)驗，認為保存濃度為5ng/L為最佳濃度。另外，雜交過程中加雜交液的量也不能

17、太多，雜交液過多易導致蓋玻片滑動脫落，影響雜交的結果。探針的長度對雜交結果也有很大的關系。探針短則易進入細胞，雜交效率高，雜交時間短，但是信號不是很強烈。探針長則信號好，易觀察，但是不易進入細胞，雜交時間廠，而且配錯對的幾率也會增加。（2）雜交溫度和時間雜交溫度是雜交能否成功的一個關鍵因素。DNA探針需要變性解鏈后才能進行雜交。雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱為DNA的溶解溫度（Tm），大多數(shù)的DNA探針需要的Tm是90，這種高溫對保存細胞完整和保持樣品黏附在載玻片上是很困難的。而使用寡核苷酸探針不需要經(jīng)過這一步驟，但是雜交也需要在60左右才能進行，這么高的溫度對樣品也是很不利的。因此在雜交過

18、程中需加入一定量的甲酰胺反應液中每增加1%的甲酰胺，Tm值就可降低0.72?？梢哉{節(jié)甲酰胺的含量來適當降低雜交的溫度。雜交的溫度隨著探針的種類不同而不同，雜交的時間也對雜交有較大的影響。雜交時間過短會造成雜交不完全，而過長則會增加非特異性雜交。大部分的DNA探針雜交時間為2-4小時，但是為了穩(wěn)妥起見，人們將反應時間定地較長，為16-20小時。而使用寡核苷酸探針是不需要這么長的時間的。雜交反應的時間應當與探針的長度和細菌細胞通透性有關，在充分進行細胞通透性的處理之后，核酸長度很短的寡核苷酸探針只需要2-6小時便可完成雜交。雜交時間因探針的種類不同而不同。1.3.5熒光檢測與結果分析熒光原位雜交的

19、結果觀察需要使用熒光顯微鏡或者激光掃描共聚焦顯微鏡。熒光顯微鏡的特點為：（1）數(shù)值孔徑大于普通顯微鏡，熒光較弱。（2）光源由汞燈提供全波段的激發(fā)光，通過物鏡投射于樣品上。（3）有兩個特殊濾光片，分別濾除可見光和紫外線。觀察不同熒光標記的探針需要調節(jié)不同的濾光片以選定適合波長的激發(fā)光1.4 FISH技術特點原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優(yōu)勢在于對制備樣品的要求不高，可以通過延長曝光時間加強信號強度，故較靈敏。缺點是探針不穩(wěn)定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間分辨率不高、及同位素操作較繁瑣等。采用熒光標記系統(tǒng)則可克服這些不足，這就是FISH技術

20、。FISH技術作為非放射性檢測體系，有以下特點：優(yōu)點：1、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；2、探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內使用；3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確；4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結構的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。缺點：不能達到100%雜交，特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。1.5 常見的技術問題及解決措施1.5.1 FISH檢測的假陽性在FISH檢測中，寡核苷酸探針的特異性決定了檢測結果的可靠

21、性和精確性，所以通常希望設計得到的寡核苷酸最好與數(shù)據(jù)庫中的寡核苷酸一樣的精確?，F(xiàn)存數(shù)據(jù)庫的不斷擴大和所報道序列的非精確性，探針序列的檢測最好用最常規(guī)、最新版本的序列數(shù)據(jù)庫進行校對。而對于一些培養(yǎng)條件苛刻的和暫時無法培養(yǎng)的微生物，應該用點雜交的方法分析探針的特異性，來確定探針設計的合理性。此外，一些微生物本身具有熒光性，會對FISH檢測產(chǎn)生干擾。雖然自身熒光性有利于復染，但經(jīng)常降低信噪比，同時掩蓋特異的熒光信號。所以在處理一些混合菌群時要防止自身背景熒光的處理。使用狹窄波段的濾鏡和放大系統(tǒng)以及適當?shù)念A處理，可以降低背景熒光5。Lin等發(fā)現(xiàn)用H2O2預處理可以有效的減少假陽性6。Taguchi 等

22、在使用FISH之前，用HCl 預處理可以減少來自熒光標記寡核苷酸探針非特異性吸收的背景熒光以及減少大量的雜質7。Hahn等發(fā)現(xiàn)用地高辛標記探針原位觀察Frankia strains與用熒光標記探針相比，不產(chǎn)生自身熒光問題8。1.5.2 FISH檢測的假陰性雖然大多數(shù)細菌含有高的rRNA豐度，但rRNA豐度變異不僅僅發(fā)生在種屬間，亦發(fā)生在同一菌不同生長階段，生長率慢的細菌含有低的rRNA豐度9;有些微生物細胞壁滲透性差，使探針不能充分進入細胞內與rRNA分子雜交，這些都將導致假陰性結果。因此，優(yōu)化滲透性、用高亮度的熒光染料Cy3或Cy5和多重探針標記，應用信號放大系統(tǒng)或多核苷酸探針和CARD-F

23、ISH均可以增加雜交信號。Watt。 等用FISH技術分析生長小麥根系的土著細菌、假單胞菌、絲狀菌的量以及分布情況時發(fā)現(xiàn)使用Cy5或Cy5。 5熒光染料可以避免在觀察時看到自身熒光10。一些研究發(fā)現(xiàn)用多核苷酸熒光雜交技術和CARD-FISH均可以發(fā)現(xiàn)在水體中豐富的古生菌，而寡核苷酸熒光雜交技術無法發(fā)現(xiàn)11，表明寡核苷酸熒光探針的雜交信號較弱，通過其方法的改進，可以消除實驗結果的假陰性。2 FISH技術在環(huán)境領域的應用2.1 對硝化細菌的監(jiān)測硝化細菌是一類生理上非常特殊的化能自養(yǎng)菌，傳統(tǒng)的研究方法要經(jīng)過富集、分離、分類和鑒定等步驟，耗時長（48w） ，而且因為所用的培養(yǎng)基有選擇性，使得某些易于培

24、養(yǎng)的菌株如Nitrosomonaseuropaea和Nitrobacterwinogradskyi 等超過了其他硝化細菌，在培養(yǎng)基中處于競爭優(yōu)勢，因此得到的優(yōu)勢類群與樣品中的真實情況有差異。此外，傳統(tǒng)的方法對培養(yǎng)困難的硝化細菌無法進行研究。FISH技術的引入解決了上述困難。隨著人工設計合成的硝化細菌及氨氧化菌探針的不斷推出，F(xiàn)ISH技術被廣泛地應用于活性污泥系統(tǒng)、硝化流化床反應器和膜生物反應器等污水處理系統(tǒng)中。JuretschkoSL和SchrammA等12曾對硝化流化床、普通活性污泥等工藝的活性污泥中硝化細菌的多樣性采用FISH法進行了跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)Nitrosospira、Nitrospi

25、ra為優(yōu)勢菌種，而并未探測到Ni2trosomonas和Nitrobacter。Kazuaki H等13EUB338、NSO190、NIT3和NSR1156等探針研究了同時硝化反硝化好氧膜生物反應器中生物膜上的菌群結構，結果表明氨氧化菌是生物膜中的優(yōu)勢菌群，而亞硝酸鹽氧化菌則未被檢出。HanWoongLeeL等14用EUB338作為一級探針，ALF1b、BET42a、GAM42a和CF319a作為二級探針對兩個不同脫氮反應器活性污泥中的分子生物學特征進行了定量研究，結果表明變形菌綱亞綱是反應器中的優(yōu)勢菌群，變形菌綱亞綱是反應器中的第二大優(yōu)勢菌群。OlavSliekers等15采用FISH技術對

26、CAN-ON工藝調試過程中的優(yōu)勢菌種變化進行研究，結果表明：在厭氧運試階段，以亞硝酸菌或硝酸菌的核酸探針檢測，沒有在污泥中檢出亞硝酸細菌和硝酸細菌（檢測限1%），以厭氧氨氧化細菌的核酸探針檢測，大部分細胞呈陽性反應，污泥中的厭氧氨氧化菌占80%左右；在限氧運行7周后，同等測試結果顯示活性污泥中的亞硝酸菌與厭氧氨氧化菌所占的百分率分別為45%和40%，而硝酸菌則未被檢出。由此推斷：在限氧條件下，硝酸細菌不能與亞硝酸細菌競爭氧，也不能與厭氧氨氧化菌競爭亞硝酸鹽。2.2 對除磷細菌的監(jiān)測近年來，國內外許多學者利用原位雜交技術對不同除磷工藝中聚磷菌的生態(tài)變化進行了大量研究。FISH技術的應用克服了以往

27、除磷菌難于用常規(guī)方法培養(yǎng)造成的研究上的困難，并對不同條件下生物除磷工藝的改進起到了指導性的作用。Mamoru對除磷工藝的FISH研究中，使用ALF1b、HGC和Bet42a探針檢測出的細菌量所占比例較大，分別在10%64%；MP2和CF探針探測到的細菌含量并不高，在4%以下。在強化除磷（EBPR）工藝中，無論好氧或厭氧區(qū)的活性污泥中都存在著大量豐富的除磷微生物，其中常見類群為Bet Proteobacteria亞類的Actinobacteria菌、GPBHGC、Epbr15和Epbr16等。近期報道16的Rholocyclus也是生物除磷的優(yōu)勢種群，并且利用常規(guī)培養(yǎng)方法不能培養(yǎng)的- 亞綱變型細

28、菌也在EBPR工藝中探測到。 2.3 FISH技術在絲狀微生物研究中的應用在污水生物處理工藝系統(tǒng)內，絲狀微生物的大量滋生是引起污泥膨脹的主要成因。由于其對培養(yǎng)基的選擇性很強，不易進行實驗室分離培養(yǎng)，所以用傳統(tǒng)的方法對絲狀菌進行監(jiān)測困難較大。利用FISH技術使該問題得到了較好的解決，許多科學工作者對活性污泥中絲狀微生物作了大量的FISH鑒定工作，從探針的設計及應用等方面作了詳盡的闡述。FISH技術的應用對深入認識絲狀微生物膨脹機理提供了大量有用的信息。2.4 對厭氧顆粒污泥中微生物的監(jiān)測厭氧顆粒污泥是由多種具有互營共生關系的厭氧微生物形成的復雜聚集體，是UASB、EGSB和IC等厭氧反應器高效穩(wěn)

29、定運行的關鍵，眾多研究者對其形成機理、微觀結構、微生態(tài)等進行了大量研究，但基于純培養(yǎng)的傳統(tǒng)微生物學研究方法自身存在的缺陷、顆粒污泥中微生物組成及其相互關系的復雜性以及某些厭氧細菌（如產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌和產(chǎn)甲烷細菌）的生長特異性等，使得對厭氧顆粒污泥的認識至今仍未取得共識。FISH技術的出現(xiàn)可以在很大程度上彌補傳統(tǒng)方法的不足。利用FISH技術對顆粒污泥所進行的研究，主要集中在以下幾個方面17：（1）組成顆粒污泥的各種微生物的種屬關系及其空間分布；（2）工藝或環(huán)境條件對顆粒污泥內部微生物空間分布的影響；（3）兩種或多種特定微生物之間的生態(tài)關系等。HermieJ ， MHarmsen18等人利用EUB3

30、38、ARC915、MX825和MG1200等探針的不同組合，研究發(fā)現(xiàn)以蔗糖為基質的顆粒污泥分為三層：外層為真細菌，中間層為產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸細菌與產(chǎn)甲烷絲菌的共生體，內層存在著較大空洞，有少量產(chǎn)甲烷細菌和無機物；而以混合揮發(fā)酸為基質的顆粒污泥只分為較明顯的兩層：外層是真細菌內層則以產(chǎn)甲烷絲菌為主。Sekiguchi YY等人19利用EUB338和ARC915探針確定了真細菌和古細菌在中溫和高溫厭氧顆粒污泥中的分布情況，然后利用MX825、MG1200、MB1174、MS1414和D660等探針的不同組合對不同種類產(chǎn)甲烷細菌與真細菌的空間分布進行研究。結果表明：中溫和高溫顆粒污泥具有相似的微生物分布結

31、構，外層主要是真細菌，內層主要是古細菌；顆粒中心均不能被染色，可能是無機物或死亡細菌；古細菌中以索氏產(chǎn)甲烷絲菌為主，在高溫顆粒污泥中還存在少量的產(chǎn)甲烷八疊球菌；真細菌則種類較多，主要有脫硫葉菌、互營桿菌、和綠色非硫細菌等。2.5 對自然環(huán)境中微生物多樣性的監(jiān)測由于顯微鏡下可見的微生物99%以上通過常規(guī)方法不能被培養(yǎng)，由于培養(yǎng)條件與自然條件的差異，實際上培養(yǎng)所得到的只是自然環(huán)境中的少部分微生物，而且往往加入了濃度遠高于自然狀況的營養(yǎng)物質，其結果是在新的選擇壓力下群落結構通常會發(fā)生變化，適應豐富營養(yǎng)條件的菌種成為優(yōu)勢種，取代了自然條件下的優(yōu)勢種。20由于核酸序列可以提供遺傳距離、分子雜交探針等信息

32、，可進一步用于鑒定、監(jiān)測自然生態(tài)系統(tǒng)中的微生物。基于核酸抽提和PCR擴增等技術存在一定程度的偏差，而FISH技術可以將整體微生物清晰地呈現(xiàn)出來而不需要額外的抽提和擴增等易引起偏差的步驟，精確性更好。所以，F(xiàn)ISH技術被廣泛應用于環(huán)境微生物多樣性的研究。近幾年，應用FISH技術研究自然環(huán)境微生物多樣性的報道較多，如河水和高山湖水的浮游菌體、海水沉積物的群落以及土壤和根系表面的寄居群落。SimonNathalie等21在2002年利用FISH技術研究海水中細菌和有害藻類種群之間的相互作用；應用FISH技術不僅能研究微生物群落結構的特征，還可以跟蹤微生物種群的動態(tài)變化。Liu J等222002年利用

33、FISH技術監(jiān)測了河流中微生物群落的動態(tài)變化，并利用此技術得到了一些在人工條件下很難培養(yǎng)的菌種以及一些新的微生物信息。FISH技術也被用于監(jiān)測環(huán)境中的微生物群落動態(tài)，如季節(jié)變化對高山湖水微生物群落的影響、原生動物的攝食對浮游生物組成的影響等。此外，我們不僅可以更準確地了解不同環(huán)境下微生物群落中各種功能菌群的組成比例，而且對不同功能菌群的相互作用有了更直觀的認識。3 未來展望FISH技術在國內外環(huán)境微生物監(jiān)測中已得到較為廣泛的應用，技術水平日趨成熟。然而，F(xiàn)ISH技術在環(huán)境微生物研究中的應用尚處在起步階段，還存在著不足：首先，F(xiàn)ISH檢測的精確性和可靠性依賴于寡核苷酸探針的特異性，因此探針的設計

34、和評價十分重要，目前一些探針的靈敏度還有待提高；其次，微生物的自身熒光也會干擾FISH檢測而出現(xiàn)假陽性使檢測結果出現(xiàn)正偏差，一些細菌如假單孢菌屬、軍團菌屬、世紀紅藍菌、藍細菌屬和古細菌如產(chǎn)甲烷菌中存在這樣的熒光特性，環(huán)境樣品中自發(fā)熒光的生物或存在于微生物周圍的化學殘留物使應用FISH分析環(huán)境微生物變得復雜；此外，試驗過程中雜交液滲透不充分、雜交后熒光標記見光褪色等則會導致假陰性而使檢測結果出現(xiàn)負偏差；另外，一些生長緩慢的細胞由于rRNA含量低而很難被探測到。因此，F(xiàn)ISH技術作為一項新興的研究手段和工具，還需要在高靈敏度探針的研究與開發(fā)、熒光信號的完善與加強、雜交過程的優(yōu)化等幾個方面進行加強和

35、改進。相信隨著分子生物學技術和精密儀器設備研制技術的不斷發(fā)展和新探針的開發(fā)，F(xiàn)ISH技術將具有更強的可操作性和實用性，從而使FISH技術在環(huán)境微生物的監(jiān)測和生態(tài)學解析中具有更廣闊的應用前景。參 考 文 獻1 Giovannoni S J, DeLong E F, Olsen G J, et al. Phylogenetic group-specific oligodeoxynucleotide probes for identification of single microbial cellsJ. Journal of Bacteriology, 1988, 170（2）: 720-726.

36、2 DeLong E F, Wickham G S, Pace N R. Phylogenetic stains：ribosomal RNA-based probes for the identification of single cellsJ. Science, 1989, 243（4896）： 1360-1363.3 梁毓,王樹玉,賈嬋維. 熒光原位雜交技術的研究進展J. 中國優(yōu)生與遺傳雜志， 2005,13（5） ：119- 120.4 Shinkai T, Kobayashi Y. Localization of ruminal cellulolytic bacteria on pl

37、ant fibrous materials as determined by fluorescence in situ hybridization and real-time PCRJ. Applied and environmental microbiology, 2007, 73（5）：1646-1652.5 宋琳玲, 曾光明, 陳耀寧, 等. 熒光原位雜交技術及其在環(huán)境微生物生態(tài)學中的應用研究J. 微生物學雜志, 2007, 27（1）： 40-44.6 Lin X, Wakeham S G, Putnam I F, et al. Comparison of vertical distr

38、ibutions of prokaryotic assemblages in the anoxic Cariaco Basin and Black Sea by use of fluorescence in situ hybridizationJ. Applied and environmental microbiology, 2006, 72（4）： 2679-2690. 7 Taguchi T, Shinozaki Y, Takeyama H, et al. Direct counting of< i> Cryptosporidium parvum</i> oocy

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40、J. Applied and environmental microbiology, 1993, 59（6）：1709-1716.9 Kemp P F, Lee S, LaRoche J. Estimating the growth rate of slowly growing marine bacteria from RNA contentJ. Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59（8）： 2594-2601.10 Watt M, Hugenholtz P, White R, et al. Numbers and locations

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43、 68（6）： 3094-3101.13 Juretschko S, Timmermann G, Schmid M, et al. Combined molecular and conventional analyses of nitrifying bacterium diversity in activated sludge： Nitrosococcus mobilis and Nitrospira-like bacteria as dominant populationsJ. Applied and environmental microbiology, 1998, 64（8）： 3042-3051. 14 Hibiya K, Terada A, Tsuneda S, et al. Simultaneous nitrification and denitrification by controlling vertical and horizontal microenvironment in a membrane-aerated biofilm reactorJ. Journal of biotechnology, 2003, 100