定量PCR中ROX作用

1、使用Rox?的好處 一確保您獲得均一的定量PCF實驗結(jié)果。某些不含有Rox?均一化參比染料，或是無法在整個實驗過程中使用參比染料的定量PCF平臺，常常試圖貶低使用參比染料的價值。然而事實是，在定量 PCF反應(yīng)過程中Rox?染料是一種非常有價值的工具，能帶來 以下多方面好處：校正單次反應(yīng)運行中由于泡沫或蒸發(fā) /冷凝而導(dǎo)致的信號改變；為故障分析提供一項強有力的診斷工具：每次循環(huán)采集參比染料信號，不受PCR反應(yīng)影響；均一化校正由于移液誤差或蒸發(fā)所導(dǎo)致的批內(nèi)體積差異；均一化校正批間體積差異，提供更連續(xù)一致的批間重復(fù)Ct值。美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（AppliedBiosystems） 認識到均一化工具（R

2、ox?參比染料）的好處，并在所有 AB定量 PCF儀上優(yōu)化，以便實驗人員充分利用 Rox?參比染料所帶來的好處。此外，所有 AB生產(chǎn)的Real-TimePCR Master Mix試劑液都預(yù)摻入最合適量的 Rox?參比染料，從而確保每次實驗每個反應(yīng)都獲得最好的結(jié)果。Rox?校正單次反應(yīng)運行中的信號改變在理想反應(yīng)條件下，報告熒光染料的信號值起始于基線，當反應(yīng)體系中存在合適的靶分子時，報告熒光染料會隨著PCR反應(yīng)的進行，產(chǎn)生岀一條典型的擴增曲線，儀器軟件通過擴增曲線計算結(jié)果。如果擴增曲線只是簡單地根據(jù)報告染料的熒光信號而繪制，將會難以區(qū)分樣品的真實差異和隨機反應(yīng)條件帶來的人為差 異。現(xiàn)實中，有許多

3、事件可能影響報告熒光染料的表現(xiàn)：泡沫會形成熒光信號尖峰；蒸發(fā)或冷凝會造成反 應(yīng)體系濃度改變，導(dǎo)致不同反應(yīng)批次間熒光信號值增強或減弱（見圖1）。這類事件會同時影響報告熒光染料和Rox?參比染料，所以使用 AB的定量試劑與儀器時，根據(jù)Rn值繪制擴增曲線，采集的是報告熒光染料減去Rox?參比染料的熒光差值，任何潛在的人為誤差因素都被均一化，從而排除在最終結(jié)果之外。圖1 :多組分圖顯示Rox?信號和報告染料信號一同抬起，結(jié)果指示存在蒸發(fā)Rox?提供強大的故障分析工具Rox?參比染料作為故障分析工具的價值同樣不應(yīng)被低估。如果一個反應(yīng)失敗了，依靠Rox?參比染料確保在反應(yīng)過程中有持續(xù)不變的信號標準十分重要

4、。Rox?信號可以提供反應(yīng)設(shè)置的信息提示：無Rox?信號，很明確地表明沒有放置 MasterMix試劑；異常大的信號值強度差異，提示可能放置了2倍反應(yīng)體系；Rox?信號不規(guī)則變化，提示可能存在儀器故障。AB公司的技術(shù)支持在故障排除工作中總會使用RoX?參比染料，以幫助在更短時間內(nèi)獲得更多信息量的檢測結(jié)果。Rox?均一化反應(yīng)體積差異同時也證明AB定量P以下實驗數(shù)據(jù)證明了 Rox?參比染料在校正移液誤差所導(dǎo)致的反應(yīng)間均方差上的價值,CR儀器在使用或不使用 Rox?參比染料都能獲得很好的性能表現(xiàn)和精確性。實驗一：獲得高精確性不一定需要Rox?從AB RNase P Instrument verifi

5、cation Plate中取出反應(yīng)混合液，分別移液入對應(yīng)的Fast 96 孔板中。在AB 7500 Fast Real-Time PCR 儀上運行這塊板。數(shù)據(jù)分析分別采用2組模式，一組為正常的減去Rox?參比染料，另一組將參比染料設(shè)置成“None”，從而顯示使用Rox?信號均一化處理數(shù)據(jù)的價值。技術(shù)重復(fù)（24次重復(fù)）的結(jié)果顯示，使用 Rox?和不使用Rox?都得到了很好的結(jié)果。使用Rox? 一組的Ct值SD（標準偏差），不使用Rox? 一組的Ct值SD（標準偏差）（見圖2）。圖2 :技術(shù)重復(fù)的擴增曲線，分別采用Rox?校正（2A）和不采用Rox?校正（2B），顯示重復(fù)的結(jié)果聚合緊密，散布很小。

6、實驗二：Rox?均 一化處理校正移液錯誤通過系統(tǒng)地減少從 RNase P Plate中移出的樣品，加入分子純級水補齊體系，來模擬移液錯誤對運行精確性的影響。圖2描繪了實驗一中的原體積樣本，以及3個移液錯誤重復(fù)：分別含，和卩l(xiāng) of ddH20（樣本體積相應(yīng)減少）。數(shù)據(jù)分析時使用Rox?參比染料校正初始濃度差異（由移液錯誤導(dǎo)致的），得到的Ct值SD（標 準偏差）為；而不使用Rox?參比染料校正的 Ct值SD（標準偏差）為（見圖3）。圖3 :技術(shù)重復(fù)與3重模擬樣本移液錯誤（分別用，和卩l(xiāng) ddH2O替代等量樣本模板）的擴增曲線。使用 Ro x?可以校正起樣本始體積（或濃度）的輕微差異（3A），而不

7、使用Rox?時可以明顯看到輕微的散布（3B）。實驗三：Rox?均 一化處理確保定量反應(yīng)精確性相似地，直接從RNAse PPlate中移出反應(yīng)混合液進行重復(fù)實驗繪制標準曲線，比較使用Rox?和不使用Rox?分析時的精確性差異（見圖4），結(jié)果R2值分別是和。圖4 :重復(fù)RNAseP標準品的擴增曲線，數(shù)據(jù)分析時分別用Rox?(4A)和不用RoX?(4B)，結(jié)果表現(xiàn)都很好。當反應(yīng)體系中部分樣品被1卩l(xiāng)ddH20替代，RoX?均一化處理能夠校正此類小錯誤，而當分析不包含RoX?參比染料校正時，各個標準組中很明顯地出現(xiàn)了更大的點散布(見圖5和表1) o表1：計算重復(fù)進行 RNAseP標準曲線實驗的標準偏差(SD)，將其與1卩l(xiāng)反應(yīng)混合液被ddH2O取代的實驗 結(jié)果比較。使用Rox?校正可有效減少錯誤。圖5:重復(fù)RNAseP標準品，及模擬移液錯誤樣本(1卩l(xiāng)反應(yīng)混合液被ddH2O取代)，繪制擴增曲線。數(shù)據(jù)分析時分別使用Rox?(5A)和不用RoX?(5B)，證明RoX?可以校正由輕微起始樣本濃度或反應(yīng)體積錯誤而造成的差異。表1顯示了各個濃度重復(fù)反應(yīng)的結(jié)果標準偏差(SD)。其中，直接從 RNAsePplate中移出反應(yīng)混合液進行的重復(fù)實驗，使用Rox?或不使用RoX?所得