花生抗青枯病分子機理初步解析VIP

1、花生抗青枯病分子機理初步解析花生是我國重要的油料和經(jīng)濟作物,由青枯雷爾氏菌引起的青枯病是花生最重要的土傳性細菌病害,是影響花生產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因子之一,目前還沒有行之有效的化學防治手段。解決青枯病最有效的手段是培育抗病品種,但是傳統(tǒng)雜交育種方法選育出的抗病品種存在周期長、抗性與高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)負相關(guān)等問題,利用分子育種技術(shù)培育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗青枯病花生品種是有效解決花生受青枯病侵染的有效途徑。目前國內(nèi)外對花生抗青枯病的分子機理研究甚少,對控制青枯病的抗性基因數(shù)目、作用機制、花生-青枯菌互作的機理還不清楚。隨著全基因組測序和功能基因組學的迅速發(fā)展,通過正反向遺傳學的方法克隆花生抗青枯病基因,剖析花生-青枯菌的

2、互作機制成為必然,由于花生的基因組龐大,通過正向遺傳學圖位克隆花生抗青枯病基因和解析花生抗青枯病的機理較為困難。因此,本研究旨在通過反向遺傳學手段找到與青枯病相關(guān)的抗病基因,再通過轉(zhuǎn)基因驗證其功能,分析其抗病調(diào)控網(wǎng)絡(luò),這將有助于揭示花生抗青枯病分子機理,促進花生抗青枯病遺傳改良。主要研究結(jié)果如下:1.采用蛋白質(zhì)組學的方法對抗感青枯病花生品種在青枯菌侵染后的葉片的蛋白質(zhì)組進行了比較。根據(jù)對青枯菌侵染的不同反應(yīng),篩選出了高抗的粵油92栽培種和高感的新會小粒栽培種。分別對兩個品種4周大的幼苗用剪葉法進行青枯菌侵染,然后從受侵染的植株葉片中提取蛋白質(zhì),進行雙向凝膠電泳、考馬斯亮藍染色、質(zhì)譜分析、蛋白數(shù)

3、據(jù)庫比對。和各自的對照組相比,抗、感品種中共發(fā)現(xiàn)14種差異表達蛋白。這些蛋白中,有5個是誘導(dǎo)產(chǎn)生的,4個表達上調(diào),2個表達下調(diào),3個差異表達相反。這些蛋白主要參與光合作用、能量代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及防御反應(yīng)?？傊?本研究為探明花生青枯病抗性的分子機制提供了新的見解。2 .通過基因芯片技術(shù)在花生上比較篩選可能與青枯病抗性相關(guān)的基因。為了鑒定抗性有關(guān)的轉(zhuǎn)錄本的變化,本實驗根據(jù)花生全組織、花生生物和非生物脅迫的454測序結(jié)果整合Genebank±的EST序列合成了包含有101,344條unigenes的高密度的cDNAE片（RocheNimbleGen基因表達芯片），比較抗感青枯病品種接種青枯

4、菌后mRN瘟片雜交結(jié)果分析了兩個品種的表達譜差異，經(jīng)過t檢驗FDRC0.05,選才?log2>1或者log2<-1為差異基因，青枯菌侵染后，抗病品種粵油92有2,638個基因表達上調(diào),1,410個基因表達下調(diào),在感病品種新會小粒中,有1,551個基因表達上調(diào)，2,054個基因表達下調(diào)，通過5個差異基因的qRT-PCR僉證了芯片的可靠性。GOS釋和pathway分析顯示抗感品種中差異基因功能注釋的結(jié)果差異較大，參與的代謝途徑感病品種中參與的差異基因較多。一些與抗病相關(guān)的重要基因如NBS-LR瞇抗病基因、轉(zhuǎn)錄因子和激酶類基因在抗病品種上調(diào)的較多，而在感病品種中下調(diào)的較多,這些基因的差異

5、表達可能與青枯菌侵染花生后的防御應(yīng)答有關(guān),可能參與了花生的青枯病的抗性。3 .富含亮氨酸重復(fù)類受體蛋白激酶（LRR-RLKX有調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、參與抗逆反應(yīng)和防衛(wèi)反應(yīng)等生理功能。本研究通過基因芯片分析,獲得了一個受青枯菌誘導(dǎo)差異表達上調(diào)的LRR-RL軟抗病基因AhRLK1通過RACEJ術(shù)獲得了該基因的全長cDNAff列，該基因全長3,292bp,編碼992個氨基酸，對其結(jié)構(gòu)分析表明具有一段信號肽、一個胞外激酶區(qū)和9個LRR保守結(jié)構(gòu)域，農(nóng)桿菌滲入法注射煙草葉片對其亞細胞定位顯示35S:AhLK1-GFP融合蛋白定位于細胞膜上,通過熒光定量對其表達模式分析結(jié)果表明，AhRLK1在青枯菌侵染后在感青

6、枯病花生品種新會小粒持續(xù)上調(diào)表達,而在抗病品種粵油92中變化不大,SA、ABA、ET、JA、PAC敢素處理后能上調(diào)表達，在干旱和低溫處理中下調(diào)表達。該基因瞬間超表達本氏煙草葉片能引起HR反應(yīng)，構(gòu)建超量表達載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草CB-1,超表達AhRLKI明顯能夠增強對青枯菌的抗性。與對照相比,AhRLKI超量表達的轉(zhuǎn)基因煙草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtHPR3,NtHPR4,NtCHN50,NtPR1b,NtPR2,NtEFE26和NtAcs6都能夠明顯上調(diào)表達。推測AhRLKI可能參與花生對青枯菌的防御反應(yīng)，可能參與青枯菌侵染早期

7、對病原菌的識別，還參與了植物的非生物脅迫防御反應(yīng)。AhRLKI基因的獲得對于研究花生抗青枯病相關(guān)基因的結(jié)構(gòu)和功能以及青枯病抗病遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。4 .NBS-LR吐抗病基因是目前已知的植物抗病基因最大家族，在植物的抗病防御反應(yīng)中起著重要作用。本研究通過基因芯片分析,獲得了一個受青枯菌誘導(dǎo)上調(diào)表達的NBS-LRR®抗病基因AhRRS5通過RAC鼓術(shù)獲得了該基因的全長cDNAff列，該基因全長3,157bp,編碼943個氨基酸，對其結(jié)構(gòu)分析表明具有典型的NBS-LR瞇保守2構(gòu)域，基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥表皮實驗表明，35S:AhRRS5-GFP融合蛋白定位于細胞核中，熒光定量結(jié)果表明，AhRRS雕青枯菌侵染72h內(nèi)抗感花生品種中都能上調(diào)表達,在感病材料中表達上調(diào)的幅度較大,受SA、ABA、ET、JA、PAC敢素的上調(diào)表達，在干旱和低溫處理中也能上調(diào)表達。該基因瞬間超表達本氏煙草葉片能引起HR反應(yīng)，構(gòu)建超量表達載體農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化煙草CB-1,超表達AhRRS明顯能夠增強對青枯菌的抗性。與對照相比,AhRRS5®量表達的轉(zhuǎn)基因煙草在接種青枯菌后一系列防御反應(yīng)相關(guān)基因NtH1N1,NtHSR201,NtHSR515,NtPR1b,Ntla/c,Nt