動(dòng)物組織基因組的提取

1、實(shí)驗(yàn)一、動(dòng)物組織基因組DNA提取一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)原理二、實(shí)驗(yàn)原理1、核酸的分類、核酸的分類l DNA ( DNA (脫氧核糖核酸脫氧核糖核酸) ) 主要存在于細(xì)胞核的染色體中。主要存在于細(xì)胞核的染色體中。 核外也有少量核外也有少量DNADNA，如線粒體，如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠體），葉綠體DNADNA（cpDNAcpDNA），質(zhì)粒），質(zhì)粒DNADNA。l RNA RNA（核糖核酸）（核糖核酸） 存在于細(xì)胞質(zhì)中，如存在于細(xì)胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，外，還

2、有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬還有非細(xì)胞形式存在的病毒和噬 菌菌體，其或只含體，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。核酸的理化性質(zhì)核酸的理化性質(zhì)l在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在在細(xì)胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則l微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機(jī)溶劑l在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。lDNADNA溶液粘度很大，溶液粘度很大，RNARNA的粘度較小的粘度較小l在強(qiáng)大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來(lái)在強(qiáng)大離心力的作用下

3、，可以從溶液中沉降下來(lái)l分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則：2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則l核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求：核酸純化應(yīng)達(dá)到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑和過(guò)高和過(guò)高濃度的濃度的金屬離子金屬離子； 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度；其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。 應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子排除其它分子( (蛋白，脂類，多糖類蛋白，脂類，多糖類) )的污染。的污染。l核酸制備時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)核酸制備時(shí)應(yīng)注意

4、的事項(xiàng): : 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程。盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程。 減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解。 減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫減少物理因素對(duì)核酸的降解：機(jī)械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解：排除防止核酸的生物降解：排除核酸酶核酸酶。 排除其它核酸分子的污染，如提取排除其它核酸分子的污染，如提取DNADNA分子時(shí)，應(yīng)去除分子時(shí)，應(yīng)去除RNARNA，反之亦然。，反之亦然。 降低溫度，改變降低溫度，改變pHpH及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性及鹽的濃度，都利于對(duì)核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有

5、利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更好。幾個(gè)條件并用更好。 對(duì)于對(duì)于DNADNA，抑制，抑制DNaseDNase活力很容易，但防止機(jī)械張力活力很容易，但防止機(jī)械張力拉斷則更重要。拉斷則更重要。 對(duì)于對(duì)于RNARNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制制RNaseRNase活力較難，故在活力較難，故在RNARNA提取中設(shè)法抑制提取中設(shè)法抑制RNaseRNase更更重要。重要。核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 lDNase抑制抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，或檸檬

6、酸鈉，DNaseDNase基本可以全部失活?；究梢匀渴Щ?。 去垢劑、蛋白變性劑及去垢劑、蛋白變性劑及DNaseDNase抑制劑也可使抑制劑也可使DNaseDNase失活。失活。lRNase抑制抑制 操作要帶手套。操作要帶手套。 所有器皿要嚴(yán)格消毒，所有器皿要嚴(yán)格消毒， 試劑處理試劑處理 低溫操作低溫操作 在分離過(guò)程中要加入一定的在分離過(guò)程中要加入一定的RNase抑制劑。抑制劑。 常用的常用的RNA酶抑制劑酶抑制劑 焦磷酸二乙酯（焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制強(qiáng)烈、不徹底抑制強(qiáng)烈、不徹底 異硫氰酸胍異硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白有效抑制、分解核蛋白 氧釩核糖核苷復(fù)合物氧釩核糖核苷復(fù)合物 有

7、效抑制有效抑制 RNA酶的蛋白抑制劑（酶的蛋白抑制劑（RNasin） 有效抑制有效抑制 其它：其它：SDS、尿素、硅藻土等、尿素、硅藻土等 有效抑制有效抑制l核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用：去垢劑的作用： 1 1溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂； 2 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；來(lái)； 3 3對(duì)對(duì)RNa

8、se、DNase有一定的抑制作用。有一定的抑制作用。如：如：SDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-1.5-二磺酸鈉、二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉 作用：作用： 1. 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2. 2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3. 3.某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制某些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制 RNase活性和破裂細(xì)胞的作活性和破裂細(xì)胞的作用。用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、

9、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNase: :降解降解DNADNA RNase：降解：降解RNARNA 蛋白酶蛋白酶K K：降解蛋白質(zhì)：降解蛋白質(zhì) 溶菌酶溶菌酶：破碎細(xì)胞：破碎細(xì)胞 3. 核酸制備的一般步驟：核酸制備的一般步驟：I. I.材料準(zhǔn)備材料準(zhǔn)備II.II.破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放破碎細(xì)胞或包膜內(nèi)容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中1 1）破碎細(xì)胞）破碎細(xì)胞（防

10、止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動(dòng)物動(dòng)物：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。 細(xì)胞器細(xì)胞器DNADNA：首先純化細(xì)胞器。：首先純化細(xì)胞器。以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑以上處理時(shí)均要同時(shí)加入核酸酶抑制劑2 2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它首先使

11、脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離成分分離使核酸與蛋白質(zhì)分離使核酸與蛋白質(zhì)分離除去脂類除去脂類 多糖的除去多糖的除去 3 3）核酸的純化）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點(diǎn)除去其它核酸污染, ,并除去提取過(guò)程中的系列試劑并除去提取過(guò)程中的系列試劑( (鹽、有機(jī)溶劑等）鹽、有機(jī)溶劑等）雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 4 4）核酸樣品的保存）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質(zhì)介質(zhì) 溫度溫度： 4 4 樣品經(jīng)常使用樣品經(jīng)常使用 -70 -70是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存

12、是長(zhǎng)期保存的良好溫度，為一次性保存 -20 -20保存保存, ,避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融 保存介質(zhì)保存介質(zhì)： 滅菌水滅菌水 TETE緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) )： 10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0三、動(dòng)物基因組三、動(dòng)物基因組DNA的提取的提取主要方法：主要方法：(1)濃鹽法濃鹽法利用利用RNP和和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。1）用）用1M氯化鈉提取氯化鈉提取,得到的得到的DNP粘液粘液2)與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩與含有少量辛醇的氯仿一起搖蕩,使乳化使乳化3)離心除去蛋白質(zhì)離心除去蛋白質(zhì),此

13、時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相此時(shí)蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而中間，而DNA位于上層水相中位于上層水相中4)用用2倍體積倍體積95%乙醇可將乙醇可將DNA鈉鹽沉淀出來(lái)鈉鹽沉淀出來(lái).三、動(dòng)物基因組三、動(dòng)物基因組DNA的提取的提取（2）陰離子去污劑法）陰離子去污劑法:用用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性,可以直接從生物材料中可以直接從生物材料中提取提取DNA。由于細(xì)胞中由于細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,而陰離子而陰離子去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵去污劑能夠破壞這種價(jià)鍵,所以常用陰離子去污劑提取所以常用陰

14、離子去污劑提取DNA。三、動(dòng)物基因組三、動(dòng)物基因組DNA的提取的提取（3）苯酚抽提法）苯酚抽提法:苯酚作為蛋白變性劑苯酚作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了同時(shí)抑制了DNase的降解作用。的降解作用。用苯酚處理勻漿液時(shí)用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與由于蛋白與DNA連接鍵已斷連接鍵已斷,蛋白分子表面又蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含重復(fù)操作，再合并含DNA的水相。的水相。利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用

15、乙醇沉淀DNA。此法的特點(diǎn)是使提取。此法的特點(diǎn)是使提取的的DNA保持天然狀態(tài)保持天然狀態(tài)。DNA的提?。旱奶崛。罕椒映樘岱ǎㄔ噭┖校┍椒映樘岱ǎㄔ噭┖校?. 材料、設(shè)備及試劑材料、設(shè)備及試劑材料：材料：冷凍或新鮮豬肝組織冷凍或新鮮豬肝組織設(shè)備：設(shè)備：EP管、微量取液器管、微量取液器(20l,200l,1000l)，臺(tái)式高速臺(tái)式高速離心機(jī)，離心機(jī)，渦旋振蕩器渦旋振蕩器試劑：試劑：RNase ARNase A、Proteinase KProteinase K、Lysis Buffer Lysis Buffer 、Wash buffer Wash buffer A A、 Wash buffer B

16、Wash buffer B、TE bufferTE buffer。實(shí)驗(yàn)前：實(shí)驗(yàn)前：Wash buffer AWash buffer A中加入中加入18ml 18ml 無(wú)水乙醇，充分混勻；無(wú)水乙醇，充分混勻； Wash buffer B Wash buffer B中加入中加入64ml 64ml 無(wú)水乙醇，充分混勻無(wú)水乙醇，充分混勻1）樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理取新鮮動(dòng)物組織取新鮮動(dòng)物組織25-50mg（組織量不宜過(guò)多，否則容易（組織量不宜過(guò)多，否則容易導(dǎo)致裂解不完全而堵塞離心柱），組織剪碎或者切成小導(dǎo)致裂解不完全而堵塞離心柱），組織剪碎或者切成小塊，直接放入勻漿器中勻漿。塊，直接放入勻漿器中勻漿。2）

17、加入加入600l的的LysisBuffer，顛倒充分混勻。如需消，顛倒充分混勻。如需消化化RNA，可加入，可加入20lRNaseA，顛倒混勻，室溫放置，顛倒混勻，室溫放置5min。3）加入加入10lProteinaseK，混勻。，混勻。56水浴水浴45min-1h，其間顛倒混勻數(shù)次直到看到組織完全裂解，裂解完全的其間顛倒混勻數(shù)次直到看到組織完全裂解，裂解完全的標(biāo)準(zhǔn)為液體變得清亮及粘稠。（此步驟可以過(guò)夜處理）標(biāo)準(zhǔn)為液體變得清亮及粘稠。（此步驟可以過(guò)夜處理）2. 操作步驟操作步驟n4）12,000 rpm 12,000 rpm 離心離心10 min10 min，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管，將上清轉(zhuǎn)入新的

18、離心管中，加入中，加入800 l 800 l 無(wú)水乙醇，混勻。無(wú)水乙醇，混勻。n5）將液體轉(zhuǎn)入離心柱（一次加不完，可分次轉(zhuǎn)入），將液體轉(zhuǎn)入離心柱（一次加不完，可分次轉(zhuǎn)入），12,000 rpm 12,000 rpm 離心離心1min1min，棄廢液。，棄廢液。n6） 加入加入700 l Wash buffer A700 l Wash buffer A（使用前請(qǐng)先檢查是（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），否已加入無(wú)水乙醇），12,000 rpm 12,000 rpm 離心離心30 s -1 min30 s -1 min，棄廢液。棄廢液。n 7）加入加入700 l Wash buffer B（使

19、用前請(qǐng)先檢查是（使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇），否已加入無(wú)水乙醇）， 12,000 rpm 離心離心30 s -1 min，棄廢液。，棄廢液。8）加入加入500lWashbufferB，12,000rpm離心離心30s-1min，棄廢液。棄廢液。9）再次再次12,000rpm離心離心2min，將離心柱置于新的離心管，將離心柱置于新的離心管中，并打開離心柱蓋，于室溫或中，并打開離心柱蓋，于室溫或37恒溫箱放置恒溫箱放置510min，直至無(wú)明顯乙醇味。直至無(wú)明顯乙醇味。10）在硅基質(zhì)膜中央加入在硅基質(zhì)膜中央加入50-200lTEbuffer(事先預(yù)熱事先預(yù)熱55-65)，置于室溫，置于室溫2-

20、5min，12,000rpm離心離心30s。11）離心得到的溶液再次加入離心柱中，室溫放置離心得到的溶液再次加入離心柱中，室溫放置2min，12,000rpm離心離心2min。所得的溶液為純化后的基因組。所得的溶液為純化后的基因組DNA。稱取肝臟稱取肝臟0.5g冰冷的生理鹽水清洗（冰冷的生理鹽水清洗（3次）次）剪碎剪碎5 5mlml生理鹽水生理鹽水勻漿勻漿各組取各組取1/1/1010組組織細(xì)胞液織細(xì)胞液移至移至1.5ml離心管離心管加加600ulLysis BufferLysis Buffer加加20ulRNase ARNase A顛倒混勻，顛倒混勻，放置放置5min加加10ulProtein

21、ase KProteinase K混勻混勻5656水浴，水浴，45min45min顛倒混勻數(shù)次顛倒混勻數(shù)次至液體變清亮至液體變清亮及粘稠及粘稠12000rpm12000rpm，10min10min離心離心取上清轉(zhuǎn)入新離心管取上清轉(zhuǎn)入新離心管加加800ul無(wú)水乙醇無(wú)水乙醇混勻混勻轉(zhuǎn)入離心柱轉(zhuǎn)入離心柱可分次轉(zhuǎn)入可分次轉(zhuǎn)入12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液，加入棄廢液，加入700ul Wash buffer AWash buffer A12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液，加入棄廢液，加入700ul Wash buffer BWash buf

22、fer B12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液，加入棄廢液，加入500ul Wash buffer BWash buffer B12000rpm12000rpm，1min1min離心離心棄廢液棄廢液12000rpm12000rpm，2min2min離心離心將離心柱置新離心管中，將離心柱置新離心管中，開離心柱蓋，放置開離心柱蓋，放置5min柱膜中央加柱膜中央加100ul65預(yù)熱的預(yù)熱的TE buffer放置放置3min12000rpm12000rpm，30sec30sec離心離心取離心后所得溶液再加入取離心后所得溶液再加入離心柱中，放置離心柱中，放置2min12000

23、rpm12000rpm，2min2min離心離心收集離心后所得溶液，即為純化后基因組收集離心后所得溶液，即為純化后基因組DNA 最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融反復(fù)凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNADNA時(shí)，要選擇有核細(xì)胞時(shí)，要選擇有核細(xì)胞（白細(xì)胞）（白細(xì)胞） 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，否則會(huì)造成DNADNA降降解解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量較少，提取前先含量較少，提取前先富集富集 材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，導(dǎo)致DNADNA量量少，純度低少，純度低 針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：針對(duì)不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨動(dòng)物組織勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞蛋白酶組培細(xì)胞蛋白酶K K細(xì)菌溶菌酶破壁細(xì)菌溶菌酶破壁 高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕柔振蕩 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DN