使用方法介紹

1、Oligo使用方法介紹作為目前最好、最專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，Oligo的功能很強(qiáng)，在這里我們介紹它的一些主要功能：如：普通引物對(duì)的搜索、測(cè)序引物的設(shè)計(jì)、雜交探針的設(shè)計(jì)以及評(píng)估引物對(duì)質(zhì)量等等。在正式進(jìn)行引物設(shè)計(jì)前，我們首先面臨的一個(gè)任務(wù)就是向Oligo程序?qū)肽０逍蛄?，根?jù)不同的實(shí)驗(yàn)情況，導(dǎo)入模板有三種方法：1， 直接用鍵盤輸入：a， 點(diǎn)擊file菜單中的New Sequence 浮動(dòng)命令，或直接點(diǎn)擊工具欄中的New Sequence命令，進(jìn)入序列展示窗口；b， 此時(shí)即可鍵入DNA序列；c， 如果需要的話，Oligo提供堿基回放功能，在邊鍵入時(shí)邊讀出堿基，防止輸入錯(cuò)誤。點(diǎn)擊Edit菜單中的“Rea

2、dback on”即可。2， 利用復(fù)制和粘貼：當(dāng)我們序列已經(jīng)作為TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件.html格式，這個(gè)功能就顯得很有用了。在相應(yīng)文件中復(fù)制序列后在序列展示窗口粘貼，oligo會(huì)自動(dòng)去除非堿基字符。當(dāng)序列輸入或粘貼完成后，點(diǎn)擊Accept/Discard菜單中的Accept浮動(dòng)命令，即可進(jìn)入引物設(shè)計(jì)模式。3， 如果序列已經(jīng)保存為Seq格式或者FASTA，GenBank格式時(shí)，oligo就可以直接打開(kāi)序列文件。點(diǎn)擊File菜單中的“Open”浮動(dòng)命令，找到所需文件，打開(kāi)即可。進(jìn)入引物設(shè)計(jì)模式后，oligo一般會(huì)彈出三個(gè)窗口，分別是6堿基頻率窗口

3、，堿基退火溫度窗口以及序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口，其中的退火溫度窗口是我們引物設(shè)計(jì)的主窗口，其它的兩個(gè)窗口則在設(shè)計(jì)過(guò)程中起輔助作用，比如6堿基頻率窗口可以使我們很直觀地看到所設(shè)計(jì)引物在相應(yīng)物種基因組中的出現(xiàn)頻率，如果我們的模板是基因組DNA或混合DNA時(shí)，該信息就顯得有用了，而內(nèi)部穩(wěn)定性窗口則可以顯示引物的5端穩(wěn)定性是否稍高于3端等。一，普通引物對(duì)的搜索：以Mouse 4E（cDNA序列）為例。我們的目的是以Mouse 4E（2361 bp）為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增出600800bp長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物。1，點(diǎn)擊“Search“菜單中的”For Primers and Probes“命令，進(jìn)入引物搜索

4、對(duì)話框；2，由于我們要設(shè)計(jì)的是一對(duì)PCR引物，因此正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上，同時(shí)選上Compatible pairs。在Oligo默認(rèn)的狀態(tài)下，對(duì)此引物對(duì)的要求有：a，無(wú)二聚體；b，3端高度特異，GC含量有限定，d，去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。3，剩下的工作是確定上、下游引物的位置及PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度以及引物設(shè)計(jì)參數(shù)。單擊：“search Ranges”按鈕，彈出“Search Ranges”對(duì)話框。輸入上游引物的范圍：12000，下游引物的位置：1002300；PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度600800bp。單擊“Paramaters”按鈕進(jìn)入“Search Parameters”對(duì)話框，對(duì)話框種分三個(gè)活頁(yè)，分別是

5、：不同設(shè)定，參數(shù)以及更多參數(shù)。在“普通設(shè)定”窗口，為我們提供了對(duì)引物非常直觀的設(shè)定方法，從高到低分六個(gè)等級(jí)，最后還有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)我們對(duì)引物的各種參數(shù)的含義及應(yīng)該設(shè)定多大值并不是特別清楚時(shí)，就可以直接設(shè)定Very high/High等來(lái)完成對(duì)引物設(shè)計(jì)參數(shù)的設(shè)定。當(dāng)我們選中“Automatically Change String”后，Oligo會(huì)在引物搜索過(guò)程中：如果在高等級(jí)設(shè)定中無(wú)法找到引物對(duì)時(shí)自動(dòng)降低一個(gè)定級(jí)來(lái)進(jìn)行搜索，知道找到引物對(duì)。在設(shè)計(jì)反向PCR引物對(duì)時(shí)，就選中“Inverse PCR”復(fù)選框。我們還可以讓引物的長(zhǎng)度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE？（Prime Effitio

6、ns，引發(fā)效率）。也可以限定所選引物對(duì)的最大數(shù)目。在“Parameters”窗口中，實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只有引物的長(zhǎng)度，根據(jù)試驗(yàn)的要求作相應(yīng)的改變，如23nt。其他參數(shù)就使用Oligo的默認(rèn)值，一般無(wú)需改變。在“More Parameters“窗口中，一般也無(wú)需作任何改變，直接用Oligo的默認(rèn)值。4，點(diǎn)擊“確認(rèn)”“Ok”進(jìn)入搜索窗口，再次單擊“OK”后，Oligo自動(dòng)完成引物對(duì)的搜索，并出現(xiàn)一個(gè)搜索結(jié)果窗口。顯示出得到的引物對(duì)數(shù)目。5，點(diǎn)擊“Ok”，出現(xiàn)“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7對(duì)引物的簡(jiǎn)單信息，引物位置，產(chǎn)物長(zhǎng)度，最佳退火溫度及GC含量。單擊“Sort”按鈕，可以按產(chǎn)

7、物長(zhǎng)度，最佳退火溫度及GC含量從小到大或從大到小的順序排列。6，點(diǎn)擊任意一對(duì)引物，在旁邊馬上彈出一個(gè)叫“PCR”的窗口，在窗口中我們可以看到這對(duì)引物在模板中的大概位置，最佳退火溫度（該溫度可以直接應(yīng)用于我們實(shí)際PCR中的第二步退火）。另外還有引物的Tm值，GC含量，引發(fā)效率，同時(shí)還計(jì)算出了產(chǎn)物的Tm值于引物Tm值的差異以及引物間Tm值的差異。一般我們盡量保持前者在20度以內(nèi)，后者在56度以內(nèi)。點(diǎn)擊不同的引物對(duì)時(shí)，PCR窗口內(nèi)容同時(shí)作相應(yīng)的改變。7，要想了解引物的詳細(xì)信息，如二聚體，發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成情況、組成、Tm值和錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)等，這時(shí)只需點(diǎn)擊“Analyze”菜單中的相應(yīng)命令，就可以分別得到相關(guān)

8、信息。例如點(diǎn)擊“Duplex Formation”，我們就可以得到上游引物間，下游引物間及上下游引物間形成二聚體的情況。同理，“Hairpin Formation”，“Composition and Tm”，“False Priming Sites”等命令就可以顯示出相關(guān)信息。所有這些分析的結(jié)果都有助于我們從Oligo搜索得到的多對(duì)引物中選擇最佳的引物對(duì)。需要說(shuō)明的是，1，如果一次搜索得到的引物對(duì)太多時(shí)，我們可以適當(dāng)提高選定的條件和規(guī)定更合適的搜索范圍來(lái)減少引物對(duì)數(shù)；2，引物一般盡量不要在3端或是離3端太近的位置形成二聚體，同時(shí)二聚體的自有能絕對(duì)值盡量小于10；3，對(duì)于錯(cuò)誤引發(fā)，在普通PCR中

9、，如果引發(fā)效率在160 points以上時(shí)，就可能出現(xiàn)雜帶，在測(cè)序反應(yīng)中，錯(cuò)誤引發(fā)效率則應(yīng)該嚴(yán)格控制在120 points以下。8，Oligo中每對(duì)引物的詳細(xì)信息可以直接導(dǎo)出為一個(gè)文本文件：首先點(diǎn)擊“File”菜單中的“Print/Save Options”，在出現(xiàn)的對(duì)話框中的普通設(shè)定選中“Selected”；在“Analyze I”中選擇需要保存的信息，在“Analyze II”中選中PCR。單擊確定按鈕退出，這時(shí)再次點(diǎn)擊“File”菜單，Save浮動(dòng)命令中的“Data Save as”，選擇路徑及文件名即可。二，測(cè)序引物的設(shè)計(jì)：在oligo中，測(cè)序引物設(shè)計(jì)過(guò)程與普通引物設(shè)計(jì)大部分都很相似。

10、還是以Mouse 4E為例，假如我們要在600800bp的位置設(shè)計(jì)一條測(cè)序引物。OpenSearch在“Search”窗口中，選中“Sequece Primer”，同時(shí)去除負(fù)鏈Search的選中在“Search Range”窗口，輸入正鏈的600800bp在“Parameters”中選定 very high ，引物長(zhǎng)度改為18bp結(jié)果得到11條測(cè)序引物，與普通引物同理，根據(jù)其詳細(xì)信息就可以挑選到一條最佳的測(cè)序引物。三，探針的設(shè)計(jì)：探針的設(shè)計(jì)與測(cè)序引物設(shè)計(jì)基本相同，只需使“Search”窗口的探針設(shè)計(jì)選中，改變探針的長(zhǎng)度就可以。四，評(píng)估引物對(duì)：我們?cè)诟鞣N文獻(xiàn)中查到的引物，如果直接進(jìn)行PCR，往往

11、很難重復(fù)別人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這時(shí)就想到，是不是引物的質(zhì)量有問(wèn)題？能不能用軟件來(lái)對(duì)這些問(wèn)題引物進(jìn)行一些分析呢？答案時(shí)肯定的。1，點(diǎn)擊File菜單中的New命令；2，在“Edit New Sequence”的窗口中用鍵盤輸入上游引物；3，如果該引物的首位置不是1的話，可以在“Edit”窗口中輸入新的5端位置數(shù)字，如20；4，點(diǎn)擊Accept/Discard菜單的Accept命令；5，如果引物序列長(zhǎng)度不同于當(dāng)前的引物的話，可以從“Change”菜單中改變當(dāng)前的引物長(zhǎng)度；6，選取當(dāng)前序列為上游引物（點(diǎn)擊“upper”按鈕）；7，從Edit菜單中選取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗

12、口中輸入下游引物的序列；8，在Edit窗口的上角處，輸入相應(yīng)的5位置；9，選取“Accept and Quit”命令；如果想讓程序給出最佳退火溫度，在此時(shí)的對(duì)話框中輸入PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度以及GC含量所占百分比，一般哺乳動(dòng)物的cDNA序列中GC大約占44。10，點(diǎn)擊OK就可以在“Analyze”菜單中完成各種分析了。心得yvette wrote:對(duì)于作PCR的來(lái)說(shuō)，最難的莫過(guò)于設(shè)計(jì)引物了，理論現(xiàn)在已經(jīng)很多了，但是真正實(shí)踐起來(lái)是要付出一定的心智的，記得曾經(jīng)看到某一位主任說(shuō)他設(shè)計(jì)了上千對(duì)引物，從沒(méi)有失手的時(shí)候，真是讓我佩服得五體投地。最近看了一下OLIGO6.0的使用說(shuō)明，英文的，感覺(jué)有很多地方還是講

13、得不很明白，比如 Nested primers design 及 multiplex PCR Primer design.下面我先來(lái)講講普通的利用OLIGO 設(shè)計(jì)引物的方法吧：1 從文件菜單打開(kāi)模板序列，當(dāng)然，不是隨便什么序列都可以打開(kāi)的，要有特定的格式，一般擴(kuò)展名為 *.seq的序列可以直接打開(kāi)，或者就從文件菜單選擇new sequence打開(kāi)一個(gè)空窗口，然后利用復(fù)制/粘貼也可以導(dǎo)入模板序列，或者直接在該窗口中寫，然后要打開(kāi)文件菜單旁邊的 accept 菜單，選accept就可以了；這時(shí)候有三個(gè)窗口，重疊在一起，很不方便看，可以從window菜單選Tile，這樣，三個(gè)窗口就平行排列了。2 從

14、search菜單選primers and probes，打開(kāi)了引物搜索窗3 點(diǎn)黑PCR下面的compatible pairs 前面的小圓孔4 在oligonucleotide with GC clamp 及 Eliminate false priming 前的小方格里打上勾5 如果在PCR中可能存在其他的模板，要想使所設(shè)計(jì)的引物與該模板不會(huì)形成錯(cuò)配，可在 And continue above search in other files 的條目前方格中打勾，這時(shí)會(huì)出現(xiàn)一個(gè)新的 select files窗，導(dǎo)入可能會(huì)形成錯(cuò)配的模板序列。點(diǎn)OK6 點(diǎn)Search ranges按鈕，輸入你想要的上游和

15、下游引物在模板序列上的區(qū)間及想要的產(chǎn)物的長(zhǎng)度，點(diǎn)OK7 點(diǎn)parameters 即引物參數(shù)按鈕，一般將搜索嚴(yán)謹(jǐn)性設(shè)為high，如果搜不到，再降低嚴(yán)謹(jǐn)性，另外，在adjust length to match Tms前的方格中打勾。點(diǎn)OK8 點(diǎn)擊OK開(kāi)始自動(dòng)搜索9 搜索完成后，在search status窗口的下部選show:primer primers, 點(diǎn)OK10 得到的引物可以根據(jù)位置、長(zhǎng)度、退火溫度及GC含量進(jìn)行排序（sort)11 點(diǎn)擊您所想要的就打開(kāi)了一個(gè)窗口顯示引物的位置、退貨溫度、GC含量、PE(Priming efficiency 引發(fā)效率)等。12 從文件菜單點(diǎn)擊New Dat

16、abase ，然后從import菜單點(diǎn)擊 upper primer 和lower primer 就可以將您所需要的上下游引物序列導(dǎo)入到數(shù)據(jù)庫(kù)中，至于如何生成引物報(bào)告單我就不甚了了，感覺(jué)這個(gè)功能不如primer premier好使。還希望知道如何使用的兄弟不吝賜教一下叻。Nested Primer pairs Search與上述自動(dòng)搜索差不多，有一下幾點(diǎn)不同：1 打開(kāi)search菜單后，不要選定 “ And continue above search in other files ”2 打開(kāi)parameters菜單后，注意不要選定“ Inverse PCR” 框 ，同樣選定“adjust len

17、gth to match Tms” 框3 開(kāi)始搜索后得到結(jié)果顯示在“Primer pairs窗口中，從analyze菜單中 選定multiplexing,得到一個(gè)顯示所有搜索到的引物在模板上的位置的窗口，直接在該窗口中選擇您所要的引物，在您所要的引物的小方塊上點(diǎn)擊一下，positive strand primer 選定后就從紅色變成了綠色，negative strand primer 選定后就從藍(lán)色變成了綠色。先選擇巢式PCR的一對(duì)外引物，然后選擇一對(duì)內(nèi)引物，選定后點(diǎn)擊pairs就打開(kāi)了顯示您所選定引物的窗口4 從文件菜單點(diǎn)擊New Database ，然后從import菜單點(diǎn)擊multiplexed primers就將您所選定的引物導(dǎo)入到一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中，保存。好像從export 菜單可以生