piRNA的生物學(xué)功能及生源論

1、piRNA：一類新的非編碼小RNA最近，印度科學(xué)家SaiLakshmiS及其合作者建立了一個(gè)piRNA數(shù)據(jù)庫piRNABank，以保存新發(fā)現(xiàn)的piRNA序列。piRNABank是一個(gè)高度用戶友好的資源，它收錄了包括人、小鼠和大鼠的近2000萬個(gè)piRNA相關(guān)序列，經(jīng)過同源序列去除、基因組定位等篩選，最近得到10萬多個(gè)在基因組中具有唯一靶位點(diǎn)的piRNA序列。數(shù)據(jù)庫支持物種和染色體方式的多種的搜索方式，包括登錄號(hào)、染色體定位、基因名或符號(hào)，基于同源性的序列檢索，簇和相應(yīng)基因及重復(fù)元件。它也可以在基因組大圖譜上顯示每個(gè)piRNA或piRNA簇。數(shù)據(jù)庫內(nèi)的信息也將隨著新的研究進(jìn)行不斷更新，果蠅和其它

2、物種的piRNA信息也將會(huì)被收錄，作者還計(jì)劃增加一些序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測的軟件，更方便科研人員使用35。6存在的問題與展望piRNA的發(fā)現(xiàn)為非編碼小分子RNA的研究開辟了一個(gè)新領(lǐng)域，被Science評(píng)為2006年十大科技進(jìn)展之一36。到目前為止，piRNA的研究已經(jīng)取得了階段性的成果，但要預(yù)測piRNA在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用還為時(shí)過早。其中仍然有許多問題需要進(jìn)一步研討，如piRNA的序列在不同物種中的同源保守性還不好分析；在piRNA生源論中，仍舊不知道3端的分裂機(jī)制和piRNA擴(kuò)增循環(huán)是如何調(diào)節(jié)的。另一個(gè)尚未解決的問題是piRNA在特異位點(diǎn)表達(dá)的結(jié)果所產(chǎn)生的功能以及piRNA3端甲基化的機(jī)制還沒有弄清

3、楚。piRNA和Piwi蛋白在后生調(diào)控中起的作用很可能大于轉(zhuǎn)座子沉默的作用，目前，本實(shí)驗(yàn)室正研究非生殖器官Piwi蛋白高表達(dá)組織中，piRNA的克隆及調(diào)控作用，但尚未取得有意義的進(jìn)展。因此，piRNA的研究不僅可以豐富小分子RNA的研究內(nèi)容，同時(shí)，也有利于我們進(jìn)一步了解生物配子發(fā)生的分子調(diào)控及其機(jī)理，具有十分重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。1 piRNA的生物學(xué)功能目前的研究表明, piRNA主要存在于哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞和干細(xì)胞中，通過與Piwi亞家族蛋白結(jié)合形成piRNA復(fù)合物(piRC)來調(diào)控基因沉默途徑。對(duì)Piwi亞家族蛋白的遺傳分析以及piRNA積累的時(shí)間特性研究發(fā)現(xiàn)，piRC在配子發(fā)生過程

4、中起著十分重要的作用。經(jīng)過研究人員分析發(fā)現(xiàn)，只有17%-20%的哺乳動(dòng)物piRNA對(duì)應(yīng)于標(biāo)記的重復(fù)序列，包括轉(zhuǎn)座子和逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子。因此，piRNA從后生程序化和抑制轉(zhuǎn)錄到轉(zhuǎn)錄后調(diào)控可能會(huì)有不同的功能。根據(jù)Piwi蛋白已知的功能推測piRNA的功能可能有3個(gè)方面。（1）沉默轉(zhuǎn)錄基因過程在果蠅中的研究已經(jīng)表明Piwi和rasiRNA的作用是沉默重復(fù)元件。在裂殖酵母( Schizosaccharom ycespom be)中，小RNA 和RNAi途徑涉及到了轉(zhuǎn)錄基因沉默( TGS) 。在研究哺乳動(dòng)物中TGS的因子時(shí)，純化得到了一個(gè)包含小RNA 和Riwi的復(fù)合物(與人類Piwi同源) ，該復(fù)合物稱為

5、piRNA復(fù)合物。它的制備物中包含rRecQ1，與脈孢菌(Neurospora) qde-3 基因的表達(dá)蛋白同源，而該基因參與沉默途徑。因此推斷，哺乳動(dòng)物的piRNA可能在TGS中起作用。在果蠅中，一個(gè)as-yet-uncloned異染色質(zhì)基因的功能性等位基因flam enco 能抑制內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄酶病毒gypsy。Piwi突變體，是已經(jīng)知道的影響RNA介導(dǎo)的同源決定的轉(zhuǎn)基因沉默，也說明了在限制性的雌性生殖腺中阻斷gypsy的抑制作用。因此，推斷piRNA的功能和Piwi蛋白密切相關(guān)，具有Piwi依賴性。最近又發(fā)現(xiàn)，在flam enco敲除突變體中成熟piRNA 的表達(dá)水平大量地減少，而在Piw

6、i敲除突變體中g(shù)ypsy RNA的表達(dá)水平卻增加了150倍，這些結(jié)果說明Piwi蛋白結(jié)合的piRNA的功能是維持轉(zhuǎn)座子沉默。最近，在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)了果蠅中存在的一種Aub-associate-piRNA 的沉默機(jī)制。Aub突變體導(dǎo)致了卵巢和睪丸中的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的積累，以及睪丸中的Stellate 轉(zhuǎn)錄物的積累。在卵巢中Aub-associate-piRNA來源于包括逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子在內(nèi)的基因間的重復(fù)元件。而在睪丸中的Aub也聯(lián)合著不同的piRNA。大多數(shù)piRNA與Stellate抑制基因轉(zhuǎn)錄本的反義鏈對(duì)應(yīng)，Stellate是已知的關(guān)于基因沉默的基因，另一個(gè)富含的種類是由來自X染色體和與vasa

7、轉(zhuǎn)錄本高度互補(bǔ)的序列組成。這是首次以生物化學(xué)的觀點(diǎn)提出了由Aub和piRNA介導(dǎo)的沉默機(jī)制。（2）維持生殖系和干細(xì)胞功能Piwi是一個(gè)表觀遺傳調(diào)控因子，起著調(diào)節(jié)生殖干細(xì)胞維持的作用。Polycomb group( PcG)蛋白可以維持關(guān)鍵的發(fā)育調(diào)節(jié)因子。在果蠅中， PcG與PcG反應(yīng)元件( PREs) 結(jié)合沉默持家基因。在果蠅基因組中，Piwi與PcG蛋白體共定位簇集成PcG反應(yīng)序列。這樣，一些Piwi有關(guān)的piRNA可能與表觀遺傳調(diào)控有關(guān)。研究人員在果蠅中檢測了關(guān)于RNA 積聚而假定的RNA沉默機(jī)制的效果。這些積聚的RNA包括不同的gypsy序列并報(bào)道了沉默的效果確實(shí)是與存在于卵巢中2530

8、nt長度的有義RNA 的數(shù)量有關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)rasiRNA 對(duì)gypsy 轉(zhuǎn)錄本的有義鏈有下調(diào)作用，而且，在雄性生殖系中， Piwi蛋白能夠阻止逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)錄。這樣證據(jù)表明一些piRNA 可能與后生調(diào)控有關(guān)。Piwi亞家族主要有3 個(gè)成員，分別是M IW I，M IL I和M IW I2，是生殖系細(xì)胞中的特異性蛋白，與精子的發(fā)生有非常密切的關(guān)系，敲除M iw i， M ili或M iw i2 基因，都會(huì)造成小鼠精子產(chǎn)生明顯缺陷，表現(xiàn)為雄性不育。M IL I在早期的精子發(fā)生時(shí)表達(dá)，即從精原細(xì)胞的有絲分裂到精母細(xì)胞的粗線期，缺失M IL I的小鼠則停止在粗線期;M IW I的表達(dá)則要晚一些，

9、從粗線期到球形精細(xì)胞期，基因敲除的M IW I會(huì)導(dǎo)致精子發(fā)生停止在球形精細(xì)胞期。而基因敲除的MIW I2的小鼠在減數(shù)分裂早期有減數(shù)分裂進(jìn)展的缺陷，并且生殖細(xì)胞隨著齡期有顯著的損失。M IW I2突變體中生殖細(xì)胞表型的損失，和果蠅中Piwi突變體一樣，證明了小鼠中的M IW I2和果蠅中的Piwi在維持生殖系和干細(xì)胞時(shí)起著類似的作用。盡管piRNA的具體功能還未完全弄清，但是生殖細(xì)胞中的piRNA 富集現(xiàn)象和Miwi突變種的雄性不育表明了piRNA在配子發(fā)育的過程中起重要作用，并且可能參與配子發(fā)生過程中基因表達(dá)模式及染色體組結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)。（3）調(diào)節(jié)翻譯和mRNA的穩(wěn)定性最初，Wilson等在果蠅胚

10、胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)aub在osker翻譯時(shí)有很重要的作用。盡管aub突變體似乎沒影響oskermRNA或Osker蛋白的穩(wěn)定性，但在這突變體中Osker蛋白表達(dá)量卻明顯地減少了。Megosh等對(duì)果蠅中的Piwi蛋白研究發(fā)現(xiàn)， Piwi的減少不能影響Osk和Vasa蛋白的表達(dá)但能導(dǎo)致極質(zhì)維持和原始生殖細(xì)胞( PGS)形成的失敗，而增加Piwi蛋白的表達(dá)量能提高Osk 和Vasa 蛋白的水平，也相應(yīng)成比例地提高PGS的數(shù)量。由此推斷， Piwi和Aub在果蠅胚胎發(fā)育時(shí)的翻譯可能具有正調(diào)節(jié)作用。同樣Miwi也可能促進(jìn)睪丸中精子形成時(shí)一種主要調(diào)節(jié)子(CREM)的穩(wěn)定性和目標(biāo)mRNA翻譯的穩(wěn)定性。2 piRN

11、A的生源論piRNA發(fā)現(xiàn)后，這類小RNA的來源一直是研究人員的研究重點(diǎn)之一。piRNA簇的鏈的強(qiáng)偏向性說明了它們可能產(chǎn)生于單鏈的前體，為了支持這個(gè)觀點(diǎn)， EST分析和RT-PCR實(shí)驗(yàn)都顯示了假定的初始轉(zhuǎn)錄本，但是在反義轉(zhuǎn)錄本中卻未檢測到。與miRNA前體不同，覆蓋有piRNA 克隆的區(qū)域沒有折疊入莖環(huán)結(jié)構(gòu)。因此， piRNA 的生物發(fā)生途徑明顯不同于miRNA 和siRNA。盡管之前的研究表明人類的Piwi蛋白能夠與Dicer酶相互作用，但并沒有確定piRNA生物發(fā)生過程中是否與RNAase III如Dicer和Drosha有關(guān)。為檢測Dicer酶的必備條件，研究人員將攜帶有純合子dicer突

12、變體的生殖細(xì)胞放在dicer野生型細(xì)胞的周圍。然后，從這些動(dòng)物精巢中分離純化發(fā)現(xiàn)了標(biāo)準(zhǔn)水平的piRNA，這強(qiáng)有力地說明了piRNA 的生物發(fā)生是與Dicer無關(guān)的。于是，研究人員提出了幾種可能的piRNA 生源論機(jī)制 : ( 1 ) 長距離dsRNA 結(jié)構(gòu)可能形成了前轉(zhuǎn)錄物，它能夠解釋piRNA鏈的偏向性; ( 2)反義轉(zhuǎn)錄物可能以很低的水平表達(dá)來避免檢測; (3)前轉(zhuǎn)錄物可能由ssRNA-directed未識(shí)別的酶消化; ( 4) piRNA 可能來源于由逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的逆轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的RNA -DNA 雙鏈體。最近，在果蠅和斑馬魚的研究中提出了Piwi蛋白作用的piRNA 的生源論機(jī)制。Gun

13、awardane等在果蠅卵巢中免疫純化了Aub和Ago3，并且分析了結(jié)合有不同Piwi蛋白的小RNA 的序列。發(fā)現(xiàn)Piwi關(guān)聯(lián)的RNA與果蠅基因組中缺失的轉(zhuǎn)座子元件相對(duì)應(yīng)。他們預(yù)測了與siRNA或miRNA相似的加工機(jī)制，首先在piRNA的兩條鏈的3端由RNase III產(chǎn)生的2nt的懸突，即piRNA的兩條鏈在5端的23nt處切割(假定piRNA的平均長度為25nt) 。他們繪出了piRNA5端和5近鄰端的反義鏈的距離，根據(jù)預(yù)測的23nt的峰值處，發(fā)現(xiàn)piRNA5端的互補(bǔ)鏈經(jīng)常是在10nt處切割的，還發(fā)現(xiàn)piRNA在Ago3和Aub復(fù)合體中有很強(qiáng)的互補(bǔ)關(guān)系。在piRNA兩條鏈中的10nt的重

14、疊促使了Piwi蛋白在piRNA的生物發(fā)生中起作用的假說。因此，提出了一個(gè)ping-pong模型(圖1) :一個(gè)反義piRNA，衍生于絡(luò)合有Aub或Piwi的piRNA基因座，能識(shí)別和分離有義鏈的轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)錄物。這個(gè)分離事件發(fā)生在反義piRNA相對(duì)的1011nt的位置，從原初piRNA末端的相反鏈上，產(chǎn)生了一個(gè)距5端長度為10nt的片段。分離的產(chǎn)物將裝載入第二種Piwi蛋白家族，根據(jù)觀測鏈的偏向性很可能是Ago3，與Ago3相關(guān)的piRNA在位置10處有很高的腺嘌呤百分比例。最終，經(jīng)3端未知的機(jī)制加工后成為新的piRNA。Houwing等在研究斑馬魚中的piRNA 時(shí)發(fā)現(xiàn)，piRNA簇集與所有的

15、GypsyDR1和GypsyDR2的位點(diǎn)有義鏈匹配，也是缺少U 的偏向性。相反，如前面所述，在10nt位置富含A。這說明了進(jìn)化的保守不僅是piRNA生物發(fā)生的策略，還是轉(zhuǎn)座子調(diào)控的一種生物化學(xué)途徑。先前的文獻(xiàn)表明哺乳動(dòng)物的piRNA在3端的2-O甲基化。piRNA的生物合成機(jī)制和修飾功能仍舊不清楚。Kirino等報(bào)道了植物miRNA2-O-甲基轉(zhuǎn)移酶HEN1在小鼠中的同源蛋白mHEN1，它在體外培養(yǎng)的睪丸中特異性表達(dá)并且使piRNA 的3端發(fā)生了甲基化，而HEN1 在果蠅中的同源蛋白Pimet 則介導(dǎo)了piRNA3端的2-O-甲基化作用。Iguchi等在研究小鼠中的兩種蛋白(MSY2和Tran

16、slin)時(shí)發(fā)現(xiàn)，包含有Nct1和Nct2的一段序列與piRNAs的序列相同，并檢測到它們主要存在于精母細(xì)胞的粗線期。此外，還發(fā)現(xiàn)在精子發(fā)生進(jìn)行時(shí)，單一拷貝的piRNAs， gsRNA10(其序列與在Nct1的29nt相同)的增加伴隨著Nct1和Nct2的減少，因此提出了Nct1 和Nct2 是piRNA 前體的一部分。這些結(jié)果對(duì)piRNA的生源論研究提供了很好的理論基礎(chǔ)。3 piRNA的生物信息學(xué)研究最近，印度科學(xué)家Sai Lakshmi S及其合作者建立了一個(gè)piRNA 數(shù)據(jù)庫piRNABank，以保存新發(fā)現(xiàn)的piRNA序列。piRNABank是一個(gè)高度用戶友好的資源，它收錄了包括人、小鼠

17、和大鼠的近2000萬個(gè)piRNA相關(guān)序列，經(jīng)過同源序列去除、基因組定位等篩選，最近得到10萬多個(gè)在基因組中具有唯一靶位點(diǎn)的piRNA序列。數(shù)據(jù)庫支持物種和染色體方式的多種的搜索方式，包括登錄號(hào)、染色體定位、基因名或符號(hào)，基于同源性的序列檢索，簇和相應(yīng)基因及重復(fù)元件。它也可以在基因組大圖譜上顯示每個(gè)piRNA或piRNA簇。數(shù)據(jù)庫內(nèi)的信息也將隨著新的研究進(jìn)行不斷更新，果蠅和其它物種的piRNA信息也將會(huì)被收錄，作者還計(jì)劃增加一些序列和結(jié)構(gòu)預(yù)測的軟件，更方便科研人員使用。4 存在的問題與展望piRNA 的發(fā)現(xiàn)為非編碼小分子RNA 的研究開辟了一個(gè)新領(lǐng)域，被Science評(píng)為2006年十大科技進(jìn)展之

18、一。到目前為止， piRNA 的研究已經(jīng)取得了階段性的成果，但要預(yù)測piRNA在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用還為時(shí)過早。其中仍然有許多問題需要進(jìn)一步研討，如piRNA的序列在不同物種中的同源保守性還不好分析;在piRNA生源論中，仍舊不知道3端的分裂機(jī)制和piRNA擴(kuò)增循環(huán)是如何調(diào)節(jié)的。另一個(gè)尚未解決的問題是piRNA在特異位點(diǎn)表達(dá)的結(jié)果所產(chǎn)生的功能以及piRNA3端甲基化的機(jī)制還沒有弄清楚。piRNA 和Piwi蛋白在后生調(diào)控中起的作用很可能大于轉(zhuǎn)座子沉默的作用，目前，本實(shí)驗(yàn)室正研究非生殖器官Piwi蛋白高表達(dá)組織中， piRNA的克隆及調(diào)控作用，但尚未取得有意義的進(jìn)展。因此， piRNA的研究不僅可以

19、豐富小分子RNA的研究內(nèi)容，同時(shí)，也有利于我們進(jìn)一步了解生物配子發(fā)生的分子調(diào)控及其機(jī)理，具有十分重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景?？茖W(xué)家在老鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)了一類全新的（核糖核酸），這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步拓寬了的研究范圍。           據(jù)英國自然雜志網(wǎng)絡(luò)版報(bào)道，美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室的格雷格·漢農(nóng)等科學(xué)家在對(duì)老鼠睪丸中的所有編目時(shí)，新發(fā)現(xiàn)這類?？茖W(xué)家說，這類比已發(fā)現(xiàn)的其他小，如微和短干涉等都要稍長。         

20、0; 科學(xué)家對(duì)從老鼠睪丸中提取出的蛋白質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這種蛋白質(zhì)上附著了新發(fā)現(xiàn)的。他們將這類新命名為“互動(dòng)”（簡稱）。蛋白質(zhì)通常在睪丸中得到表達(dá)，如果這種蛋白質(zhì)不起作用，老鼠將無法產(chǎn)生正常的精子。           科學(xué)家們正在試圖弄清這類新的確切作用。研究顯示，斑馬魚、蒼蠅體內(nèi)以及人類睪丸中都存在類似的。由于老鼠需要和蛋白質(zhì)來制造精子，科學(xué)家推測，和蛋白質(zhì)能控制導(dǎo)致精子生成的一些重大變化，如減數(shù)分裂過程中使遺傳物質(zhì)減半的細(xì)胞分裂。    

21、0;      雖然目前還沒有任何證據(jù)支持上述猜想，但研究人員指出，新型的發(fā)現(xiàn)拓寬了研究的領(lǐng)域。 兩研究小組掀起小分子RNA研究新浪潮           來自冷泉港實(shí)驗(yàn)室（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）的Gregory  Hannon研究小組和紐約洛克菲勒大學(xué)（Rockefeller  Univers

22、ity  in  New  York）的Thomas  Tuschl研究小組的研究人員發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種不同的哺乳動(dòng)物小分子RNA的一個(gè)新成員piRNAs（Piwi-interacting），該種小RNA在小鼠精子發(fā)育中普遍存在，并起到了重要作用。這一研究成果公布在6月4日的Nature網(wǎng)絡(luò)版。           兩個(gè)小組發(fā)現(xiàn)大概90%的piRNA序列以尿嘧啶開始，與其它的小RNA分子的特點(diǎn)一樣。Hannon和他的同事們

23、在小鼠睪丸中發(fā)現(xiàn)了52,934種候選piRNAs，在人類中發(fā)現(xiàn)了52,099種，而在老鼠中發(fā)現(xiàn)了47,024種。在這些物種中，大部分piRNAs成簇形成相對(duì)少量的基因座（loci），小鼠中大約形成100個(gè)主要的基因簇。這種成簇現(xiàn)象表明大量的piRNA由長距離轉(zhuǎn)錄加工而成。           與microRNAs和siRNAs不一樣，piRNAs來源于單鏈RNA前體（precursor）而不是雙鏈RNA前體。Tuschl和他的同事們認(rèn)為，與近親老鼠的基因組比較，小鼠的piRNA序列保守性良好，但

24、是與遺傳距離較遠(yuǎn)的物種相比，保守性較差。盡管如此，大部分小鼠的piRNA簇能在人和老鼠染色體上相同的位置找到?！八鼈兙秃孟笫侨旧w上某類基因的劃分地界線。這強(qiáng)有力的說明它們可能與染色體生物學(xué)有關(guān)?！盚annon說。           PiRNAs在人內(nèi)出現(xiàn)的豐度比小鼠小，假設(shè)piRNAs的功能是識(shí)別互補(bǔ)的信使RNA，也許人的RNA結(jié)合蛋白則代替了一些piRNAs的功能。RNA結(jié)合蛋白是人類基因組中最大種類的蛋白之一。兩個(gè)研究小組利用northern  blotting分析發(fā)

25、現(xiàn)piRNAs出現(xiàn)在小鼠的精子細(xì)胞中，尤其是在減數(shù)分離開始時(shí)大量積聚，在成熟的精子產(chǎn)物中消失?！拔覀儍H能在人類和小鼠的睪丸中發(fā)現(xiàn)piRNAs，它們也許在卵子的發(fā)育過程中也有表達(dá)，”Tuschl說。           “在精子細(xì)胞的減數(shù)分裂結(jié)束前，我們發(fā)現(xiàn)了基因轉(zhuǎn)錄的爆發(fā)，而在基因轉(zhuǎn)錄爆發(fā)前有巨大的、迅速的piRNAs最終爆發(fā)。”           來自底特律韋恩州立大學(xué)的Stephen

26、0; Krawetz說?！坝腥さ氖菚?huì)看到piRNAs是否參與轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)或者RNA的存儲(chǔ)?！?#160;          將來的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該研究什么樣的蛋白與Piwi-linked核蛋白復(fù)合體相聯(lián)系，來弄明白piRNAs怎樣與已知的過程聯(lián)系，或者研究者們也想知道在Piwi基因敲除的動(dòng)物中的piRNA表達(dá)情況。                （

27、生物通：亞歷）           來自冷泉港實(shí)驗(yàn)室（Cold  Spring  Harbor  Laboratory）的Gregory  Hannon研究小組和紐約洛克菲勒大學(xué)（Rockefeller  University  in  New  York）的Thomas  Tuschl研究小組的研究人員發(fā)現(xiàn)了數(shù)千種不

28、同的哺乳動(dòng)物小分子RNA的一個(gè)新成員piRNAs（Piwi-interacting），該種小RNA在小鼠精子發(fā)育中普遍存在，并起到了重要作用。這一研究成果公布在6月4日的Nature網(wǎng)絡(luò)版。           自2000年RNA研究進(jìn)展被Science雜志評(píng)為年度重大科技突破之后，2001年的RNAi，2002年的“Small  RNA  &  RNAi”，以及2003年的小核糖核酸都相繼在重大科技成就上榜上有名。RNA研究風(fēng)

29、聲水起，就連在DNA的傳遞遺傳物質(zhì)和蛋白的執(zhí)行功能這些“專長”方面也發(fā)現(xiàn)是由RNA最初具有的。           piRNA，即Piwi-interacting  nucleotides，在之前的發(fā)育精子研究中就發(fā)現(xiàn)其對(duì)于合子的形成的復(fù)雜過程中勢必可少的，但是它們的功能和起源仍然是不清楚的，洛克菲勒大學(xué)的Tuschl認(rèn)為“如果piRNAs研究趨勢與microRNAs相似的話，那么生物界將會(huì)由這些從事piRNA未知領(lǐng)域研究的科學(xué)家們帶來一股研究新浪潮。”  

30、;         研究人員主要的研究對(duì)象是來自無脊椎動(dòng)物和小鼠中研究精子細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用的Piwi蛋白這些蛋白分子組成了Argonaute家族蛋白的一個(gè)結(jié)構(gòu)域，microRNA靶向Argonaute蛋白標(biāo)志來使基因沉默。           兩個(gè)研究小組都分別對(duì)能與小鼠睪丸組織包含Piwi蛋白的核蛋白復(fù)合體免疫共沉的RNA進(jìn)行了純化、克隆和測序。其中Tuschl和他的同事們的實(shí)驗(yàn)利用了Piwi蛋白的同源蛋白

31、MILI蛋白，而冷泉港實(shí)驗(yàn)室的Gregory  Hannon則利用MIWI進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果兩個(gè)研究小組都在他們的免疫共沉淀試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了21-23核苷酸長度的RNA分子。Hannon小組的Northern印跡分析顯示這些單鏈RNA與Piwi相連，而不是與其它Argonaute蛋白相連。兩個(gè)研究小組將這些RNA稱作Piwi-interacting  nucleotides或者piRNA，并且發(fā)現(xiàn)與MIWI相比，MILI與稍微小一點(diǎn)的piRNA相結(jié)合。  （生物通：亞歷）發(fā)現(xiàn)新一類基因沉默的小RNApiRNA David Towersimpe

32、r評(píng)論:本文來自于06年06月15日的Science雜志的網(wǎng)絡(luò)版Sciencexpress上，中文翻譯由David Towersimper完成，轉(zhuǎn)載時(shí)請(qǐng)標(biāo)明"David Towersimper翻譯"字樣。      非編碼性的小RNA調(diào)節(jié)著一些對(duì)細(xì)胞生長和發(fā)育必需的過程，包括mRNA降解，翻譯抑制，轉(zhuǎn)錄階段基因沉默(transcriptional gene silencing,TGS)。在哺乳動(dòng)物中尋找造成TGS的因子過程里，作者純化出一個(gè)含有小RNA和Riwi(老鼠中的人類Piwi的同源物)。這些RNA，長度通常在29-3

33、0nt，被稱為與Piwi相互作用作用的piRNA復(fù)合物的(piRC)制備物中含有rRecQ1，其中rRecQ1是脈孢菌(Neurospora) qde-3基因表達(dá)蛋白的同源物，該基因參與沉默途徑。Piwi在蒼蠅里就已與TGS在遺傳上聯(lián)系起來，也與純化的piRNA復(fù)合物的具有切割活性的共分級(jí)分離(cofractionate)物聯(lián)系。這些結(jié)果就與piRC中存在著一個(gè)基因沉默作用相一致。該研究成果已經(jīng)發(fā)表在06年06月15日的Science雜志的網(wǎng)絡(luò)版Sciencexpress上。      小RNA指導(dǎo)的基因沉默途徑或在轉(zhuǎn)錄階段上發(fā)揮作用，或在轉(zhuǎn)錄

34、后階段上發(fā)揮作用。轉(zhuǎn)錄后基因沉默通過mRNA去穩(wěn)定化或者mRNA翻譯抑制起作用，而轉(zhuǎn)錄階段基因沉默則是通過改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象抑制基因表達(dá)。這兩個(gè)途徑均利用一個(gè)核心復(fù)合物，該復(fù)合物含有小RNA和Ago(Argonaute)蛋白家族的一個(gè)成員。然而，它們之間不同的機(jī)制也意味著復(fù)合物的組成上也有差別。小RNA介導(dǎo)的TGS雖然在裂變酵母和其他真核生物中已被研究，但是在哺乳動(dòng)物中這個(gè)過程的機(jī)制仍然有待闡述。      通過將制備的老鼠睪丸粗提物進(jìn)行離子交換Q柱分離，分成流出物和洗脫物兩部分，同時(shí)監(jiān)控小RNA，構(gòu)建cDNA文庫后進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)流出物中的RNA主

35、要是microRNA(miRNA)，洗脫物中的RNA(69%)主要是從那些平常被認(rèn)為不能表達(dá)的基因組區(qū)域獲得的，長度大多在25-31nt，而且Northern印跡分析也顯示出一個(gè)睪丸特異性的特征。大多數(shù)的洗脫物中RNA5端大多以尿苷開始(約84%)，但沒有特征性序列或基序被檢測到。而且，在洗脫物中RNA觀察到一個(gè)明顯的亞群體(subpopulation)長度在29-30nt，然而它們與洗脫物中的其他的RNA無論是在5核苷，基因組上的位點(diǎn)，還是注釋上都不能去區(qū)別開來。因此，所有洗脫出的RNA不能與已經(jīng)注釋的非編碼性的RNA(miRNA, tRNA, rRNA, snRNA)匹配，而一起被認(rèn)為代表

36、著新鑒定出的一類小RNA。       隨后又通過五步的實(shí)驗(yàn)程序純化與這類小RNA作用的蛋白，質(zhì)譜結(jié)果鑒定出老鼠中存在人類Piwi和RecQ1蛋白的同源物(分別稱為Riwi和rRecQ1)。Western印跡結(jié)果也證實(shí)Riwi和rRecQ1與這些小RNA共純化。因此，作者將這類小RNA命名為與Piwi相互作用的RNA(piRNA)，并將與老鼠Piwi同源物一起形成的復(fù)合物稱為piRNA復(fù)合物。       已知的起沉默作用的RNA(siRNA, miRNA)起源于雙鏈RNA前

37、體物或者呈折疊結(jié)構(gòu)的RNA。不同于miRNA和siRNA，piRNA中的94能對(duì)應(yīng)到基因組中100個(gè)確定的區(qū)域(每個(gè)區(qū)域長度小于100kb)。在在這些區(qū)域里，piRNA通常只沿著基因組的一條鏈分布，或有時(shí)不規(guī)則地分布在兩條鏈上，但是相互分開，而不重疊在一起，但是都沒有證據(jù)表明piRNA起源于折疊的結(jié)構(gòu)或雙鏈RNA。piRNA在基因組上的位點(diǎn)分析表明大約2/3的piRNA序列中的每個(gè)都完美地匹配單個(gè)位點(diǎn)，不過也一些情況下也單個(gè)位點(diǎn)被多個(gè)piRNA序列匹配上。此外，Northern印跡分析也表明piRNA主要起源于基因組雙鏈中的一條鏈。      

38、人類的RecQ1是一個(gè)ATP依賴性的DNA解旋酶，它的ATPase和DNA解旋活性在piRC中的rRecQ1蛋白也存在。Riwi含有催化性的氨基酸殘基，這些殘基在其他的Ago家族蛋白中被用來進(jìn)行RNA指導(dǎo)的靶標(biāo)RNA切割。通過使用與piRNA互補(bǔ)的底物，也能檢測到切割活性，尤其是在含有Riwi和piRNA的組分中活性最高，然而，活性不強(qiáng)健，這可能是不同piRNA組成的總體中相關(guān)的piRNA所占比重較小(<0.2%)的緣故。       Piwi蛋白代表著Ago蛋白家族中的一個(gè)分支(subclade)，首次在在果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)，起著調(diào)節(jié)生殖干細(xì)胞維持的作用。隨后也發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的Piwi蛋白成員調(diào)節(jié)著生殖細(xì)胞的成熟。piwi基因突變的果蠅在小RNA依賴性的轉(zhuǎn)基因和逆轉(zhuǎn)座子沉默上存在缺陷，同時(shí)也喪失了異染色質(zhì)蛋白的。四膜蟲(Tetrahymena) Piwi (TIWI)對(duì)siRNA調(diào)節(jié)的DNA降解是必需的。       脈孢菌中，在篩選破除營養(yǎng)生長階段的基因沉默的過程中鑒定出QDE-2(Ago蛋白家族的一個(gè)成員)