醫(yī)藥與日化原料

1、第*期作者等: 文章題目·5· 醫(yī)藥與日化原料膦酸酯糖苷衍生物的合成與抗腫瘤活性 201804090250楊家強1，車萬莉1，陳磊1，楊璇2，熬慧1（1.遵義醫(yī)學院 藥學院，貴州 遵義 563000；2. 曼尼托巴大學 化學系，加拿大 溫哥華 R3T4K6）摘要：以-羥基膦酸酯和溴代單糖為中間體，堿性離子液體BmimOH為催化劑，微波輔助，以79.6%-84.1%的收率合成了系列膦酸酯糖苷化合物（a-f），經(jīng)IR, 1HNMR, 13CNMR確認了產(chǎn)物結構。采用溴化噻唑藍四氮唑 (MTT) 法進行了體外抗腫瘤活性測試。結果表明：該類化合物對人胃癌細胞 (SGC-7901)和

2、人肺癌細胞 (A549)有增殖抑制作用，其中，含葡萄糖基片段的目標物a、b對SGC-7901有較優(yōu)的增殖抑制作用，IC50分別為12.9±0.9mol/L、14.3±1.1mol/L；含半乳糖基片段的目標物c、d對A549有較顯著活性，IC50分別為15.9±0.9mol/L、14.2±1.3mol/L。關鍵詞：膦酸酯；糖苷；合成；抗腫瘤活性中圖分類號：R914.4; O627.51 文獻標識碼： A 文章編號：1003-5214 (2018) 02-0000-00Synthesis and Antitumor Activity of Glycoside

3、 Derivatives Containing Phosphonate MoietyYANG Jia-qiang1, CHE Wan-li1, CHEN Lei1, YANG Xuan2, AO Hui1(1. School of Pharmacy, Zunyi Medical College, Zunyi 563003. Zhuizhou,China; 2. Chemistry Department, University of Manitoba, Winnipeg, MB, Canada, R3T4K6)Abstract: A series of glycoside derivatives

4、 containing phosphonate moiety (a-f) in yields of 79.6%-84.1% were synthesized by using -hydroxyphosphonate and bromine substituted monosaccharide as raw materials, alkaline ionic liquid BmimOH as catalyst under microwave irradiation. Their structures were confirmed by IR, 1HNMR and 13CNMR. These co

5、mpounds were tested for their in vitro antitumor activities on some tumor cell lines by 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) assay. The results indicated that all tested compounds could inhibit the proliferation of SGC-7901 human gastric cancer cells and A549

6、 human lung cancer cells. Among them, compounds a and b containing glucose fragment had better inhibition effect against SGC-7901 with IC50 values of 12.9±0.9 mol/L and 14.3±1.1 mol/L, respectively. Compounds c and d containing galactose fragment showed more remarkable activities against A

7、549 with IC50 values of 15.9±0.9 mol/L and 14.2±1.3 mol/L, respectively.Key words: phosphonate; glycoside; synthesis; antitumor activityFoundation item: International Cooperation Project of Guizhou Provincial Science and Technology Department (20147013)有機磷化合物由于具有多變的結構類型及良好的生物學特性，一直是人們關注的熱點

8、1，自從環(huán)磷酰胺、雙磷酸鹽等抗腫瘤含磷藥物相繼用于臨床以來，人們對有機磷化合物的抗腫瘤研究從未停止。膦酸酯類化合物作為一類重要的有機磷衍生物，近年研究極為廣泛，已經(jīng)成為有機磷化學發(fā)展的重要組成部分，在藥物研發(fā)中扮演著重要角色。研究表明，該類衍生物有抗腫瘤2、抗菌3、抗病毒4、除草5等多種生理活性。前期課題組運用活性結構拼合原理、生物電子等排原理等藥物設計理念，設計合成了多系列膦酸酯衍生物并進行了抗腫瘤活性研究6-11。結果表明：不同系列的膦酸酯衍生物均表現(xiàn)出潛在的抗腫瘤活性，進一步分析不同結構類型化合物的構效關系，發(fā)現(xiàn)含-對氟苯基甲基膦酸二乙酯和-鄰氟苯基甲基膦酸二乙酯的衍生物具有更優(yōu)秀抗腫瘤

9、活性，呈現(xiàn)出潛在的抗腫瘤藥效功能基團，值得進一步結構優(yōu)化與深入研究。糖作為自然界中分布最為廣泛的一類有機化合物，種類繁多，結構復雜多樣，糖類直接作為功能基團存在于許多以DNA為靶點的抗腫瘤化療藥物中，糖鏈作為分子的一部分不僅可以調(diào)節(jié)脂水分配系數(shù)、增加水溶性、調(diào)節(jié)血漿半衰期、改善藥動學性能等12。近年來有關糖衍生物在抗腫瘤藥物研究中扮演著重要角色，研究發(fā)現(xiàn)在含有糖基片段的抗腫瘤藥物中，其糖基片段上的豐富羥基對DNA等作用靶點具有特異性的識別與結合功能13，在抗腫瘤中發(fā)揮關鍵作用，如抗腫瘤藥物阿糖胞苷，及含糖片段的新型抗癌藥物PI-88等。基于上述理論研究和文獻依據(jù)，本文擬在前期研究工作基礎上，采

10、用基于片段的藥物發(fā)現(xiàn) (FBDD) 方法，在已研究的抗腫瘤活性片段-對氟苯基甲基膦酸二乙酯和-鄰氟苯基甲基膦酸二乙酯結構中引入不同種類的六碳糖，設計合成系列膦酸酯糖苷衍生物，進一步評價其供抗腫瘤活性，尋找高活性抗腫瘤候選化合物。1 實驗部分1.1 試劑與儀器葡萄糖、半乳糖、甘露糖，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；四丁基溴化銨（TBAB）、紅磷、溴水、乙酸、三乙胺，分析純，安耐吉化學公司；亞磷酸酯為自制2，反應溶劑用前需經(jīng)無水干燥處理，其余試劑與溶劑均為市售分析純。X-4型數(shù)顯熔點測定儀，上海精密儀器儀表有限公司；Varian 紅外光譜儀，KBr壓片，美國瓦里安技術公司；Varian 400

11、MHz核磁共振儀 (溶劑CDCl3, 內(nèi)標TMS) ，美國瓦里安技術公司；ELX800通用酶標儀，美國伯騰儀器公司。1.2 方法1.2.1 目標化合物膦酸酯糖苷衍生物的合成合成路線如下所示：a: R=o-F; b: R=p-F; c: R=o-F;d: R=p-F; e: R=o-F; f: R=p-F.中間體I的制備方法參照文獻 5-6，中間體II的制備方法參照文獻14。以a的合成為例，將0.820g（2.0 mmol）溴代葡萄糖中間體II，0.156g（1.0 mmol） Bmim OH離子液體加入反應瓶中，再加入0.644g（2.0 mmol）四丁基溴化銨（TBAB），0.556g（2.

12、0 mmol）中間體I，50 mL氯仿及50mL純化水。于微波合成儀中，設定微波功率900 W、反應溫度40 ，反應60 min，停止反應，分液漏斗分液，濃縮氯仿，得粗品，柱層析分離純化，得目標化合物a。再按照上述方法合成b-f。產(chǎn)物O,O-二乙基-(鄰-氟苯基)-(2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-吡喃葡萄糖基)-甲基膦酸酯（a）: 淡黃色粘稠液, 產(chǎn)率84.1 %，IR (KBr) ,v/cm-1: 3045, 2963, 2930, 2821, 1751, 1681, 1640, 1533, 1427, 1382, 1248, 1226, 1074, 1031; 1HNMR (400

13、MHz, CDCl3) ,: 6.957.36 (m, 4H, ArH), 5.52 (d, 1H, J=10.8 Hz, OCHO), 4.975.38 (m, 4H, 4OCH), 4.134.16 (m, 1H, PCH), 4.104.12 (m, 6H, 3OCH2), 1.892.08 (m, 12H, 4COCH3), 1.091.18 (m, 6H, 2CH3); 13CNMR (100 MHz, CDCl3) ,: 170.5, 169.9, 169.5, 169.2, 161.9, 136.5, 130.1, 129.9, 119.6, 115.7, 85.8, 73.2,

14、 69.9, 67.8, 63.6, 63.5, 61.5, 20.7, 20.6, 20.5, 20.2, 16.5, 16.4。產(chǎn)物O,O-二乙基-(對-氟苯基)-(2,3,4,6-四-O-乙?；?D-吡喃葡萄糖基)-甲基膦酸酯（b）: 淡黃色粘稠液, 產(chǎn)率80.3 %，IR (KBr) ,v/cm-1: 3038, 2962, 2931, 2823, 1746, 1685, 1651, 1532, 1430, 1377, 1246, 1231, 1062, 1022; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) ,: 6.907.26 (m, 4H, ArH), 5.58 (d, 1H

15、, J=11.2 Hz, OCHO), 4.955.40 (m, 4H, 4OCH), 4.124.15 (m, 1H, PCH), 4.094.11 (m, 6H, 3OCH2), 1.892.07 (m, 12H, 4COCH3), 1.111.17 (m, 6H, 2CH3); 13CNMR (100 MHz, CDCl3) ,: 170.4, 169.9, 169.7, 169.6, 161.8, 130.1, 129.5, 124.6, 115.7, 115.5, 83.1, 73.3, 70.4, 68.2, 63.7, 63.6, 62.2, 20.9, 20.8, 20.7,

16、16.6, 16.5。產(chǎn)物O,O-二乙基-(鄰-氟苯基)-(2,3,4,6-四-O-乙?；?D-吡喃半乳糖基)-甲基膦酸酯（c）: 淡黃色粘稠液, 產(chǎn)率79.6 %，IR (KBr) ,v/cm-1: 3041, 2966, 2934, 2823, 1758, 1685, 1651, 1531, 1426, 1379, 1251, 1230, 1063, 1025; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) ,: 7.127.26 (m, 4H, ArH), 5.55 (d, 1H, J=9.6 Hz, OCHO), 4.985.44 (m, 4H, 4OCH), 4.124.16 (m,

17、 1H, PCH), 4.024.10 (m, 6H, 3OCH2), 1.902.06 (m, 12H, 4COCH3), 1.101.18 (m, 6H, 2CH3); 13CNMR (100 MHz, CDCl3) ,: 170.4, 170.3, 169.6, 169.5, 130.1, 129.5, 128.8, 128.6, 127.7, 127.5, 83.3, 73.3, 70.5, 68.0, 63.4, 63.3, 62.1, 20.9, 20.8, 16.5, 16.4。產(chǎn)物O,O-二乙基-(對-氟苯基)-(2,3,4,6-四-O-乙?；?D-吡喃半乳糖基)-甲基膦酸酯（

18、d）: 淡黃色粘稠液, 產(chǎn)率83.8 %，IR (KBr) ,v/cm-1: 3036, 2958, 2920, 2833, 1764, 1681, 1630, 1523, 1437, 1369, 1266, 1232, 1054, 1019; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) ,: 6.877.18 (m, 4H, ArH), 5.43 (d, 1H, J=9.2 Hz, OCHO), 4.885.12 (m, 4H, 4OCH), 4.174.21 (m, 1H, PCH), 4.064.14 (m, 6H, 3OCH2), 2.102.36 (m, 12H, 4COCH3),

19、 1.151.43 (m, 6H, 2CH3); 13CNMR (100 MHz, CDCl3) ,: 171.2, 169.3, 130.1, 129.8, 128.4, 128.3, 127.5, 127.4, 127.0, 84.2, 72.5, 70.3, 68.1, 63.2, 63.1, 22.5, 22.4, 16.3, 16.2。產(chǎn)物O,O-二乙基-(對-氟苯基)-(2,3,4,6-四-O-乙?；?D-吡喃甘露糖基)-甲基膦酸酯（e）: 淡黃色粘稠液, 產(chǎn)率81.5 %, IR (KBr) ,v/cm-1: 3034, 2966, 2932, 2829, 1755, 1690,

20、 1645, 1529, 1422, 1387, 1251, 1220, 1063, 1026; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) ,: 7.177.32 (m, 4H, ArH), 5.56 (d, 1H, J=10.0 Hz, OCHO), 4.955.41 (m, 4H, 4OCH), 4.124.14 (m, 1H, PCH), 4.094.11 (m, 6H, 3OCH2), 1.952.02 (m, 12H, 4COCH3), 1.131.16 (m, 6H, 2CH3); 13CNMR (100 MHz, CDCl3) ,: 174.5, 169.9, 169.6,

21、169.4, 130.2, 128.8, 128.6, 128.5, 128.4, 128.1, 127.3, 85.9, 73.2, 71.6, 69.9, 67.9, 63.6, 63.5, 61.7, 20.7, 20.6, 20.5, 20.3, 16.6, 16.4。產(chǎn)物O,O-二乙基-(對-氟苯基)-(2,3,4,6-四-O-乙?；?D-吡喃甘露糖基)-甲基膦酸酯（f）: 淡黃色粘稠液, 產(chǎn)率80.7 %，IR (KBr) ,v/cm-1: 3036, 2960, 2935, 2832, 1750, 1683, 1639, 1545, 1428, 1371, 1235, 1220,

22、 1065, 1021; 1HNMR (400 MHz, CDCl3) ,: 6.997.26 (m, 4H, ArH), 5.41 (d, 1H, J=12.0 Hz, OCHO), 4.925.10 (m, 4H, 4OCH), 4.134.16 (m, 1H, PCH), 4.014.10 (m, 6H, 3OCH2), 2.052.31 (m, 12H, 4COCH3), 1.191.41 (m, 6H, 2CH3); 13CNMR (100 MHz, CDCl3) ,: 170.5, 169.8, 129.6, 129.4, 128.9, 128.6, 127.7, 127.1, 1

23、27.5, 84.5, 72.6, 70.5, 68.0, 63.2, 63.1, 22.6, 22.5, 16.4, 16.3。1.3 生物活性測試采用MTT法15，以順鉑為對照，測定目標化合物對腫瘤細胞A-549和SGC-7901的增殖抑制作用，兩點法 (Reed and Muench 法) 計算其IC50 值，結果見表4。2 結果與討論2.1反應條件的考察2.1.1催化劑對反應的影響以目標化合物a的制備為例，考察不同堿性介質(zhì)對反應的影響，結果見表1。表1不同催化劑對反應產(chǎn)率的影響Table 1 Effects of different catalysts on the reaction

24、yieldNaOHK2CO3Et3NBmimOHEmimCl-AlCl3產(chǎn)率/%012.710.231.328.9由表1可以看出，無機堿NaOH由于堿性太強，不能促進該反應的進行；在弱堿碳酸鉀、三乙胺、BmimOH、EmimCl-AlCl3參與反應的條件下，能促進該親電取代反應的進行，其中兩種堿性離子液體更是能提高目標物的產(chǎn)率，尤以BmimOH催化，有更好的產(chǎn)率，達到31.3%，可能原因為BmimOH作為一種接受質(zhì)子的Brnsted堿性離子液體更容易與氫結合，促進該反應的發(fā)生。因此，說明堿性離子液體對該親電取代反應有促進作用，應選用 BmimOH為催化劑。2.1.2離子液體摩爾分數(shù)對反應的影響

25、以化合物a的制備為例，考察堿性離子液體BmimOH摩爾分數(shù)對反應的影響，如表2所示。表2催化劑的用量對反應產(chǎn)率的影響Table 2 Effects of amount of catalyst on the reaction yieldBmimOH/mol%2030405060產(chǎn)率/%20.331.339.142.741.0由表2可看出，當BmimOH摩爾量從20 %增加至50 %，目標物的產(chǎn)率從20.3 %提高到42.7 %，但當其用量增至60 %，反應收率反而有一定降低，原因可能是過多堿性離子液體的存在，影響了產(chǎn)物的純化，降低了產(chǎn)率。因此，雖然離子液體摩爾量可以改善其收率，但需要控制使用量在

26、一定范圍，催化劑的摩爾分數(shù)在50%為最佳。2.1.3微波條件對反應的影響為了進一步優(yōu)化合成條件，提高反應收率，以化合物a的制備為例，考察了在離子液體催化作用下，微波輻射時間、輻射功率、反應溫度對產(chǎn)品收率的影響，結果見表3。表3 微波條件對產(chǎn)率的影響Table 3 Effects of microwave conditions on the reaction yield時間/min功率/ W溫度/ 產(chǎn)率/ %105002022.5205002029.0305002035.3405002042.6505002055.9605002058.1705002058.8606002060.46070020

27、64.0608002069.7609002073.36010002074.0609003080.2609004084.1609005021.580004024.7由表3可知，微波輔助合成能促進該反應的發(fā)生，使得目標物的產(chǎn)率大幅提高，當反應時間從10 min增加至60 min，產(chǎn)率由22.5 %提高到58.1 %，但是隨著反應時間進一步延長至70min，產(chǎn)率無明顯提高，表明微波反應時間的增加能提高產(chǎn)率，也需控制反應在合理的時間范圍；其次，微波功率對反應也有一定影響，隨著反應功率從500 W上升到1000 W，產(chǎn)率從58.1 %提高到74.0%，由于從900W到1000W，產(chǎn)率變化較小，因此，選擇

28、900W為該反應的最優(yōu)反應功率；最后，從表3中也可以看出，溫度對該反應的發(fā)生也有影響，當反應溫度增加至40，產(chǎn)率能到達84.1%，但是，進一步升高溫度至50，產(chǎn)率僅21.5%，TLC跟蹤顯示，較高的反應溫度可能引起了更多副反應的發(fā)生，具體副產(chǎn)物有待進一步確認。最優(yōu)微波條件為反應溫度40、功率900W、時間60min。綜上，以堿性離子液體BmimOH為催化劑，控制其摩爾分數(shù)為反應物的50%，反應溫度為40，反應功率為900W，反應時間為60min，是該反應的最佳反應條件。2.2波譜分析在IR 譜圖中，目標化合物在1745 1765cm-1之間有強的C=O伸縮振動峰，表明有糖基存在；在1500 c

29、m-1左右的中強峰則為苯環(huán)的C=C骨架振動；在1200cm-1附近有較強的吸收峰，則說明有P=O的存在。在1HNMR 譜圖中，化學位移在: 6.87 7.36左右出現(xiàn)了苯環(huán)氫的質(zhì)子峰，與一般苯取代的質(zhì)子吸收規(guī)律一致；在: 5.50附近出現(xiàn)的四重峰，則為糖基的端基CH質(zhì)子峰；: 2.00左右的則為乙酰基的甲基質(zhì)子峰。2.3抗腫瘤活性采用溴化噻唑藍四氮唑 (MTT) 法對目標化合物進行了體外抗腫瘤活性測試。結果如表1所示。表4 目標化合物對不同腫瘤細胞的IC50值 (mol/L)Table 4 IC50 (mol/L) values of target compounds for differen

30、t tumor cellsCompoundsIC50/ (mol/L)A-549SGC-7901a53.5±1.812.9±0.9b46.0±2.614.3±1.1c15.9±0.949.3±2.1d14.2.±1.355.8±2.3e30.3±0.727.8±1.2f順鉑28.1±1.05.6±0.722.6±0.95.2±0.8由表4可看出，目標物對腫瘤細胞A-549、SGC-7901有一定的增殖抑制活性，略低于對照藥物順鉑。由葡萄糖基片段組合的目標物

31、a和b對SGC-7901呈現(xiàn)較優(yōu)的抗腫瘤活性，IC50分別為12.9±0.9 mol/L、14.3±1.1 mol/L；化合物c和d結構中含有半乳糖基片段，對A-549有較好的增殖抑制作用，IC50分別為15.9±0.9 mol/L、14.2±1.3 mol/L；而含甘露糖基片段的目標物e和f對所測試腫瘤細胞A-549、SGC-7901的增殖抑制活性均不顯著。3 結論在前期研究基礎上，根據(jù)活性片段組合原理，在微波條件下，以堿性離子液體BmimOH為催化劑，設計合成了6個膦酸酯糖苷化合物；體外抗腫瘤活性篩選實驗表明：目標化合物對所測腫瘤細胞有一定增殖抑制活

32、性，其中含葡萄糖基片段的目標物對SGC-7901的抗腫瘤活性較顯著，含半乳糖基片段的目標物對A-549的增殖抑制活性較顯著。該類衍生物的結構優(yōu)化與抗腫瘤作用有待進一步深入研究。參考文獻：1 Zhao Yufen (趙玉芬), Yan Xiaomei (顏曉梅), Yang Chaoyong (楊朝勇), et al. Research progress in bioorganic phosphorus chemistry, bioanalysis and biosensing J. ,Journal of Xiamen University(Natural Science) 廈門大學學報(自然

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