剪接異構(gòu)體在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)功能研究

1、FoxM1剪接異構(gòu)體在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及臨床意義研究摘要 目的：觀察FoxM1剪接異構(gòu)體在女性上皮性卵巢癌中的表達(dá)特征，并探討其應(yīng)用價(jià)值。方法：惡性組50例，為經(jīng)手術(shù)治療及術(shù)中獲取病灶組織病理檢測(cè)確診的上皮性卵巢癌患者；良性組50例，為影像學(xué)及病理診斷為卵巢良性腫瘤者；健康組50例，為其它婦科疾病入院但經(jīng)臨床癥狀、影像學(xué)檢查等未見(jiàn)卵巢異常者。均取卵巢病理組織切片免疫組化染色，免疫熒光法檢測(cè)FoxM1表達(dá)陽(yáng)性情況。結(jié)果：惡性、良性和健康組卵巢組織FoxM1的表達(dá)陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=62.632，P<0.01），兩兩比較，惡性組顯著高于良性組及健康組（X2=27.473，

2、60.864，P<0.01），良性組顯著高于健康組（X2=10.187，P<0.01）。不同臨床分期的上皮性卵巢癌樣本FoxM1的表達(dá)差異具有顯著性，I、II期病變FoxM1陽(yáng)性率顯著低于III、IV期（X2=5.882，P<0.05）。但漿液性乳頭狀囊腺癌FoxM1陽(yáng)性率與非漿液性乳頭狀囊腺癌比較差異無(wú)顯著性（X2=0.039，P<0.01）。惡性腫瘤患者隨著FoxM1表達(dá)增強(qiáng)，患者的3年生存率（OS）和無(wú)進(jìn)展生存率（PFS）逐漸下降。結(jié)論：FoxM1剪接異構(gòu)體在上皮性卵巢癌中呈現(xiàn)為高表達(dá)，且隨著臨床分期的增高FoxM1的陽(yáng)性率提高，隨FoxM1表達(dá)增高惡性腫瘤患者的

3、生存率下降，F(xiàn)oxM1可能參與卵巢癌的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程，其機(jī)制可能與FoxM1的細(xì)胞周期調(diào)控作用有關(guān)。關(guān)鍵詞 FoxM1剪接異構(gòu)體，上皮性卵巢癌，基因表達(dá)，細(xì)胞周期The expression and clinical significance study of FoxM1 isoforms in epithelial ovarian cancerAbstract Objective: To observe expression features of FoxM1 isoform in women with epithelial ovarian cancer, and to explore it

4、s value. Methods: 50 cases of malignant group, were the patients treated by surgery and got intraoperative detection of pathological lesions diagnosed epithelial ovarian cancer; 50 cases of benign group, were patients of diagnostic imaging and pathological ovarian benign tumor; 50 cases of healthy g

5、roup, were patients admission but for other gynecological diseases by clinical symptoms, imaging studies, such as no ovarian abnormalities. Ovarian pathology tissue sections were taken immunohistochemistry, FoxM1 expression positive situation was detected by immunofluorescence. Results: The differen

6、ce of FoxM1 ovarian tissue expression rate of malignant, benign and healthy group was statistically significant (X2= 62.632, P <0.01), pairwise comparison, the malignant group was significantly higher than that of benign group and the healthy group (X2=27.473, 60.864, P<0.01), the benign group

7、 was significantly higher than the healthy group (X2 = 10.187, P<0.01). The difference of expression in epithelial ovarian cancer samples FoxM1 of different clinical stages was significant, the FoxM1 positive rate of I, II lesionswas significantly lower than the III, IV stage (X2=5.882, P<0.05

8、). But the difference of FoxM1 positive rate of serous cystadenocarcinoma and non-serous cystadenocarcinoma was not statistically significant (X2=0.039, P<0.01). FoxM1 cancer patients with increased expression of the patient's 3-year survival (OS) and progression-free survival (PFS) declined.

9、 Conclusion: FoxM1 isoforms appear as high in epithelial ovarian cancer expression, and FoxM1 positive rate increased with increased clinical stage, the survival rate of cancer patients with increased expression FoxM1 decline, FoxM1 may be involved in the occurrence and progression of ovarian cancer

10、, which may be related to cell cycle regulation of FoxM1 concerned.Keywords FoxM1 isoform, Epithelial ovarian cancer, Gene expression, Cell cycle女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中，卵巢癌發(fā)病率較高，近些年來(lái)受到臨床重視。由于卵巢癌早期無(wú)特異性癥狀，且目前的篩查手段尚無(wú)較好的早期診斷方法，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)病變已至晚期，延誤了最佳治療時(shí)機(jī)，患者病死率較高1-2。在卵巢癌的多種病理類(lèi)型中，上皮性卵巢癌較為常見(jiàn)，約占70%，流行病學(xué)研究顯示其多發(fā)于女性絕經(jīng)期以及絕經(jīng)后3。F

11、ox為叉頭框轉(zhuǎn)錄因子的統(tǒng)稱(chēng)，共同特征是都有一段翼狀螺旋DNA結(jié)構(gòu)域。其成員FoxM1被認(rèn)為在惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過(guò)程中具有重要作用，但我國(guó)相關(guān)基因?qū)W研究較少4?，F(xiàn)對(duì)我院上皮性卵巢癌、卵巢良性腫瘤以及健康卵巢樣本進(jìn)行比較研究，觀察FoxM1剪接異構(gòu)體在女性上皮性卵巢癌中的表達(dá)特征，并探討其應(yīng)用價(jià)值。1 資料與方法11樣本選擇樣本來(lái)源于我院婦產(chǎn)科患者，樣本納入時(shí)間為2009年1月至2011年12月。樣本納入類(lèi)型：（1）惡性組50例，為經(jīng)手術(shù)治療及術(shù)中獲取病灶組織病理檢測(cè)確診的上皮性卵巢癌患者，年齡29-75歲，平均（51.3±9.6）歲，粘液性囊腺癌8例，漿液性乳頭狀囊腺癌32例，粘液性

12、囊腺癌4例，透明細(xì)胞癌2例，子宮內(nèi)膜樣腺癌4例；FIGO分期：I期4例，II期12例，III期24例，IV期10例；分化程度：高分化12例，中分化16例，低分化22例。（2）良性組50例，為影像學(xué)及病理診斷為卵巢良性腫瘤者，年齡25-72歲，平均（47.6±8.8）歲；包括漿液性囊腺瘤28例，粘液性囊腺瘤22例。（3）健康組50例，為其它婦科疾病入院但經(jīng)臨床癥狀、影像學(xué)檢查等未見(jiàn)卵巢異常者，年齡22-68歲，平均（45.8±9.1）歲。惡性組所有病例均為首發(fā)，術(shù)前均未行放、化療、激素等癌癥治療。12方法121儀器與試劑FoxM1抗體由美國(guó)Santa Cruz公司生產(chǎn)，SP免

13、疫組化試劑盒由美國(guó)Invitrogen公司生產(chǎn)，DAB顯色劑試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供，山羊抗兔免疫IgG二抗由上海合星生物科技有限公司提供，光學(xué)顯微鏡由日本Nikon公司生產(chǎn)，L XP100離心機(jī)由美國(guó)Beckman Coulter公司生產(chǎn)，UV754此外分光光度計(jì)由美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn)，枸櫞酸那緩沖液由21 g枸櫞酸與29 g枸椽酸鈉配比定容獲得，PBS緩沖液由NaCl、KCl、KH2PO4和Na2HPO4配比獲得。122免疫組化取病理組織石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，60過(guò)夜，二甲苯脫蠟，切片依次置入濃度100%、95%、80%和70%的乙醇溶液中浸泡3 min，PBS漂洗3次

14、，枸櫞酸鈉緩沖液浸泡，高壓修復(fù)，PBS漂洗3次，加入0.3%過(guò)氧化氫甲醇溶液，置于室溫下孵育15 min，加入山羊血清，置室溫下封閉20 min，加FoxM1抗體，置室溫下靜置60 min，PBS漂洗。加山羊抗兔免疫IgG二抗，置室溫下孵育20 min，PBS漂洗3次，DAB顯色，自來(lái)水沖洗衣終止顯色。SP免疫組化染色，自來(lái)水沖洗，常規(guī)脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察樣本。由于FoxM1主要于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，因而可見(jiàn)細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有棕黃色顆粒者計(jì)為陽(yáng)性。123FoxM1的表達(dá) 卵巢癌細(xì)胞的FoxM1剪接異構(gòu)體表達(dá)情況采用免疫熒光法，分別將A2780、SKOV3、OVCAR3細(xì)胞接種于內(nèi)有

15、10%的小牛血清的培養(yǎng)液中，于室溫下置入5%的二氧化碳培養(yǎng)箱爬片培養(yǎng)48 h，PBS沖洗，加入4%多聚甲醛固定，PBS沖洗，加入一抗置于4環(huán)境下過(guò)夜，PBS沖洗，加入二抗置于室溫孵育1 h，PBS沖洗衣，顯微鏡下觀察。13判定標(biāo)準(zhǔn)（1）染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)目換染色為0分，染色強(qiáng)度高于背景且有淡黃色顆粒為1分，有明顯淺黃色顆粒為2分，有較多深黃色顆粒為3分。（2）陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分：隨機(jī)取5個(gè)高倍視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例，低于5%者計(jì)0分，5%-25%者計(jì)1分，26%-50%者計(jì)2分，51%-75%者計(jì)3分，76%及以上者計(jì)4分。（3）綜合評(píng)分：將染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞占比評(píng)分相加后進(jìn)行綜合評(píng)分，0

16、-1分計(jì)為陰性（-），2-3分計(jì)為弱陽(yáng)性（+），4-5分計(jì)為中度陽(yáng)性（+），6-7分計(jì)為強(qiáng)陽(yáng)性（+）。14觀察指標(biāo) 評(píng)價(jià)不同組別患者FoxM1表達(dá)情況以及不同病理分型和臨床分期的FoxM1表達(dá)情況。全部病例隨訪3-5年，對(duì)不同F(xiàn)oxM1表達(dá)的惡性腫瘤患者進(jìn)行3年生存率（OS）和無(wú)進(jìn)展生存率（PFS）。15統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用軟件SPSS21.0，三組間計(jì)數(shù)資料比較應(yīng)用秩和（Kruskal-Wallis法）檢驗(yàn)，如具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用秩和（Nemeryi法）進(jìn)行兩兩比較，當(dāng)P<0.05時(shí)表示數(shù)據(jù)間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果21不同卵巢樣本的FoxM1表達(dá) 如表1，惡性、良

17、性和健康組卵巢組織FoxM1的表達(dá)陽(yáng)性率比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（X2=62.632，P<0.01），兩兩比較，惡性組顯著高于良性組及健康組（X2=27.473，60.864，P<0.01），良性組顯著高于健康組（X2=10.187，P<0.01）。表1 三組卵巢組織的FoxM1剪接異構(gòu)體表達(dá)情況統(tǒng)計(jì)組別例數(shù)-+陽(yáng)性率惡性組50510171890%良性組5030182040%健康組504460012%22上皮性卵巢癌FoxM1表達(dá)特征 如表2和表3，不同臨床分期的上皮性卵巢癌樣本FoxM1的表達(dá)差異具有顯著性，I、II期病變FoxM1陽(yáng)性率顯著低于III、IV期（X2=5.88

18、2，P<0.05）。但漿液性乳頭狀囊腺癌FoxM1陽(yáng)性率與非漿液性乳頭狀囊腺癌比較差異無(wú)顯著性（X2=0.039，P0.05）。表2 不同病理分型的上皮性卵巢癌卵巢樣本中FoxM1表達(dá)分析病理分型例數(shù)-+陽(yáng)性率漿液性乳頭狀囊腺癌3235121290.6%非漿液性乳頭狀囊腺癌18245788.9%表3 不同臨床分期的上皮性卵巢癌卵巢樣本中FoxM1表達(dá)分析臨床分期例數(shù)-+陽(yáng)性率I、II期16434575%III、IV期3416131497.1%23不同F(xiàn)oxM1剪接異構(gòu)體表達(dá)的惡性組患者預(yù)后情況如表4可見(jiàn)，惡性腫瘤患者隨著FoxM1表達(dá)增強(qiáng)，患者的OS和PFS逐漸下降。表4 不同F(xiàn)oxM1

19、表達(dá)的惡性組患者（例/%）組別例數(shù)OSPFS-55（100%）4（80%）+106（60%）4（40%）+178（47.1%）5（29.4%）+186（33.3%）2（11.1%）3 討論卵巢癌在我國(guó)女性中患病率高、病死率高，盡管近些年來(lái)臨床篩查手段不斷進(jìn)步，但由于卵巢癌早期較少見(jiàn)特異性癥狀，早期的診斷率仍然較低5。卵巢癌的早期診斷方法很多，包括對(duì)高危人群的篩查、腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)、影像學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)、腹腔鏡探查等，隨著分子學(xué)研究的不斷深入，基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)也越來(lái)越受到重視6。FoxM1剪接異構(gòu)體2010年被ISMCBBPR國(guó)際協(xié)會(huì)評(píng)為年度分子，被認(rèn)為是惡性腫瘤分子學(xué)研究的重要因子。Fo

20、xM1基因在人類(lèi)12p13-3號(hào)染色體位，主要存在a、b、c三種剪接方式7。在細(xì)胞周期中，F(xiàn)oxM1的表達(dá)具有周期性，一般于G0期呈低表達(dá)，G1期逐漸升高，至S期可到達(dá)峰值，并持續(xù)至M期，到達(dá)M期后可見(jiàn)迅速的降解8。王宇報(bào)道指出，F(xiàn)oxM1有多種生物學(xué)功能9：（1）細(xì)胞周期調(diào)控作用。FoxM1可誘導(dǎo)Cdc25A的表達(dá)及Cks1、Skp2的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)具有細(xì)胞周期抑制作用的蛋白因子泛素化降解；也可對(duì)Cdc25B、Aurora B，PLK1、CENPA等細(xì)胞周期調(diào)控分子起到調(diào)節(jié)作用。（2）參與DNA損傷修復(fù)。Tan Y、Raychaudhuri P等利用siRNA對(duì)FoxM1表達(dá)進(jìn)行干涉，發(fā)現(xiàn)其

21、可上調(diào)細(xì)胞周期抑制蛋白P21Cip1表達(dá)并激活p53，從而破壞DNA結(jié)構(gòu)10。（3）參與細(xì)胞衰老機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxM1表達(dá)水平下降可導(dǎo)致細(xì)胞的增殖速度減慢，并出現(xiàn)有絲分裂缺陷，可見(jiàn)FoxM1與細(xì)胞增殖與衰老有關(guān)11。（4）與器官形成、干細(xì)胞等密切相關(guān)。本組中對(duì)卵巢惡性腫瘤、良性腫瘤以及健康卵巢組織進(jìn)行分組隊(duì)列研究，發(fā)現(xiàn)FoxM1剪接異構(gòu)體在三種卵巢組織樣本中的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異，尤其在惡性腫瘤的組織樣本中FoxM1呈極高表達(dá)，陽(yáng)性率可達(dá)90%，這與陳國(guó)慶等報(bào)道的卵巢癌病理組織FoxM1陽(yáng)性率為89.71%十分接近12。FoxM1在卵巢陽(yáng)性腫瘤中呈中等表達(dá)，占40%，而在健康卵巢中則呈低表達(dá)

22、，占12%，提示FoxM1可能參與卵巢病變的發(fā)生與發(fā)展中，甚至可能在其中產(chǎn)生一定的作用機(jī)制。國(guó)外一些報(bào)道已證實(shí)FoxM1為一種原癌基因，其在肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤等多種病變中均有高表達(dá)特征14，Priller M等認(rèn)為FoxM1的高表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生及預(yù)后均密切相關(guān)14。從預(yù)后方面評(píng)價(jià)，本組惡性腫瘤患者中FoxM1表達(dá)陰性者3年OS和PFS分別為100%和80%，F(xiàn)oxM1陽(yáng)性表達(dá)的提高，患者OS與PFS逐漸下降，+患者的OS和PFS率僅為33.3%和11.1%，證實(shí)了FoxM1可能參與上皮性鳥(niǎo)巢癌的疾病進(jìn)展過(guò)程，其機(jī)制可能與FoxM1對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控作

23、用及參與細(xì)胞衰老機(jī)制有關(guān)。本組中患者臨床分期越高，F(xiàn)oxM1的表達(dá)陽(yáng)性率越高，提示FoxM1可能參與到卵巢癌病變進(jìn)展的過(guò)程當(dāng)中。FoxM1通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，最新研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響與細(xì)胞微管組織中心體相關(guān)蛋白Cep55密切相關(guān)。細(xì)胞缺乏Cep55后，細(xì)胞分裂的過(guò)程即停留于中間體階段，出現(xiàn)胞質(zhì)分裂障礙，而Waseem等的研究稱(chēng)Cep55為FoxM1的下游靶基因，由此可見(jiàn)，F(xiàn)oxM1還可通過(guò)對(duì)Cep55活性、轉(zhuǎn)錄與生長(zhǎng)的影響來(lái)對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生影響，其對(duì)Cep55活性的影響主要通過(guò)Ras MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)15?？傊?，F(xiàn)oxM1剪接異構(gòu)體在上皮性卵巢癌中呈現(xiàn)為高表達(dá)，且隨

24、著臨床分期的增高FoxM1的陽(yáng)性率提高，F(xiàn)oxM1可能參與卵巢癌的發(fā)生與進(jìn)展過(guò)程，其機(jī)制可能與FoxM1的細(xì)胞周期調(diào)控作用有關(guān)。參考文獻(xiàn)：1 馬駿，王育. 活性氧在上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究進(jìn)展J. 中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2011，27（11）：862-865.2 李失穎，姜樺. ZEB家族在上皮性卵巢癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中的作用J. 國(guó)際婦產(chǎn)科學(xué)雜志，2014，41（1）：47-49.3 Paes MF，Dalto e RD，Madeira KP，et al. A retrospective analysis of clinicopathological and prognostic cha

25、racteristics of ovarian tumors in the State of Esp rito Santo，Brazil J. J Ovarian Res，2011，4（4）：14-18.4 Li YW，Qiu SJ，F(xiàn)an J，et al. Intratumoral neutrophils: a poor prognostic factor for hepatocellular carcinoma following resection J. J Hepatol，2011，52（3）：497-505.5 金心，胡珍華，孫新宇，等. 轉(zhuǎn)錄因子NR4A2在卵巢上皮性腫瘤組織中的表

26、達(dá)及其臨床意義J. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013，21（12）：2775-2778.6 Bendoraite A，Knouf EC，Garg KS，et al. Regulation of miR-200 family micro RNAs and ZEB transcription factors in ovarian cancer: evidence supporting a mesothelial-to-epithelial transition J. Gynecol Oncol，2010，116（1）：117-125.7 Haslehurst AM，Koti M，Dharsee M，et al. EMT transcription factors snail and slug directly contribute to cisplatin resistance in ovarian cancer J. BMC Cancer，2012，12（12）：91-93.8 孫彥，李卓蔓，周淑娟，等. 卵巢癌患者外周血Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的檢測(cè)J. 中國(guó)醫(yī)師進(jìn)修雜志，2012，35（36）：26-29.9 王宇. FoxM1剪接異構(gòu)體在上皮性卵巢癌中的表達(dá)及相關(guān)功能研究M. 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文，2013：30-35.10 Tan Y，Raychaudhuri P，Cost