半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)PPT課件

1、半抗原與蛋白質(zhì)偶聯(lián)技術(shù)目錄抗原與半抗原偶聯(lián)蛋白人工抗原合成的方法影響人工抗原質(zhì)量的因素人工抗原的質(zhì)量評(píng)定抗原與半抗原抗原抗原抗原 能與淋巴細(xì)胞抗原受體（能與淋巴細(xì)胞抗原受體（TCR/BCR）特異性結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)特異性結(jié)合，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，并與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（指抗體或致答，并與相應(yīng)免疫應(yīng)答產(chǎn)物（指抗體或致敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)、外發(fā)生特異性結(jié)合敏淋巴細(xì)胞）在體內(nèi)、外發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)的物質(zhì)。反應(yīng)的物質(zhì)。抗原的分類天然抗原天然抗原 如：細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等。如：細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲等。人工抗原人工抗原 如：人工結(jié)合抗原、人工合成抗原、如：人工結(jié)合抗原、人工合成抗

2、原、 基因工程抗原基因工程抗原常見的天然抗原-細(xì)菌常見的天然抗原-病毒常見的其他天然抗原 常見的其他天然抗原 異種動(dòng)物血清異種動(dòng)物血清 異嗜性抗原異嗜性抗原 血型抗原血型抗原 主要組織相容性抗原主要組織相容性抗原 腫瘤抗原腫瘤抗原超抗原超抗原人工抗原人工抗原 人工結(jié)合抗原人工結(jié)合抗原 將無免疫原性的簡單將無免疫原性的簡單化學(xué)基團(tuán)化學(xué)基團(tuán)與與蛋白質(zhì)載體蛋白質(zhì)載體偶聯(lián)，或?qū)o免疫原性的有機(jī)偶聯(lián)，或?qū)o免疫原性的有機(jī)分子與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，形成分子與蛋白質(zhì)載體結(jié)合，形成載體載體- -半抗原半抗原結(jié)合物結(jié)合物，均屬人，均屬人工結(jié)合抗原工結(jié)合抗原。 人工抗原人工抗原 人工合成抗原人工合成抗原 用化學(xué)方法將

3、用化學(xué)方法將活化氨基酸活化氨基酸聚合，聚合，使之成為使之成為合成多肽合成多肽。（應(yīng)用這種人工合成。（應(yīng)用這種人工合成多肽可研究氨基酸多肽可研究氨基酸種類、序列種類、序列與蛋白質(zhì)抗與蛋白質(zhì)抗原性及免疫原性的關(guān)系。）原性及免疫原性的關(guān)系。） 人工抗原人工抗原基因工程抗原基因工程抗原通過基因重組、再表達(dá)制備的抗原物質(zhì)。通過基因重組、再表達(dá)制備的抗原物質(zhì)。如：目的基因（如：目的基因（編碼編碼抗原）抗原）+ + 載體（質(zhì)粒等）載體（質(zhì)粒等） 重組重組DNA DNA 細(xì)胞（真核或原核）細(xì)胞（真核或原核） 表表達(dá)達(dá) 純化純化 基因工程疫苗基因工程疫苗抗原的性質(zhì)1.1.免疫原性：免疫原性： 抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特

4、異性抗原刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答，誘生相應(yīng)誘生相應(yīng)抗體抗體和和效應(yīng)淋巴細(xì)胞效應(yīng)淋巴細(xì)胞的能力。的能力。2.2.抗原性抗原性: : 抗原可在體內(nèi)、外與相應(yīng)的抗體抗原可在體內(nèi)、外與相應(yīng)的抗體/ /效應(yīng)效應(yīng)淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，產(chǎn)生免疫應(yīng)答免疫應(yīng)答的特性。的特性。抗原抗原（按照免疫原性及免疫反應(yīng)性）（按照免疫原性及免疫反應(yīng)性）分類1 1、完全抗原、完全抗原 : : 既有免疫原性又有抗原性的既有免疫原性又有抗原性的物質(zhì)，如多數(shù)蛋白質(zhì)分子。物質(zhì)，如多數(shù)蛋白質(zhì)分子。2 2、半抗原、半抗原: :又稱不完全抗原，單獨(dú)存在時(shí)只又稱不完全抗原，單獨(dú)存在時(shí)只具有抗原性而無免疫

5、原性的物質(zhì)，如二硝具有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)，如二硝基酚、青霉素。基酚、青霉素。完全抗原半抗原與載體結(jié)合后可使其具有免疫原性。半抗原與載體結(jié)合后可使其具有免疫原性。半抗原半抗原+ +載體載體 完全抗原完全抗原 BTBBBT常見的偶聯(lián)蛋白常見的偶聯(lián)蛋白常用來作為合成人工抗原的載體蛋白質(zhì)有：常用來作為合成人工抗原的載體蛋白質(zhì)有： 牛血清白蛋白牛血清白蛋白(BSA)(BSA)、 卵清蛋白卵清蛋白(OA)(OA)、 鑰孔血藍(lán)蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)(KLH)、 人血清白蛋白人血清白蛋白(HSA)(HSA) 人工合成的多聚賴氨酸人工合成的多聚賴氨酸(PLL)(PLL)等。等。 常見的偶聯(lián)蛋白牛血清白

6、蛋白牛血清白蛋白（BSABSA）包含包含583583個(gè)氨基酸殘基，個(gè)氨基酸殘基，分子量為分子量為66.43kDa66.43kDa，等電點(diǎn)為等電點(diǎn)為4.74.7。 BSABSA結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)常見的偶聯(lián)蛋白卵清蛋卵清蛋ovalbvminovalbvmin 是一種糖蛋白。是一種糖蛋白。含有微量的磷。含有微量的磷。 是卵清中蛋白質(zhì)是卵清中蛋白質(zhì)的主要成分，約的主要成分，約占占6565。 雞的卵清蛋白分雞的卵清蛋白分子量約子量約45kDa45kDa。a.牛血清白蛋白b.磷酸酪氨酸血清白蛋白c.卵清蛋白d.磷酸酪氨酸卵清蛋白常見的偶聯(lián)蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)(KLH)由于由于KLHKLH質(zhì)量大，質(zhì)

7、量大，復(fù)雜性高，與其他載復(fù)雜性高，與其他載體蛋白相比體蛋白相比KLHKLH會(huì)引起會(huì)引起更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。更強(qiáng)的免疫應(yīng)答。來源于軟體動(dòng)物，來源于軟體動(dòng)物，它在系統(tǒng)發(fā)生上遠(yuǎn)離它在系統(tǒng)發(fā)生上遠(yuǎn)離哺乳動(dòng)物物種，在測(cè)哺乳動(dòng)物物種，在測(cè)定過程中產(chǎn)生會(huì)與定過程中產(chǎn)生會(huì)與典典型靶點(diǎn)型靶點(diǎn)樣品發(fā)生交叉樣品發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體的可能性反應(yīng)的抗體的可能性較小。較小。常見的偶聯(lián)蛋白 人血清白蛋白人血清白蛋白（簡稱（簡稱HSAHSA），是），是人血漿中的蛋白人血漿中的蛋白質(zhì)，其非糖基化質(zhì)，其非糖基化的單鏈多肽包含的單鏈多肽包含585585個(gè)氨基酸，分個(gè)氨基酸，分子量為子量為66kD66kD。在。在血漿中其濃度為血漿中其濃度

8、為42g/L42g/L，約占血漿，約占血漿總蛋白的總蛋白的60%60%。常見的偶聯(lián)蛋白 -多聚賴氨酸是多聚賴氨酸是目前天然防腐劑中目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能具有優(yōu)良防腐性能的微生物類食品防的微生物類食品防腐劑。它是由腐劑。它是由2530賴氨酸殘基聚合賴氨酸殘基聚合而成，具有強(qiáng)烈的而成，具有強(qiáng)烈的抑菌能力，可以作抑菌能力，可以作為防腐劑用于食品為防腐劑用于食品的保鮮。的保鮮。 偶聯(lián)蛋白的性質(zhì) 載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有載體表面應(yīng)首先應(yīng)具有化學(xué)活性基團(tuán)化學(xué)活性基團(tuán)，這些基團(tuán)可以直接與抗生素或農(nóng)藥分子偶這些基團(tuán)可以直接與抗生素或農(nóng)藥分子偶聯(lián)，這是化學(xué)偶聯(lián)制備抗原的前提；聯(lián)，這是化學(xué)偶聯(lián)制備抗原的前提

9、； 其次，載體應(yīng)具備一定的容量，可以其次，載體應(yīng)具備一定的容量，可以偶聯(lián)足夠的分子；偶聯(lián)足夠的分子； 載體還應(yīng)該是惰性的，不應(yīng)干擾偶聯(lián)載體還應(yīng)該是惰性的，不應(yīng)干擾偶聯(lián)分子的功能；分子的功能； 而且載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性，且應(yīng)而且載體應(yīng)具有足夠的穩(wěn)定性，且應(yīng)該是廉價(jià)易得的。該是廉價(jià)易得的。人工抗原合成方法人工抗原合成方法 小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)效果會(huì)小分子半抗原與載體蛋白偶聯(lián)效果會(huì)受到受到偶聯(lián)物偶聯(lián)物的的濃度濃度及其及其相對(duì)比例相對(duì)比例、偶聯(lián)劑偶聯(lián)劑的的有效濃度有效濃度及其及其相對(duì)量相對(duì)量、緩沖液緩沖液成分成分及其及其純度純度和和離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度、pHpH以及以及半抗原半抗原的的穩(wěn)定性穩(wěn)定性

10、、可溶性可溶性和和理化特性理化特性等因素的影響。等因素的影響。 一般是由一般是由半抗原半抗原上的上的活性基團(tuán)活性基團(tuán)決定偶決定偶聯(lián)合成的方法。聯(lián)合成的方法。半抗原上的活性基團(tuán)半抗原上的活性基團(tuán)人工抗原合成方法人工抗原合成方法1 1、分子中含有、分子中含有羧基羧基或者或者可羧化可羧化的半抗原的偶的半抗原的偶聯(lián)聯(lián)A A、混合酸酐法、混合酸酐法 。B B、碳化二亞胺法。、碳化二亞胺法。C C、N-N-羥琥珀酰亞胺酯法羥琥珀酰亞胺酯法 混合酸酐法交聯(lián)原理混合酸酐法交聯(lián)原理混合酸酐法交聯(lián)原理混合酸酐法交聯(lián)原理碳化二亞胺法交聯(lián)原理碳化二亞胺法交聯(lián)原理碳化二亞胺法交聯(lián)原理碳化二亞胺法交聯(lián)原理碳化二亞胺法交聯(lián)

11、原理碳化二亞胺法交聯(lián)原理人工抗原合成方法2 2、含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)、含有氨基或可還原硝基半抗原的偶聯(lián)l 1 1）戊二醛法：雙功能試劑戊二醛的兩個(gè)醛基分別）戊二醛法：雙功能試劑戊二醛的兩個(gè)醛基分別與半抗原和蛋白質(zhì)上的氨基形成與半抗原和蛋白質(zhì)上的氨基形成schiffschiff鍵鍵(-N=C(-N=C，在半抗原和蛋白質(zhì)間引入一個(gè)在半抗原和蛋白質(zhì)間引入一個(gè)5 5碳橋。這一反應(yīng)條碳橋。這一反應(yīng)條件溫和，可在件溫和，可在4 44040及及pH6.0pH6.08.08.0內(nèi)進(jìn)行，操作內(nèi)進(jìn)行，操作亦簡便，因此應(yīng)用廣泛。亦簡便，因此應(yīng)用廣泛。l 2 2）重氮化法：用于活性基團(tuán)是）重氮化法：用于活

12、性基團(tuán)是芳香胺基芳香胺基的半抗原，的半抗原，芳香胺基與芳香胺基與NaNO2NaNO2和和HClHCl反應(yīng)得到一個(gè)重氮鹽，它反應(yīng)得到一個(gè)重氮鹽，它可直接接到蛋白質(zhì)可直接接到蛋白質(zhì)酪氨酸羧基的鄰位上酪氨酸羧基的鄰位上，形成一，形成一個(gè)偶氮化合物。個(gè)偶氮化合物。戊二醛法合成人工抗原的原理戊二醛法合成人工抗原的原理鹽酸克倫特羅重氮化反應(yīng)原理鹽酸克倫特羅重氮化反應(yīng)原理人工抗原合成方法3 3、含羥基半抗原的偶聯(lián)、含羥基半抗原的偶聯(lián)l1 1）琥珀酸酐法；）琥珀酸酐法；l2 2）羰基二咪唑法。）羰基二咪唑法。人工抗原合成方法4、含巰基半抗原的偶聯(lián) 1)馬來酰亞胺法。 2) 將載體蛋白與半抗原在pH4.0的醋酸

13、緩沖液中，通過過氧化氫的作用形成二硫鍵，也可以將半抗原連接到蛋白質(zhì)分子上。影響人工抗原質(zhì)量的因素影響人工抗原質(zhì)量的因素 偶聯(lián)比 過去人們認(rèn)為，聯(lián)接到蛋白質(zhì)分子上的半抗原數(shù)目要盡可能多。但實(shí)驗(yàn)證明，過多的半抗原并不能得到預(yù)期的結(jié)果，這是因?yàn)檩d體上覆蓋的半抗原分子過多時(shí)，可能不利于載體與淋巴細(xì)胞表面結(jié)合，不能使載體引起免疫反應(yīng)。 研究發(fā)現(xiàn)各種載體的分子量不論是否接近，最佳結(jié)合比都不盡相同，并建議為了取得最佳免疫效果，應(yīng)逐個(gè)確定各種載體的最佳結(jié)合比。影響人工抗原質(zhì)量的因素偶聯(lián)橋有研究者認(rèn)為，一定長度的手臂的介入，有助于半抗原暴露在外面，利于所產(chǎn)生抗體專一性的增強(qiáng)但也有一些研究者發(fā)現(xiàn)，手臂結(jié)構(gòu)對(duì)免疫檢

14、測(cè)經(jīng)常有不利的影響，有時(shí)產(chǎn)生的抗體對(duì)手臂結(jié)構(gòu)親和力特別強(qiáng)，對(duì)待測(cè)小分子親和力卻很弱，因此造成對(duì)特異性抗體檢測(cè)的干擾。 可以采取兩種方法來避免因偶聯(lián)橋而造成的不足：一是半抗原上相同位點(diǎn)結(jié)合蛋白質(zhì)，但免疫原和包被抗原用不同的偶聯(lián)橋；二是免疫原和包被抗原用相同的偶聯(lián)橋，但與不同半抗原位點(diǎn)結(jié)合。最好的偶聯(lián)橋是36個(gè)直鏈的碳原子結(jié)構(gòu)。影響人工抗原質(zhì)量的因素半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)用來作半抗原的分子最好有分支結(jié)構(gòu)，直鏈分子難以產(chǎn)生抗體。此外，有些抗生素或農(nóng)藥有多個(gè)可供蛋白質(zhì)偶聯(lián)的位點(diǎn)，但據(jù)研究報(bào)道，不同位點(diǎn)與蛋白質(zhì)結(jié)合制備的人工抗原產(chǎn)生的抗體效價(jià)及親合力都有差別，這可能是因?yàn)椴煌稽c(diǎn)結(jié)合導(dǎo)致半抗原呈現(xiàn)的空間結(jié)

15、構(gòu)不一樣的原因。因此，如果一個(gè)分子內(nèi)有多個(gè)不同的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，最好盡可能利用不同位點(diǎn)都合成出人工抗原，然后，通過比較，篩選出最好的人工抗原用于制備抗體作為檢測(cè)。半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)半抗原的分子空間結(jié)構(gòu)人工抗原的質(zhì)量評(píng)定人工抗原的質(zhì)量評(píng)定合成成功鑒定鑒定農(nóng)藥人工抗原最常用的方法是紫外光譜掃描法，如果人工抗原的紫外吸收?qǐng)D譜不同于原載體蛋白和半抗原的紫外掃描圖譜，則可初步證明人工抗原合成成功。紫外分光光度法測(cè)定人工抗原偶聯(lián)質(zhì)量紫外分光光度法測(cè)定人工抗原偶聯(lián)質(zhì)量人工抗原的質(zhì)量評(píng)定濃度測(cè)定人工抗原的絕對(duì)含量常以蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度表示（如每ml抗原溶液中含有蛋白質(zhì)多少mg）。因此測(cè)定人工抗

16、原的濃度與測(cè)定人工抗原溶液中蛋白質(zhì)的相對(duì)含量（mg/ml）是一致的。常用的方法有紫外吸收法、Folin-酚法、雙縮脲法、微量凱式定量法、染色結(jié)合法和熒光法等。人工抗原的質(zhì)量評(píng)定純度鑒定 利用吸附與分配層析和利用吸附與分配層析和電泳技術(shù)電泳技術(shù)可鑒可鑒定人工抗原的偶聯(lián)的純度。如果電泳圖譜定人工抗原的偶聯(lián)的純度。如果電泳圖譜上只出現(xiàn)一條電泳帶，則表明人工抗原達(dá)上只出現(xiàn)一條電泳帶，則表明人工抗原達(dá)到電泳純，否則說明人工抗原中含有未偶到電泳純，否則說明人工抗原中含有未偶聯(lián)的物質(zhì)。聯(lián)的物質(zhì)。利用電泳技術(shù)鑒定人工抗原偶聯(lián)的純度利用電泳技術(shù)鑒定人工抗原偶聯(lián)的純度人工抗原的質(zhì)量評(píng)定偶聯(lián)比的測(cè)定分光光度法如果半抗原的紫外最大吸收大于220nm(蛋白質(zhì)在220nm以下會(huì)產(chǎn)生肽的強(qiáng)紫外吸收，如果半抗原的紫外最大吸收少于220nm，則與蛋白質(zhì)肽的吸收發(fā)生重疊)，則可根據(jù)蛋白質(zhì)及其半抗原特定的吸收峰的光密度值和各自的摩爾消光系數(shù)，計(jì)算出結(jié)合到每個(gè)蛋白質(zhì)分子上的半抗原分子數(shù)偶聯(lián)比例的計(jì)算偶聯(lián)比例的計(jì)算（以（以