轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選方法和實(shí)驗(yàn)步驟

1、.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的穩(wěn)定篩選1、藥物篩選前的準(zhǔn)備藥篩前應(yīng)確定藥物篩選濃度，不同細(xì)胞系具有不同的藥物敏感度，因此在篩選前應(yīng)該用在藥物濃度范圍內(nèi)設(shè)定濃度梯度來確定篩選穩(wěn)定克隆的藥物濃度。藥物濃度一般確定為能使未轉(zhuǎn)染細(xì)胞在7天之內(nèi)全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般時間很短，只需要3-4天即可。2、藥物篩選注意事項(xiàng)（1）藥篩的時間加藥時間一般為轉(zhuǎn)染后48h。但由于慢病毒表達(dá)較慢，因此利用慢病毒感染將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞的方法，加藥時間一般為72h空白對照加藥篩選時，最好設(shè)置空白對照，即未轉(zhuǎn)染細(xì)胞同時加藥，待空白對照中細(xì)胞全部死亡，轉(zhuǎn)染組中不具有抗藥性的細(xì)胞基本藥殺完，但還需繼續(xù)加藥。（2）換液如果加藥后

2、，細(xì)胞死亡較多，需及時換液，以防死細(xì)胞釋放有害物質(zhì)導(dǎo)致具有抗藥性的細(xì)胞死亡。另外，隨著細(xì)胞的代謝，抗生素的活性會降低，因此，每隔3-5天應(yīng)更換一次抗生素篩選培養(yǎng)液。3、克隆篩選注意事項(xiàng) 若轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒帶有熒光標(biāo)記，不管是以下哪種篩選克隆的方法，都應(yīng)該選擇帶有熒光較強(qiáng)的細(xì)胞克隆，因?yàn)榧铀幒Y選時，可能會產(chǎn)生耐藥性的細(xì)胞，因此最好選擇帶有熒光較強(qiáng)的細(xì)胞。若是轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒不帶有熒光，那么只能盲挑。不管是帶有或者不帶有熒光標(biāo)記，都應(yīng)該挑出克隆后進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證存在不成功的概率。因此，挑克隆時，應(yīng)盡量多挑幾個克隆，20個左右。精品.4、穩(wěn)定克隆篩選步驟（1）有限稀釋法步驟a) 將藥篩后的細(xì)胞（一般長滿六孔板即可

3、,若細(xì)胞生長很快藥篩時可以在10cm的dish中進(jìn)行）用胰酶消化下來b) 對消化后的細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)（如果細(xì)胞數(shù)量過大，可先稀釋后計(jì)數(shù)）c) 計(jì)算后，用槍頭吸取約200個細(xì)胞（其中有部分為死細(xì)胞）到10ml培養(yǎng)液中充分混勻，剩下的大部分細(xì)胞凍存保種d) 然后將以上10ml細(xì)胞懸液加到96孔板中，每孔100ul，這樣有的孔就可能只有一個細(xì)胞，過程中注意不時用槍頭吹打混勻細(xì)胞懸液（一個96孔板得到的克隆可能較少，可以用同樣的方法做2-3個96孔板）e) 待細(xì)胞貼壁后，逐孔在顯微鏡下觀察，沒有細(xì)胞或者多余一個細(xì)胞的孔劃叉，只有一個細(xì)胞的孔劃勾，以做好標(biāo)記，如果只有一個細(xì)胞的孔數(shù)量太少，可將一個孔內(nèi)有

4、兩個細(xì)胞的孔也劃勾，但這樣克隆就可能不純。f) 等細(xì)胞長起來以后，從96孔板到24孔板，再到6孔板逐漸擴(kuò)大培養(yǎng)g) 細(xì)胞分6孔板中養(yǎng)起來后，可分出部分細(xì)胞提蛋白，用western驗(yàn)證克隆是否為我們所需要的克隆，也可以用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，若驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)克隆并不是所需要的克隆，即失敗的克隆，就扔掉，保留驗(yàn)證成功的克隆并大量培養(yǎng)h) 首次驗(yàn)證成功的克隆養(yǎng)兩周后再次驗(yàn)證，若仍能保持特性，表示篩出的克隆較穩(wěn)定，這樣較為穩(wěn)定克隆即可大量培養(yǎng)保種，并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)精品.（2）無限稀釋法a) 將藥篩后的細(xì)胞（一般長滿六孔板即可）用胰酶消化下來b) 對消化后的細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)（如果細(xì)胞數(shù)量過大，可先稀釋后計(jì)數(shù)）c

5、) 計(jì)算后，吸出約5000個細(xì)胞，鋪到10cm的dish中，搖勻d) 待細(xì)胞貼壁后，在顯微鏡下找到單個細(xì)胞，用馬克筆在dish的底部做好標(biāo)記，然后放到孵箱里培養(yǎng)e) 待單個細(xì)胞長成了細(xì)胞團(tuán)（約10個），在顯微鏡下觀察，如果有兩個細(xì)胞團(tuán)靠得很近，則用馬克筆在底部做好標(biāo)記，然后在安全柜內(nèi)用白槍頭刮掉周圍舍棄的細(xì)胞團(tuán)，并不斷在顯微鏡下觀察，看周圍的細(xì)胞是否已經(jīng)都被刮掉。然后換培養(yǎng)液（將刮掉的細(xì)胞棄去）f) 放到孵箱里培養(yǎng)數(shù)天（細(xì)胞團(tuán)較大，約一兩百個），克隆在肉眼下可見g) 將培養(yǎng)液倒掉，用PBS洗兩遍，再吸10ul的胰酶在標(biāo)記好細(xì)胞團(tuán)的地方不停的快速吹打約1-2min，最后將槍頭里細(xì)胞懸液打到24孔板內(nèi)培養(yǎng)即為挑出的一個克隆，此過程切記不能過長，以免dish太干導(dǎo)致細(xì)胞死亡h) 照7的方法每種細(xì)胞至少挑出15個克隆，培養(yǎng)一段時間后，消化到六孔板中培養(yǎng)（處理時間根據(jù)24孔板內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量而定）i) 細(xì)胞分6孔板中養(yǎng)起來后，可分出部分細(xì)胞提蛋白，用western驗(yàn)證克隆是否為我們所需要的克隆，也可以用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，若驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)克隆并不是所需要的克隆，即失敗的克隆，就扔掉，保留驗(yàn)證成功的克隆并大量培養(yǎng)j) 首次驗(yàn)