銀杏葉中銀杏黃酮大孔樹(shù)脂吸附分離性能地研究的設(shè)計(jì)

1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案銀杏葉中銀杏黃酮大孔樹(shù)脂吸附分離性能的研究近年來(lái)，整個(gè)世界特別是西方發(fā)達(dá)國(guó)家掀起了一陣綠色浪潮。國(guó)際上漸漸形 成了一種共識(shí)-得自綠色生命(植物)的產(chǎn)品往往具有較大的安全性。銀杏作為近 代植物藥開(kāi)發(fā)研究的熱點(diǎn)之一，正處于這一浪潮的前沿。銀杏樹(shù)為銀杏科植物銀杏(Ginkgo biloba.L.)又名公孫樹(shù)，為我國(guó)特產(chǎn)植物. 銀杏葉提取物(GRE)主要含黃酮，內(nèi)酯兩類活性成分，黃酮以山柰酚(kaempferal), 槲皮素(quercetin),異鼠李素(isorham netin)的甙類化合物為主,內(nèi)酯以白果內(nèi) 酯及銀杏內(nèi)酯A.B.C(gimkgolide ABC)為主。銀杏黃酮具有捕

2、獲游離基,抑制血 小板活化因子(PFA)擴(kuò)張冠動(dòng)脈血管,增加心腦血量等功效?？捎糜谥委熡捎谘?老化，腦血管供血不足所導(dǎo)致的外周循環(huán)不良眩暈耳鳴頭痛失眠,短期記憶不良 聽(tīng)力障礙,精神不振等,同時(shí),還可以用于研制營(yíng)養(yǎng)口服液，保健食品與化妝品，其應(yīng) 用日益廣泛有關(guān)銀杏提取方法報(bào)道很多，德國(guó)首先提出銀杏制劑含量的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn): 黃酮糖甙24%萜內(nèi)酯6%和白果酸2 X10-6。為了是銀杏產(chǎn)品能出口創(chuàng)匯，參 加國(guó)際市場(chǎng)的大循環(huán)，不斷探索新的提取方法工藝,研究并選擇出簡(jiǎn)單且高效的工 藝方法以成為這個(gè)領(lǐng)域的焦點(diǎn)。目前有關(guān)銀杏葉的提取工藝主要以乙醇為提取溶劑，由于乙醇系有機(jī)溶劑， 消耗大、成本高、且生產(chǎn)過(guò)程存在易

3、燃等安全隱患，為此我們根據(jù)銀杏葉異黃酮 有一定的水溶性，試改用水做提取溶劑，以銀杏黃酮為目標(biāo)，對(duì)其銀杏黃酮進(jìn)行 了正交提取工藝研究，并對(duì)最佳提取工藝得到的提取液進(jìn)行了大孔吸附樹(shù)脂吸附 分離性能研究，以期為銀杏葉銀杏黃酮的開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。1材料與儀器1.1材料 銀杏葉（采自陜西略陽(yáng)），自然干燥，粉碎。1.2試劑銀杏黃酮對(duì)照品（含量98%）:購(gòu)自Sigma公司;大孔樹(shù)脂LX-38、LX-1、D101 , AB-8購(gòu)自西安藍(lán)小科技開(kāi)發(fā)有限公司。試劑均為分析純。1.3儀器電熱恒溫水浴鍋（H H S21-6C ,上海醫(yī)療器械五廠）;電子分析天平 （FC204，上海精科實(shí)業(yè)有限公司）;UV -762紫外

4、分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器 有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞蓉生化儀器廠）；SHZ-D（川）循環(huán)水式真空泵，索式 提取器，電熱鼓風(fēng)干燥箱；植物粉碎機(jī)（FZ102，天津市泰斯特儀器有限公司）2方法2.1銀杏葉銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯的薄層檢測(cè)銀杏葉銀杏黃酮的薄層檢測(cè)硅膠薄板制作稱取4g硅膠G置于研缽中，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液12ml，研磨15min后鋪于20 X10cm的干凈玻璃平板上，要求平整無(wú)氣泡，然后晾干即可。 展開(kāi)劑配制取展開(kāi)劑氯仿-甲醇-乙酸乙酯按2: 1 : 1的比例配制60ml （30 : 15 : 15） 作為展開(kāi)劑。薄板活化：將制好的硅膠薄板在105 °C下活化3

5、0min 。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣點(diǎn)距板子底端1.5cm左右，所有點(diǎn)樣點(diǎn)位于同一直線上，盡可能向中間靠攏，每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)點(diǎn)樣約20訕，點(diǎn)樣點(diǎn)盡可能小。飽和：將板子不沒(méi)入層析缸內(nèi)的展層劑中，在展層劑的蒸氣中飽和約0.5h。層析：將板子下端插入展層劑中進(jìn)行展開(kāi)，當(dāng)展層劑前沿距板子上端約1.5cm 時(shí)取出板子，自然晾干。觀察：展開(kāi)取出晾干后，噴5%Alcl3的乙醇溶液，熱風(fēng)吹干、并在365nm熒光燈 下觀察。Rf 。銀杏葉銀杏內(nèi)酯的薄層檢測(cè)硅膠薄板制作稱取4g硅膠G或硅膠GF254置于研缽中，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶 液12ml，研磨15min后鋪于20 X10cm的干凈玻璃平板上，要求平整無(wú)氣泡， 然后晾干

6、即可。展開(kāi)劑配制取展開(kāi)劑甲苯-丙酮按7: 3的比例配制50ml (35 : 15)作為展開(kāi)劑。薄板活化：將制好的硅膠薄板在105 °C下活化30min。點(diǎn)樣：點(diǎn)樣點(diǎn)距板子底端1.5cm左右，所有點(diǎn)樣點(diǎn)位于同一直線上，盡可能向 中間靠攏，每個(gè)點(diǎn)樣點(diǎn)點(diǎn)樣約20訕，點(diǎn)樣點(diǎn)盡可能小。飽和：將板子不沒(méi)入層析缸內(nèi)的展層劑中，在展層劑的蒸氣中飽和約0.5h。層析：將板子下端插入展層劑中進(jìn)行展開(kāi)，當(dāng)展層劑前沿距板子上端約1.5cm時(shí)取出板子，自然晾干。觀察：先噴細(xì)水霧定位后170C加熱30分鐘，若有銀杏內(nèi)酯存在，在波長(zhǎng)254nm 下出現(xiàn)蒼黃色熒光斑點(diǎn)，銀杏內(nèi)酯B的Rf=0.23左右。2.2絡(luò)合分光光

7、度法測(cè)定銀杏黃酮的含量a.標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精確秤取蕓香葉甙rutin （蘆?。?0mg,用30%乙醇溶液溶解并定容至 100ml （含量為0.30mg/ml）分別吸取標(biāo)準(zhǔn)液1、3、5、7、9ml于25ml容量 瓶中，用30%乙醇補(bǔ)充至12.5ml，加入0.7mlNaNo2（1:20）,搖勻，放置5分鐘后, 加入0.7mlAI（N 03）3（1:20）,6分鐘后加入5ml 1mol/L的NaoH溶液并搖勻，用 30%的乙醇補(bǔ)充至刻度線,10分鐘后于510nm進(jìn)行比色測(cè)定。用UV-265可記錄分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果如下毫升013579濃度值(m g/m l)00.0120.0360.0600.0840.

8、108OD值b.樣品的制備及測(cè)定準(zhǔn)備稱取2克銀杏葉粉碎至粉末，放置于索氏提取管中。加約150ml甲醇熱 回流至回流液無(wú)色，減壓濃縮至小體積、定容至150ml，搖勻待測(cè)，從中移取 5ml到25ml中的容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法加樣，并用UV-265紫外分 析儀測(cè)定其濃度。精確產(chǎn)品50mg，用30%乙醇溶液溶解并定容至100ml。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線如下:測(cè)定結(jié)果:2.3大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)表1吸附樹(shù)脂的物理性能型號(hào)極性比表面積/(m2/g)孔徑/nmLX-38LX-1D101AB-82.3.1樹(shù)脂的處理和再生:將樹(shù)脂放入蒸餾水中，溶脹后浮選，用1moL/L的NaOH溶液浸泡4h，用 蒸餾水洗至中性，

9、然后用0.5moL/L的HCI溶液浸泡3h，用蒸餾水洗至中性。 用95%乙醇浸泡24h，不斷攪拌，用蒸餾水洗至無(wú)白色混濁，并且無(wú)醇味。用 蒸餾水浸泡待用。樹(shù)脂簡(jiǎn)單再生可用含量為 95%的乙醇洗至無(wú)色，即可使用，經(jīng)多次使用的 樹(shù)脂吸附雜質(zhì)較多，顏色較深，可用酸堿處理再生后使用。232銀杏葉樣液制備稱取銀杏葉100g，加600ml 75% 酒精超聲提取30min，用4層紗布粗濾 得粗濾液，殘?jiān)偌尤?00ml75%酒精超聲提取30min ,用4層紗布粗濾得粗 濾液，合并兩次粗濾液，在用濾紙或離心過(guò)濾得銀杏葉提取液。銀杏葉提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，加 65 C溫水至400 ml進(jìn)行水沉，靜置 過(guò)夜，次

10、日下層為油狀膏子保留備檢，上層液過(guò)濾并定容至 400 ml，得銀杏葉 樣液( g/ml )。2.3.3飽和吸附量的測(cè)定準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的用濾紙吸干表面水分的樹(shù)脂1.00 g于100 ml三角瓶中，精密加入 mg/ml的銀杏葉銀杏黃酮溶液 20.0 ml，在25 °C, 120 r/mi n 的條件下振蕩吸附18-24 h。測(cè)定吸附后溶液中銀杏黃酮的量，并按下式計(jì)算樹(shù)脂的飽和吸附量。飽和吸附量=（加入的銀杏黃酮-未吸附的銀杏黃酮”樹(shù)脂的量。2.3.4樹(shù)脂脫附率的測(cè)定將上述經(jīng)過(guò)24 h靜態(tài)吸附銀杏黃酮的樹(shù)脂分離出來(lái)，吸干表面水分，然后 加入70%的乙醇20.0 ml，在25 C，120

11、r/min的條件下振蕩脫附2 h。測(cè)定 脫附液中銀杏黃酮的量，按下式計(jì)算脫附率。脫附率（）=洗脫出的銀杏黃酮/（加入的銀杏黃酮-未吸附的銀杏黃酮）X 100%。不同樹(shù)脂對(duì)銀杏黃酮的吸附量和解吸實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表。表大孔樹(shù)脂靜態(tài)吸附及解吸性能型號(hào)吸附量/（mg/g）解吸率/%LX-38LX-1D101AB-8從表 可看到4種樹(shù)脂中 樹(shù)脂的吸附量最大， 最小，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng) 用中，對(duì)樹(shù)脂要求不僅要求吸附量大，而且要求解吸率要高，以保證有效成分的 最大回收。在這2種樹(shù)脂中 樹(shù)脂不僅具有大的吸附量，而且具有較高的解吸 率，因此認(rèn)為 樹(shù)脂是富集純化銀杏黃酮較為理想的吸附材料。235大孔吸附樹(shù)脂解吸特性的考察按2

12、33項(xiàng)的方法得到吸附飽和的樹(shù)脂5份,分別精確加入20 mL的15%、30%、45%、60%和75%的乙醇溶液進(jìn)行解吸，計(jì)算不同濃度乙醇溶液對(duì) 銀杏黃酮的解吸率。選擇洗脫劑不僅要求具有使大孔樹(shù)脂溶脹，減弱被吸附物質(zhì)與樹(shù)脂之間的吸 附力，而且要求可溶解被吸附物質(zhì)，本實(shí)驗(yàn)選用洗脫劑為乙醇，考察不同乙醇溶 液濃度對(duì)銀杏黃酮的解吸效果，結(jié)果見(jiàn)圖1。洗脫劑濃度15%30%45%60%75%解吸率%將表做圖圖洗脫劑濃度對(duì)銀杏黃酮解吸的影響由圖 可以看出，15%和30%的洗脫液解吸率較低，而60%的洗脫液基本 上可以將銀杏黃酮完全從樹(shù)脂上解吸下來(lái)，從純化的純度角度和節(jié)約試劑用量的 角度考慮，應(yīng)選用60%乙醇作

13、為洗脫劑，沒(méi)有必要使用75%的乙醇作為洗脫劑。 2.3.6 pH對(duì)樹(shù)脂吸附效果的影響準(zhǔn)確稱取預(yù)處理好的用濾紙吸干表面水份的濕樹(shù)脂5份，每份1.0 g，裝入50mL具塞錐形瓶中，分別加入用2mol/L的鹽酸和2mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH值的溶液20mL，在搖床上振搖18-24 h，測(cè)定吸附后溶液中銀杏黃酮的量。pH值3.54.55.56.57.5吸附量將表做圖由圖 可以看出,pH值在4.5-5.5之間,樹(shù)脂對(duì)銀杏黃酮的吸附量是最大的, 因?yàn)殂y杏葉黃酮類化合物分子中含有酚羥基、羧基，呈弱酸性，酸性化合物在酸性溶液中易吸附；此外，酸性條件下有利于葡萄糖苷型異黃酮水解成苷元型，更容易被樹(shù)脂所吸附。酸

14、性太強(qiáng)，樹(shù)脂的吸附性能會(huì)受到影響，吸附率下降堿性增強(qiáng)，會(huì)使 異黃酮的親水性增強(qiáng)，從而使吸附量下降。2.4大孔樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)2.4.1動(dòng)態(tài)吸附透過(guò)曲線的測(cè)定吸附材料選取樹(shù)脂，采用16 mm X300 mm的玻璃層析柱作為吸附柱，稱取預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g，濕法裝柱，取銀杏葉樣液（g/ml ） 300mL，用2mol/L的鹽酸將黃酮供試液調(diào) pH值為進(jìn)行上樣，上樣流速控制在2 3 mL/min，每50 mL接一管，測(cè)定流出液中銀杏黃酮濃度，繪制動(dòng)態(tài)吸附透過(guò)曲 線。流出液體積ml50100150200250300流出液濃度mg/ml將表做圖由圖 可以看出，當(dāng)上樣液體積達(dá)到100mL時(shí),原料液中銀杏

15、黃酮開(kāi)始透過(guò) 樹(shù)脂柱，當(dāng)體積達(dá)到200mL時(shí)，樹(shù)脂柱達(dá)到飽和吸附。2.4.2動(dòng)態(tài)脫附解吸曲線測(cè)定稱取預(yù)處理好的樹(shù)脂20 g，濕法裝柱，用2mol/L的鹽酸將銀杏黃酮供試液調(diào)pH值為 進(jìn)行上樣，上樣流速控制在2-3 mL/min ，上樣量為300 mL， 上樣結(jié)束后用200mL的蒸餾水進(jìn)行洗滌，以除去水溶性雜質(zhì)，然后用75%的乙 醇進(jìn)行洗脫，每50mL接一管，測(cè)量流出液中銀杏黃酮濃度，繪制動(dòng)態(tài)脫附解吸線洗脫劑體積ml20406080100120流出液濃度mg/ml將表做圖由圖 可以看出，用100 mL 75%的乙醇進(jìn)行洗脫，可基本上將銀杏黃酮完全 解吸下來(lái)，洗脫峰集中、對(duì)稱，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，起到了很好的富集和回收的作用。 2.4.2洗脫產(chǎn)物中銀杏黃酮純度的測(cè)定(由上述實(shí)驗(yàn)確定方案)分別用45%、60%和75%的乙醇作為洗脫劑，按前面的做法裝柱、上