醫(yī)學(xué)檢驗本科畢業(yè)論文范例-供參考

1、畢業(yè)論文題姓學(xué)系年目:乙肝表抗原的ELISA法定量分析方法學(xué)驗證名：張珊號：別：級：業(yè):醫(yī)學(xué)檢驗指導(dǎo)教師：二O年十二月目錄中文文獻英文摘要前言錯誤!未定義書簽.1 .材料與方法錯誤!未定義書簽.1.1 試劑盒1.2 儀器1.3 方法13.2.鋪板方案133.加樣步驟7結(jié)果2A標準曲線與線性范圍2.2 準確度(回收率)的驗證22.3 精密度的驗證2.3.1 板內(nèi)精密度的驗證232板間精密度的驗證2.4 檢測限(LOD)計算53.討論53.1 乙肝外表抗原定量分析的意義53.2 常用定量分析方法633方法概述63.4 方法學(xué)驗證內(nèi)容63.5 結(jié)果分析及應(yīng)用評價7參考文獻7乙肝外表抗原的ELISA法

2、定量分析方法學(xué)驗證摘要目的：對福州藍圖生物工程生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進行方法學(xué)驗證,以判斷是否能用于臨床樣本分析.方法：ELISA法定量分析,應(yīng)用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8ng/ml做2倍稀釋的6個濃度梯度做標準曲線,以6,3,1.5ng/ml3個濃度梯度5復(fù)孔做準確度,精密度和檢測限等方法學(xué)驗證.結(jié)果：標準曲線R2=0.997,準確度97.07%,1.5ng/ml的RSD為16.78%,不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)V15%的要求,檢測限LOD為0.172ng/ml,低濃度樣品(vl.5ng/ml)的檢測在準確性和精密度方面都低于高濃度樣品,不適合低濃度樣品

3、的檢測.結(jié)論：該HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒不能用于臨床標本的分析.關(guān)鍵詞乙肝外表抗原ELISA定量分析方法學(xué)驗證ThereificationoftheHBsAgELISAquantitativemethodologyAbstractObject:toverifythequantitativemethodologyofFuzhoublueprintbiologicalengineeringcompanytomakesurewhetheritcabeusedtotheanalysisofClinicalSample.Methods：ELISAquantitativemethodolog

4、y,makeanApplicationofthestandardHBsAgkitfromtheconcentrationof8ng/mldo2timesdilutedsixconcentrationgradienttoconstituteastandardcurve,testingWith6,3,1.5ng/ml3aconcentrationgradient5accuratelypreciseanddetection.Results:standardcurve,R2=0.997,theaccuracyofRSDof1.5ng/mis16.78%,theRSDthatcannotmeetthed

5、emandofng/mlbasiclevelislessthan<15%incommon.TheLODis0.172ng/ml,thetestingofLowconcentrationsamples(<1.5ng/ml)arelowerthanhighconcentrationsamplesinbothaccuracyandprecision,whichasaresultmakeitunsuitableforlowconcentrationsampletesting.Conclusion:theELISAquantitativeanalysiskitofHBsAgcannotbeu

6、sedfortheanalysisofClinicalSample.KeywordsHBsAgQuantitativeanalysisVerificationMethodology.前言乙肝病毒感染是我國最常見的感染性疾病之一,而乙型肝炎血清標志物是檢測乙肝病毒感染最主要的病原標志.隨著免疫學(xué)技術(shù)的不斷開展,抗原抗體檢測靈敏度明顯提升,使低水平乙肝病毒得以檢出,對臨床診斷及流行病學(xué)有重要意義.ELISA法具有較高靈敏度、特異性強、重復(fù)性好、可進行定量和半定量測定等優(yōu)點,可以在酶免疫分析儀上做批量檢測.目前臨床上多傾向于做定量分析,假設(shè)想知道檢驗結(jié)果是否可靠,實驗室那么必須對所用試劑盒進行方法學(xué)

7、驗證,本實驗對福州藍圖生物工程生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進行準確度,精密度和檢測限等方法學(xué)驗證,現(xiàn)報告如下.1 .材料與方法1.1 試劑盒乙肝外表抗原ELISA法定量分析試劑盒,福州藍圖生物工程有限公司出品.1.2 儀黠酶標儀：Bio-Rad680；洗板機：Bio-Rad1575；超純水系統(tǒng)：MilliporeElix；電熱恒溫培養(yǎng)箱(DNP-9052)上海精宏實驗設(shè)備；振蕩器(蘇州管械,KJ-201A)；移液器；Tip頭；EP管.13方法13.1. 溶液配置1XPBS緩沖液的配置：稱取8gNaCk0.2gKCK1.44gNa2HPC)4和0.24gKH2P04,溶于800m

8、l蒸儲水中,用HC1調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4,最后加蒸鏘水定容至1L即可.標準品的配置：原始標準品濃度為8ng/ml.取6個2rnlEP管,分別標記為SI-S6050ul/well,共1孔需50uL每孔配置60ul備用,根據(jù)下表稀釋方案進行稀釋.編號終濃度(ng/ml)預(yù)加1XPBS取剩余(ul)標記(ul)S180標準品120S2460S16060S3260S26060S4160S36060S50.560S46060S60.2560S56060質(zhì)控品的配置:50ul/well,共5復(fù)孔需250ul,配置300ul備用,取3個2mlEP管,分別標記為Cl,C2,C3,根據(jù)下表稀釋方案進行稀釋.

9、編號終濃度(ng/ml)預(yù)加IXPBS取剩余(ul)標記(ul)C16150標準品450C23300C1300300C31.5300C230030013.2. 鋪板方案取出試劑盒中已包被酶標板,取出板條,根據(jù)下表鋪板方案進行鋪板在相應(yīng)孔中依次參加系列標準品、質(zhì)控品及空白對照,每孔50ul.空白對照參加1XPBS緩沖液.12345AS1ClC2C3PBSBS2ClC2C3PBSCS3ClC2C3DS4ClC2PBSES5ClC3PBSFS6C2C3PBS133.加樣步驟參加酶標抗體,50ul/welb震蕩.37電熱恒溫培養(yǎng)箱溫育60min,取出后洗板4次,參加A、B液,50ul/weH,37c電

10、熱恒溫培養(yǎng)箱溫育15min.參加終止液,50ul/wello酶標板放入酶標儀,蓋上蓋子,在電腦上翻開MicroplateManager5.2軟件,選擇450nm波長參照波長630nm,設(shè)置LAYOUT和報告模式,測定各孔吸收值.2.結(jié)果2.1 標準曲線與線性范圍標準品理論濃度對應(yīng)的實測OD值HBsAg(ng/ml)X4210.50.25OD1.661.000.620.390.310.270.0H_I_I_I_I_I_I_I_I_i0123456789ConcngZml以HBsAg理論濃度為橫坐標,所測OD值為縱坐標作圖,繪制標準曲線觀察線性關(guān)系,結(jié)果顯示R2=0.9973,顯示具有良好的相關(guān)性

11、y=0.1816X+0.2307R2=0.99732.2 準確度回收率的驗證質(zhì)控品理論稀釋濃度對應(yīng)實測濃度值HBsAs(ng/ml)測定值1234566.244.565.736.096.4033.363.293.553.283.481.51.241.271.171.171.20質(zhì)控品做了3個濃度梯度,每個濃度做了5個復(fù)孔,下表是對每個濃度梯度進行準確度(回收率)的驗證.HBsAg(ng/ml)測定值(ng/ml)回收率()平均回收率RR(%)3個濃度的平均回收率66.24103.9397.5897.07%4.5675.925.7395.576.09101.456.40106.6033.3611

12、2.13113.073.29109.573.55118.403.28109.403.48115.831.51.2482.4780.561.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93結(jié)果顯示HBsAg6ng/ml和3ng/ml的平均回收率為97.58%,113.07%,滿足限度要求在85%-115%的范圍內(nèi),而HBsAg1.5ng/ml的平均回收率為80.56%,滿足方法定量限在80%-120%的范圍內(nèi).3個濃度梯度的平均回收率為97.7%,顯示準確性好.2.3精密度的驗證2.3.1板內(nèi)精密度的驗證HBsAg(ng/ml)測定值X±sRSD(%)1234566

13、.244.565.736.096.405.80±0.7412.7333.363.293.553.283.483.39±0.123.501.51.241.271.171.171.201.21±0.043.69上表中RSD(%)這一參數(shù)表示相對標準偏差,也就是變異系數(shù)CV值,HBsAg6ng/ml的5個復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%,顯示孔間差異較大,精密度不高,但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,其中有一孔濃度為4.55,與其它孔比擬差異較大,可能是由于操作引起例如加樣不準.而3ng/ml,和1.5ng/ml的變異系數(shù)CV為3.5%,3.7%,

14、符合顯示孔間重復(fù)性好,符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,精密度高.232板間精密度的驗證從同一實驗室中獲取2組同樣的數(shù)據(jù),做板間精密度的驗證.首先對同一實驗條件下不同實驗人員所獲得的數(shù)據(jù)是否可用于板間分析做驗證.(ao)8ueq-osqv5050522110組組-第第R2=0.967R2=0.991HBsAg(ng/ml)S42I0.50.25第二組OD值1.981.420.860.580.400.31第三組OD值1.310.770.360.170.090.03以HBsAg理論濃度為橫坐標,所測OD值為縱坐標作圖,繪制標準曲線觀察線性關(guān)系.O.O+C-I0123456789Con

15、c(ngZml)以上標準曲線結(jié)果顯示第二組數(shù)據(jù)的R2=0.967,第三組數(shù)據(jù)R2=0.991.第二組數(shù)據(jù)由于有一些孔與標準曲線偏離較大,但考慮到隨機抽樣與均數(shù)存在一定誤差,還是可以用于統(tǒng)計學(xué)分析.下表對3組數(shù)據(jù)做板間分析.HBsAg(ng/ml)測定值x±sRSD(%)I234566.236.105.994.555.785.395.736.086.346.086.646.496.396.845.966.04±0.559.1033.363.362.593.282.932.713.553.532.813.283.072.493.472.992.523.06±0.371

16、2.061.51.241.461.191.271.51.241.171.731.251.16l.7ll.2l1.191.76l.ll1.34±0.2316.78從表中3個組的數(shù)據(jù)比擬可知,HBsAg6ng/ml和3ng/ml的RSD分別為9.10%,12.06%,滿足對ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)15%的要求,精密度高.而HBsAg1.5ng/ml的RSD為16.78%,不滿足ng/ml級水平的RSD一般應(yīng)15%的要求,顯示低濃度的孔間重復(fù)性差,精密度不是很高,故以下對HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的三組數(shù)據(jù)做分析.對HBsAg理論濃度為L5ng/ml的準確性,精密度分析HB

17、sAg(ng/ml)測定值ng/ml回收率平均回收率RR%SD%CV%第一組數(shù)據(jù)1.5ng/ml1.2482.4780.562.983.701.2784.671.1778.071.1777.671.2079.93第二組數(shù)據(jù)1.5ng/ml1.4697.60109.19.498.701.50100.001.73115.601.72114.531.77117.67第三組數(shù)據(jù)1.5ng/ml1.1979.4780.273.804.741.2583.131.2583.531.2281.071.1174.13從上表可知笫一組數(shù)據(jù)和第三組數(shù)據(jù)準確性差,精密度高.而第二組數(shù)據(jù)準確性高,而精密度相對于笫一組和

18、笫三組數(shù)據(jù)要好.綜上對于HBsAg理論濃度為1.5ng/ml的這一低濃度梯度的板內(nèi)準確性和板間精密度相對于高濃度的線性要差一些.2.4檢測限LOD計算LOD為取空白孔的OD值的均數(shù)加2倍標準差.12345MeanSDLOD空白孔OD值0.1580.1530.160.1620.170.160.006220.172山上表可知,LOD為0.172.檢測限LOD表示分析方法檢測低濃度樣品的能力,也稱為方法的靈敏度,LOD通常為標準曲線上的最低濃度點,要求標準曲線上的最低濃度點應(yīng)LOD,此標準曲線上最低濃度點為0.25,大于LOD0.172,故此標準曲線線性好.3.討論3.1 乙肝外表抗原定量分析的意義

19、乙肝外表抗原是乙肝兩對半的其中一項,乙肝兩對半定性檢測對乙肝疾病的診斷,病情監(jiān)測,療效觀察起到了一定的作用.但隨著臨床醫(yī)學(xué)的開展,乙肝兩對半定性檢測已經(jīng)遠遠不能滿足臨床及患者的要求,特別是在療效觀察以及乙肝疫苗注射后抗體產(chǎn)生情況的觀察上有明顯的缺乏.隨著檢驗醫(yī)學(xué)的開展,乙肝兩對半定量測定成為可行,大大彌補了乙肝兩對半定性檢測的缺乏.而且乙肝兩對半定量檢測可與HBVDNA熒光測定相互補充,綜合評價患者病情與藥物療效,為低含量的慢性乙肝、病毒攜帶者提供了正確判斷病情的依據(jù)這在目前的臨床治療中應(yīng)用十分廣泛.3.2 常用定量分析方法此次實驗只是對一種試劑盒的可用性進行方法學(xué)驗證,而目前常用的定量方法已

20、有很多,如TRFIA,TRFIA法乂稱解離增強錮系熒光免疫分析,是近十年發(fā)展起來的一種微量分析方法.此技術(shù)集酶標記、同位素標記技術(shù)的優(yōu)點于一身,具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好,且測定范圍更寬,試劑盒貨架壽命長,操作簡便和非放射性等特點,成為最有潛力的一種標記免疫分析方法.全自動酶免分析儀目前也廣泛應(yīng)有,自動化、標準化的操作手段使實驗到達了全過程控制和全過程標準化分析,大大提升了實驗的精密度,使檢測結(jié)果更趨穩(wěn)定,從而保證了實驗結(jié)果的可靠性.3.3 方法概述目前普遍使用的HBsAg試劑盡管在制備時采用了高親和力的單克隆抗體,并且使包被抗體、酶標抗體的結(jié)合位點盡可能的遠.以防止競爭抑制,最大程度地

21、解決鉤狀效應(yīng)(HOOK)的問題.本次實驗是對實驗室的一種試劑盒,即福州藍圖生物工程生產(chǎn)的HBsAg的ELISA法定量分析試劑盒進行方法學(xué)驗證,以判斷是否能用于臨床樣本分析.試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗.往預(yù)先包被HBsAg捕獲抗體的包被微孔中,依次參加標本,標準品,HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹底洗滌.川底物TMB顯色,TMB在過氧化物的催化下轉(zhuǎn)化為藍色,并在酸的作用下最終轉(zhuǎn)化為黃色.顏色的深淺和樣品中得HBsaAg呈正相關(guān).用酶標儀在450nm波長下測定吸光度OD值,計算樣品濃度.應(yīng)用試劑盒HBsAg標準品從濃度為8,4,2,1,0.5,0.25ng/ml6個濃度梯度做標準

22、曲線,以6,3,L5ng/ml3個濃度梯度5復(fù)孔做質(zhì)控,進行準確度,精密度和檢測限等方法學(xué)驗證.選擇最低濃度為0.25ng/ml的原因是由于,絕大多數(shù)HBV感染者外周血中可出現(xiàn)HBsAg,含量在5ng/ml600ug/ml之間,高者可達2000ug/ml以上,滿足了現(xiàn)階段文獻報道的最低濃度值.3-4方法學(xué)驗證內(nèi)容方法學(xué)驗證內(nèi)容一般包括標準曲線,準確度,精密度和檢測限.標準曲線亦稱校正曲線,系指生物樣品中所測定的樣品濃度與響應(yīng)的相關(guān)性,通常用回歸分析方法所得的回歸方程來評件,此實驗所用了6個濃度點建立標準曲線.方法準確度指待測濃度與真實濃度的接近值了,一般用相對回收率表示,限度要求在85%115

23、%的范圍內(nèi).精密度那么表示分析方法的可重復(fù)性,是對同一樣品每次測定結(jié)果的一致性,用標準偏差和相對標準偏差表示,可做板內(nèi)和板間的驗證,對于ug/ml級水平的相對標準偏差一般應(yīng)<10%ng/ml級水平的相對標準偏差一般應(yīng)<15%.檢測限那么表示分析低濃度樣品的水平,通常乂稱為靈敏度.3.4 5結(jié)果分析及應(yīng)用評價第一組數(shù)據(jù)標準曲線R2=Q9973,顯示具有良好的相關(guān)性,HBsAg濃度為6ng/ml和3ng/ml的回收率分別為為97.58%,符合113.07%,符合限度要求在85%115%的范圍內(nèi).但是HBsAg濃度為5ng/ml的回收率為80.56%,顯示此試劑盒對于低濃度樣品的檢測準確度差.在精密度方面,6,3,1.5ng/ml變異系數(shù)CV分別為12.73%,3.69%,3.50%,而HBsAg6ng/ml的5個復(fù)孔的變異系數(shù)CV值為12.73%,顯示孔間差異較大,精密度不高,但是也符合ng/ml級RSD水平的一般應(yīng)15%的要求,其中有一孔濃度為4.55,與其它孔比擬差異較大,可能是