不同商品規(guī)格黃芪中2種苷類成分的含量測(cè)定2

1、 不同商品規(guī)格黃芪中2種苷類成分的含量測(cè)定 摘要：目的：比較不同商品規(guī)格黃芪中2種苷類成分(黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷)的含量。方法：采用高效液相色譜法，對(duì)不同商品規(guī)格黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)黃芪藥材中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量分別為0.114 2、0.129 8、0.157 3、0.284 3 mg.g1和0.054 7、0.057 4、0.0481、0.052 2 mg.g1。結(jié)論：黃芪甲苷含量與黃芪藥材商品等級(jí)成負(fù)相關(guān)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量與其商品等級(jí)沒有規(guī)律。建議等級(jí)劃分在考慮藥材外觀性狀直徑、長(zhǎng)短時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同的應(yīng)用需

2、求，結(jié)合有效成分的含量測(cè)定進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。 關(guān)鍵詞：黃芪：商品等級(jí)；黃芪甲苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；含量測(cè)定黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus (Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus embranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，為臨床常用補(bǔ)氣中藥之一1?；瘜W(xué)成分研究結(jié)果表明，黃芪藥材主要含皂苷類、黃酮類和多糖類等活性成分2。藥理作用研究表明，皂苷類為其抗病毒、保肝、抗腫瘤、改善心臟功能、抗炎、鎮(zhèn)痛及抑制滑膜成纖維細(xì)胞增殖等生物活性3；黃酮類成分具有調(diào)節(jié)免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突

3、變、清除自由基等多種生物活性4。其中皂苷類化合物主要是黃芪甲苷，具有強(qiáng)心、清除氧自由基、Ca2+通道的調(diào)控、減少炎癥物質(zhì)的產(chǎn)生、抗衰老、抗高糖、抗病毒及心臟、腦、肝、腎的保護(hù)作用等藥理作用5；黃酮類化合物主要包括毛蕊異黃酮、芒柄花素等2，而毛蕊異黃酮具有抗局部缺血損傷、阻斷鈣離子通道、舒張血管、減輕血管緊張素引起的內(nèi)皮細(xì)胞損傷等多種血管保護(hù)效應(yīng)6 黃芪商品規(guī)格以長(zhǎng)短、粗細(xì)分為四個(gè)等級(jí)7，市場(chǎng)上多以飲片大小決定質(zhì)量?jī)?yōu)劣及價(jià)格高低8?，F(xiàn)行版中國(guó)藥典對(duì)黃芪的質(zhì)量評(píng)價(jià)主要是采用高效液相色譜法對(duì)其所含的黃芪甲苷、黃酮類進(jìn)行含量測(cè)定9，中國(guó)藥典也是測(cè)定其黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷1，有報(bào)道黃芪不同商品規(guī)

4、格中黃酮類含量不同8,10，而不同商品等級(jí)規(guī)格黃芪中2種苷類成分的含量測(cè)定則尚未見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)采用高效液相色譜法測(cè)定黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，比較不同商品規(guī)格對(duì)黃芪中2種苷類成分含量的影響，為研究黃芪中黃芪甲苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的變化提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考依據(jù)。1儀器與試藥1.1儀器 1100 LC高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，DAD檢測(cè)器，ELSD檢測(cè)器)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；W2018型恒溫水浴鍋(上海申生科技有限公司)；RE-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHZ-III循環(huán)水式真

5、空泵(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)；AE240天平梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司；FZl02 型微型植物試樣粉碎機(jī)(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)。2.2試藥 黃芪甲苷對(duì)照品、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)分別為：110781200613、20633674，供含量測(cè)定用)；甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)默克公司)，水為超純水，其他試劑均為分析純。黃芪藥材購(gòu)買于重慶市萬(wàn)州區(qū)中藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校李潔玉老師鑒定為豆科植物蒙古黃芪Amembranaceus var.mongholicus或膜莢黃芪A.embranaceus，的干燥根；不同商品規(guī)格黃芪區(qū)分：一級(jí)：長(zhǎng)5

6、0以上，上中部直徑15 以上，末端直徑不少于0.5。 二級(jí)：長(zhǎng)40以上，上中部直徑1以上，末端直徑不少于0.4，間有老皮。三級(jí)：根不分長(zhǎng)短，上中部直徑0.7，末端直徑不少于0.3，間有破短節(jié)子、老皮。四級(jí)：又名毛條，即細(xì)支根和須根。2方法與結(jié)果2.1黃芪甲苷的定量分析2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent SB-C18柱(46 mm× 150，5um)；流動(dòng)相為乙腈-水(32：68)；流速：1 mL.min-1；柱溫30：ELSD漂移管溫度：90；氮?dú)饬髁浚?.5 mL.min-1；進(jìn)樣量10uL，碰撞器：關(guān)。2.1.2溶液的配制2.1.2.1對(duì)照品溶液的制備 取

7、黃芪甲苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含400ug的溶液，即得。2.1.2.2供試品溶液的制備 取本品中粉約2.0g，精密稱定，置索氏提取器中，精密加入甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇適量，加熱回流4h，靜置放冷，濾過，回收甲醇至干，殘?jiān)诱麴s水10mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)铀?mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱，以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40乙醇30mL洗脫，棄去洗脫液，繼續(xù)用 70乙醇80mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10m

8、L容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。2.1.2.3線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液(含黃芪甲苷400ugmL-1)5、10、15、20、30 uL，注入液相色譜儀，得進(jìn)樣量X(ug)與峰面積Y的線性方程。結(jié)果表明，黃芪甲苷進(jìn)樣量在2.0120 ug與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=1.678 6 C+4.934 2，r=0.999 2(n=5)。2.1.2.4精密度試驗(yàn) 取黃芪甲苷對(duì)照品溶液(400ugmL-1)，進(jìn)樣量10uL，連續(xù)測(cè)定，進(jìn)樣5次，測(cè)定黃芪甲苷對(duì)照品峰面積的RSD為122(n=5)，表明儀器精密度良好。2.1.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黃芪樣品5份(一等品)，按“2.

9、1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備及“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得黃芪甲苷RSD為12l(n=5)，表明本方法重復(fù)性良好。2.1.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(一等品)，室溫密閉放置，分別在制備后0、4、8、12、24h進(jìn)樣，測(cè)定黃芪甲苷峰面積，RSD為1.88(n=5)，表明樣品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.1.2.7加樣同收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的黃芪約材約2.0g(一等品)，共6份，分別精密加入一定量的黃芪甲苷對(duì)照品，按“2.1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備及“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，其平均回收率為99.22，RSD為1.28，符合分析要求。2128

10、樣品含量測(cè)定 分別按“2.1.22”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，平行3份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積代入回歸方程中計(jì)算黃芪甲苷的含量，結(jié)果見表1。表1不同商品規(guī)格黃芪中黃芪甲苷的含量(n=3)No.不同商品規(guī)格 黃芪甲苷mg.g-1 RSD% 1 一級(jí) 0.114 2 1.282 二級(jí) 0.129 8 1.623 三級(jí) 0.157 3 1.544 四級(jí) 0.284 3 1.63 22毛蕊異黃囿可葡萄糖苷的定量分析2.2.1笆譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱為Agilent SB-C18柱(4.6 ×150，5um)；流動(dòng)相為乙腈-0.2甲酸溶液，梯度洗脫：O20 min

11、(20A40A)，2030 min(40A)；溫度為30。C；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm；流速為1mLmin-1進(jìn)樣量10uL。2.2.2溶液的配制2.2.2.1對(duì)照品溶液的制備 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含100ug的溶液，即得。2.2.2.2供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號(hào)篩)約2.0g，精密稱定，置250mL圓底燒瓶中，精密加入甲醇50mL，稱定重量，加熱回流4h，靜置放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即得。2.2.2.3線性關(guān)系考察 分別

12、精密吸取對(duì)照品溶液(含毛蕊異黃酮葡萄糖苷100 ug.mL-1)l、5、lO、15、20 uL，注入液相色譜儀，得進(jìn)樣量x(ug)與峰面積y的線性方程。結(jié)果表明，毛蕊異黃酮葡萄糖苷進(jìn)樣量在0.102.00 ug與峰面積成良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=24933.180 9C+0.3064，r=0.999 1(n=5)。2.2.2.4精密度試驗(yàn) 取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液(100 ug.mL-1)，進(jìn)樣量10uL，連續(xù)測(cè)定，進(jìn)樣5次，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品峰面積的RSD為0.24(n=5)，表明儀器精密度良好。2.2.2.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一黃芪樣品5份(一等品)，按“2.2.2.2”

13、項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備及“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，測(cè)得毛蕊異黃酮葡萄糖苷RSD為128(n=5)，表明本方法重復(fù)性良好。2.2.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液(一等品)，室溫密閉放置，分別在制備斤O、4、8、12、24 h進(jìn)樣，測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積，RSD為1.48(n=5)，表明樣品溶液住24 h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.2.7加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的黃芪約材約1.Og(一等品)，共6份，分別精密加入一定量的毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品，按“2222”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備及“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果表明，其平均吲收率為9829，RSD為176，符合分析要

14、求。2.2.2.8樣品含量測(cè)定 分別按“2222”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備，平行3份，按“221”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰而積代入回歸方程中計(jì)算毛蕊異黃酮葡萄苷的含量，結(jié)果見表2。表2不同商品規(guī)格黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量(n=3) No.不同商品規(guī)格 毛蕊異黃酮葡萄糖苷/mg.g-1RDS/% 1 一級(jí) 0.054 7 1.322 二級(jí) 0.057 4 1.723 三級(jí) 0.048 1 1.085 四級(jí) 0.052 2 1.82 3討論 由表1和表2可知，結(jié)果表明黃芪不同商品規(guī)格中2種苷類成分含量有一定差異，黃芪藥材中黃芪甲苷的含量為四級(jí)三級(jí)二級(jí)一級(jí)，毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量為二級(jí)>

15、;一級(jí)四級(jí)三級(jí)，黃芪藥材中黃芪甲苷的含量隨其等級(jí)降低含量越高，而毛蕊異黃酮葡萄糖苷則規(guī)律性不強(qiáng)，這與田圣志等8，10-11所測(cè)得的結(jié)果趨勢(shì)基本一致。其含量的高低對(duì)其質(zhì)量的影響較大，制定藥材及飲片標(biāo)準(zhǔn)以及炮制制劑生產(chǎn)過程時(shí)應(yīng)加以重視。因此本試驗(yàn)對(duì)黃芪商品藥材規(guī)格與黃芪質(zhì)量的關(guān)系進(jìn)行了初步探討，對(duì)黃芪藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有積極意義，值得進(jìn)一步研究。 由于本試驗(yàn)所取樣品有一定的局限性，但仍有一定的代表性，市售黃芪根據(jù)其長(zhǎng)短、粗細(xì)來(lái)分等級(jí)從而決定其價(jià)格，存在一定的不合理性，也提示在制定黃芪藥材和飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時(shí)應(yīng)予考慮黃芪商品規(guī)格的區(qū)別。 本試驗(yàn)結(jié)果表明黃芪藥材中較細(xì)者黃芪甲苷含量較高，而毛蕊異黃酮?jiǎng)t無(wú)較好的規(guī)律性。近年來(lái)，隨著黃芪野生資源匱