細(xì)胞凍存與復(fù)蘇

1、暨暨 南南 大大 學(xué)學(xué) 醫(yī)醫(yī) 學(xué)學(xué) 院院生物化學(xué)教研室生物化學(xué)教研室費(fèi)費(fèi) 嘉嘉細(xì)胞復(fù)蘇與凍存細(xì)胞復(fù)蘇與凍存 一、細(xì)胞凍存一、細(xì)胞凍存在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)、外在不加任何條件下直接凍存細(xì)胞時，細(xì)胞內(nèi)、外環(huán)境中的水都會形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械環(huán)境中的水都會形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、pHpH改變、改變、蛋白變性等，引起細(xì)胞死亡。蛋白變性等，引起細(xì)胞死亡。在培養(yǎng)液中加入在培養(yǎng)液中加入保護(hù)劑保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在

2、凍結(jié)前透出細(xì)胞。胞。目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSODMSO）。）。DMSODMSO的常用濃度為的常用濃度為5%-10%5%-10%。添加添加DMSODMSO保護(hù)劑的細(xì)胞在液氮中凍存保護(hù)劑的細(xì)胞在液氮中凍存1-21-2年，年，存活率可達(dá)存活率可達(dá)80%-90%80%-90%。DMSODMSO液需預(yù)先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配液需預(yù)先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。試劑和器材試劑和器材器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶，存管或安瓿瓶，2 ml2 ml）、離心管、吸管、）、離心管、吸管、

3、離心機(jī)等離心機(jī)等試劑：含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）試劑：含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液） 操作步驟：操作步驟： 1 1、消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。、消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液。2 2、離心，、離心，1000 rpm 10 min1000 rpm 10 min，棄上清液。，棄上清液。3 3、沉淀加凍存液，計數(shù)，調(diào)整至、沉淀加凍存液，計數(shù)，調(diào)整至5 510106 6/ml/ml左右。左右。4 4、將懸液分至凍存管中，每管、將懸液分至凍存管中，每管1 ml1 ml。5 5、封口、封口6 6、標(biāo)注、標(biāo)注 標(biāo)明細(xì)胞種類、凍存日期。標(biāo)明細(xì)胞種類、凍存日期。 7 7、梯度降溫：室溫、梯度降溫：室溫 4 4（2020分

4、鐘）分鐘）冰箱冷冰箱冷凍室（凍室（3030分鐘）分鐘） 低溫冰箱（低溫冰箱（30 130 1小時）小時） 氣態(tài)氮（氣態(tài)氮（3030分鐘）分鐘） 液氮液氮注：本室降溫程序：室溫注：本室降溫程序：室溫 4 30 4 30分鐘分鐘 冰冰水中水中 1010分鐘分鐘 20 3020 30分鐘分鐘 80 80 過過夜夜 液氮液氮 注意事項：注意事項：1 1、凍存細(xì)胞的活力、凍存細(xì)胞的活力 95%95%以上以上2 2、避免凍傷、避免凍傷3 3、避免液氮揮發(fā)干凈、避免液氮揮發(fā)干凈4 4、新復(fù)蘇的細(xì)胞在、新復(fù)蘇的細(xì)胞在7272小時里最好不要更換小時里最好不要更換培養(yǎng)基，或傳代。培養(yǎng)基，或傳代。5 5、 新引進(jìn)的

5、細(xì)胞株，應(yīng)首先做好凍存?zhèn)溆?。新引進(jìn)的細(xì)胞株，應(yīng)首先做好凍存?zhèn)溆?。二、?xì)胞復(fù)蘇二、細(xì)胞復(fù)蘇 復(fù)蘇原則：速融 - 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇以急速融化為原則，使培養(yǎng)物能快速通過對細(xì)胞有損害的-50攝氏度區(qū)域，細(xì)胞仍能生長，活力受損不大。操作步驟操作步驟: :一、準(zhǔn)備工作 1、 37水浴 2、準(zhǔn)備一個內(nèi)裝5-10 ml 細(xì)胞完全培養(yǎng)基離心管，溫度 = 25 。二、復(fù)蘇1、從液氮中取出凍存管、迅速置于37水浴中，1分鐘。2、打開凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。3、1000rpm離心10 min，棄去上清液。4、沉淀中加入適當(dāng)培養(yǎng)基，37常規(guī)培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。細(xì)胞復(fù)蘇注意事項細(xì)胞復(fù)蘇注意事項 防止凍存管在水浴中融化時爆炸 - 遠(yuǎn)離 - 勿拆除包裝布袋，佩戴防護(hù)眼鏡、口罩。 快速融化，并迅速去除凍存液。 五、細(xì)胞運(yùn)輸五、細(xì)胞運(yùn)輸 1.長距離運(yùn)輸（幾天） 2.短距離運(yùn)輸（幾小時） 3.細(xì)胞懸液空運(yùn) 4.液氮凍存運(yùn)輸四、血清滅活四、血清滅活 目的：去除血清中的補(bǔ)體成分，避免補(bǔ)體對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用 。 方法：56 30 min 注意事項：血清溶解過程中必