小麥葉片生理指標(biāo)測(cè)定

1、小麥葉片生理指標(biāo)測(cè)定一i、種子處理：1、0.1%氯化汞浸泡小麥種子30分鐘，進(jìn)行消毒，小麥種子放在較大的培養(yǎng)皿中2、將氯化汞倒入廢液瓶，注意必須戴兩層手套，因?yàn)槁然瘎《荆矣猛甑氖痔撞荒芘鰧?shí)驗(yàn)室里其它的任何東西，以防污染，最好把用完的手套放到DNA顯色室中的廢手套收集桶里；3、然后用無(wú)菌蒸儲(chǔ)水沖洗3遍以上4、最后用倒入適量無(wú)菌水（稍微讓水浸沒(méi)種子表面）進(jìn)行種子萌發(fā)，每天換次新水。二、小麥培養(yǎng)1、在種子發(fā)芽以后，在芽長(zhǎng)1cm左右的時(shí)候，將種子放入用網(wǎng)縫好的塑料泡沫上，然后放入裝有自來(lái)水的培養(yǎng)盒中2、大概三天左右的時(shí)間，將水倒掉，換上1/2hoagland營(yíng)養(yǎng)液（配方見下面的附件），每三天換一次

2、營(yíng)養(yǎng)液。三、小麥處理及指標(biāo)測(cè)定1、小麥培養(yǎng)兩周后，在兩葉一心期，用適當(dāng)PEG6000濃度的1/2hoagland營(yíng)養(yǎng)液換掉原營(yíng)養(yǎng)液，各設(shè)一個(gè)對(duì)照（即沒(méi)加PEG6000的1/2hoagland營(yíng)養(yǎng)液）2、每隔24h取一次樣，在72h后復(fù)水（即將PEG6000溶液倒掉，換成新配的1/2hoagland營(yíng)養(yǎng)液）四、生理指標(biāo)測(cè)定1、相對(duì)含水量測(cè)定1,鮮重測(cè)定迅速剪取植物材料，裝入已知重量的容器（或塑料袋）中，帶入室內(nèi)，用分析天平稱取鮮重（FW）o2,飽和鮮重測(cè)定將稱過(guò)鮮重的植物材料浸入水中，數(shù)小時(shí)后取出，用吸水紙吸干表面水分，立即稱重；再次將材料放入水中浸泡一段時(shí)間后，再次取出，吸干表面水分，稱鮮重，

3、直到兩次稱重的結(jié)果基本相等，最后的結(jié)果即為飽和鮮重（SFW）。若事先已知達(dá)到水分飽和所用的時(shí)間，則可一次取得飽和鮮重的測(cè)量定值。3.干重測(cè)定提前把烘箱打開，溫度升至120Co把稱過(guò)鮮重的植物材料裝入紙袋中，放入烘箱內(nèi)，120C殺青10min,然后把烘箱的溫度降到70c左右，烘至恒重。取出紙袋和材料，放入干燥器中冷卻至室溫，稱干重（DW）。4,取得以上數(shù)據(jù)后，按公式相對(duì)含水量。相對(duì)含水量=FW-DW/SFW-DW2、MD給量測(cè)定一、目的通過(guò)實(shí)驗(yàn)，掌握植物體內(nèi)丙二醛含量測(cè)定的原理及方法。二、原理丙二醛（MDA是由于植物官衰老或在逆境條件下受傷害，其組織或器官膜脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的。它的含量與

4、植物衰老及逆境傷害有密切關(guān)系。測(cè)定植物體內(nèi)丙二醛含量，通常利用硫代巴比妥酸（TBA）在酸性條件下加熱與組織中的丙二醛產(chǎn)生顯色反應(yīng)，生成紅棕色的三甲川（3、5、5三甲基惡陛2、4二酮），三甲川最大的吸收波長(zhǎng)在532ns但是測(cè)定植物組織中MDA寸受多種物質(zhì)的干擾，其中最主要的是可溶性糖，糖與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)在450nm處，在532nm處也有吸收。植物遭受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫時(shí)可溶性糖增加，因此測(cè)定植物組織中丙二醛與硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物含量時(shí)一定要排除可溶性糖的干擾。此外在532nm波長(zhǎng)處尚有非特異的背景吸收的影響也要加以排除。低濃度的鐵離子能顯著增加硫代巴比妥酸與蔗糖或

5、丙二醛顯色反應(yīng)物在532、450nm處的吸光度值，所以在蔗糖、丙二醛與硫代巴比妥酸顯色反應(yīng)中需要有一定的鐵離子，通常植物組織中鐵離子的含量為100300科gg-Dw根據(jù)植物樣品量和提取液的體積，加入Fe3+的終濃度為0.5nmolL-。在532nm600nm和450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，即可計(jì)算出丙二醛含量。三、材料、儀器設(shè)備及試劑1 .材料：植物葉片。2 .儀器設(shè)備：離心機(jī)，分光光度計(jì)；電子分析天平；恒溫水??；研缽；試管；移液管（1ml、5ml）、試管架；移液管架；洗耳球；剪刀。3 .試齊I：10%三氯乙酸；0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液：石英砂。四、實(shí)驗(yàn)步驟1 .丙二醛的提取稱取受干

6、旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片1g,加入少量石英砂和10%三氯乙酸2ml,研磨至勻漿，再加8m110%三氯乙酸進(jìn)一步研磨，勻漿以4000r/min離心10min,其上清液為丙二醛提取液。2 .顯色反應(yīng)及測(cè)定取4支干凈試管，編號(hào)，3支為樣品管(三個(gè)重復(fù))，各加入提取液2ml,對(duì)照管加蒸儲(chǔ)水2ml,然后各管再加入2ml0.6%硫代巴比妥酸溶液。搖勻，混合液在沸水浴中反應(yīng)15min,迅速冷卻后再離心。取上清液分別在532、600和450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)值。五、丙二醛含量計(jì)算：由于蔗糖TBA反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)為450nm,毫摩爾吸U攵系數(shù)為85.4X103,MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在5

7、32nm的毫摩爾吸收系數(shù)分別是7.4X10-3和155X103O532nm非特異性吸光值可以600nm波長(zhǎng)處的吸光值代表。按雙組分分光光度法原理，建立方程組，解此方程組即可求出MD根可溶性糖濃度。方程組：-3.A450二(85.4X10)-C糖3.-3.(A532備00)=(155X10)-Omda-(7.4X10)-C糖解得：A450C糖二=11.71A450(mmol-L1)-385.4X101、OMd=6.45(A532A500)一0.56A450-(mol，L)公式中：450在450nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值A(chǔ)32一在532nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值A(chǔ)。一在600nm波長(zhǎng)下測(cè)得的吸光度值*

8、1.55x105為摩爾比吸收系數(shù)C糖、Omd價(jià)別是反應(yīng)混合液中可溶性糖、MD掰濃度。1 .按下式計(jì)算提取液中MD腐度反應(yīng)液體積(ml)O/idaX1000提取液中MDAB度(Wmolml1)=測(cè)定時(shí)提取液用量(ml)2 .按下式計(jì)算樣品中MD給量提取液中MD醉度(mol-ml1)X提取液總量(ml)MD給量(mol-g1Fw)=植物組織鮮重(g)附：hoagland營(yíng)養(yǎng)液配方改良霍格蘭配方：四水硝酸鈣945mg/L硝酸鉀506mg/L硝酸俊80mg/L磷酸二氫鉀136mg/L硫酸鎂493mg/L鐵鹽溶液2.5ml微量元素液5mlpH=6.0鐵鹽溶液：七水硫酸亞鐵2.78g乙二胺四乙酸二鈉（EDTA.Na）3.73g蒸儲(chǔ)水500mlpH=5.5微量元素液：碘化鉀0.83mg/l硼酸6.2mg/L硫酸鎰22.3mg/L硫酸鋅8.6mg/L鋁酸