酵母雙雜交試驗步驟

1、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)簡介一、LexA酵母雙雜交系統(tǒng)的設計原理報告質(zhì)粒p8op-LacZ的GAL4UAS編碼序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活劑的情況下，報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄活性為零，該基因的篩選標志為URA3,可以作為有自主復制能力的質(zhì)粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因組DNA上。質(zhì)粒pLexA的篩選標志為HIS3,在雙雜交系統(tǒng)中用于表達DNA-BD（202個氨基酸殘基組成的LexA蛋白）與目標蛋白（釣餌，Bait）的融合蛋白，該融合體的表達受酵母強啟動子ADH1的調(diào)控，選擇與報告基因的操縱子LexAX8結(jié)合。質(zhì)粒pB42AD的篩選標志為TRP1，在其供外源

2、基因插入的多克隆位點（EcoRI與XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（來自于E.coli的88個氨基酸殘基組成的B42蛋白）等幾種編碼序列，共同組成可以啟動報告基因轉(zhuǎn)錄表達的激活成份。在酵母EGY48的基因組中還整合有另一個報告基因Leu,它與LacZ報告基因具有相同的操縱子-LexA,但兩者啟動子不同。根據(jù)雙雜交系統(tǒng)的原理，如果某一復合物同時具有DNA-BD和AD的活性，即可激活報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達。分別將待測蛋白X、Y的編碼序列插入pLexA質(zhì)粒載體和pB42AD質(zhì)粒載體的多克隆位點中，然后共同轉(zhuǎn)入含有報告基因的酵母菌

3、株，如果蛋白X與Y能相互作用，則啟動報告基因的轉(zhuǎn)錄和表達，通過檢測報告基因的表達情況，就可以間接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的強弱。如果將蛋白Y換為取自組織或血液的cDNA文庫，則可用X從該文庫中篩選出能與其相互作用的蛋白，并且可以獲得編碼這些蛋白的cDNA。二、商品化酵母雙雜交系統(tǒng)的組成1 .載體質(zhì)粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文庫2 .酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侶菌株）3 .大腸桿菌菌株：E.coliKC8株4 .對照質(zhì)粒：質(zhì)粒用途pLexA-53,pB42AD-T陽性對照pLexA

4、-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白陽性對照pLexA-Lam（LaminC蛋白少與其它蛋白相互作用）假陽性檢測質(zhì)粒5 .引物：pLexA測序引物及pB42AD測序引物。三、酵母雙雜交實驗的基本流程1 .將報告基因p8op-LacZ轉(zhuǎn)化酵母EGY48菌株，用培養(yǎng)基SD/-Ura篩選。2 .同時構(gòu)建或擴增DNA文庫，并純化足夠的質(zhì)粒以轉(zhuǎn)化酵母細胞。3 .構(gòu)建DNA-BD/靶蛋白質(zhì)粒pLexA-X,作為釣餌（bait）。4 .將上述釣餌質(zhì)粒pLexA-X轉(zhuǎn)化EGY48（p8op-LacZ）細胞株，用SD/-His/-Ura篩選；并用固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Ura檢測此D

5、NA-BD/靶蛋白是否具有直接激活報告基因的活性，以及對酵母細胞是否具有殺傷毒性。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒選擇培養(yǎng)基克隆生長情況說明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His,-Ura藍陽性對照pLexASD/-His,-Ura白陰性對照PlexA-XSD/-His,-Ura白沒有直接激活活性PlexA-XSD/-His,-Ura藍具有直接激活活性PlexA-XSD/-His,-Ura菌落不能生長酵母細胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖昔酶的信號作用。P能夠自動激活報告基因，則設法去除其激活活性部位、或者將LacZ報告基因整合入基因組，減少4-2.如果pLexA-X雖然不會自動激活報告基因，

6、但對酵母宿主細胞有毒性，則需要與純化的文庫DNA同時轉(zhuǎn)化酵母。5 .如果pLexA-X既不會自動激活報告基因，也不具有毒性，則可以與純化的文庫DNA同時、或順序轉(zhuǎn)化酵母細胞，并檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化質(zhì)粒SD固體培養(yǎng)基LacZ表型對口11pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura藍對口22pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu藍+pB42AD-T實驗pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待測+pB42AD-文庫5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基選擇陽性共轉(zhuǎn)化子，并擴增，使宿主細胞中的質(zhì)粒在誘導前達到最大拷貝數(shù)

7、。-半乳糖甘酶無表達。fe-2.上述重組子轉(zhuǎn)至含X-gal的固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu,觀察LacZ及Leu報告基因的表達情形，藍色克隆即為陽性。白色克隆為假陽性，說明Leu雖有表達，但5-3.同時用LacZ、Leu兩個報告基因的目的，是為了盡可能消除實驗的假陽性誤差，譬如：AD融合蛋白不與目標蛋白結(jié)合，而直接與啟動子序列結(jié)合域結(jié)合等情況。由于2個報告基因的啟動子不同，出現(xiàn)上述假陽性的幾率就大大減少了。5-4.將藍色陽性克隆進行1次以上的劃種，盡可能分離克隆中的多種文庫質(zhì)粒。6 .陽性克隆的篩選6-1.隨機選取50個陽性克隆，擴增、抽提酵母質(zhì)粒，

8、電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌，抽提大腸桿菌中的質(zhì)粒，酶切鑒定是否具有插入片段及排除相同的文庫質(zhì)粒。6-2.如果重復的插入序列較多，可另取50個陽性克隆來分析。最后得到數(shù)種片段大小不同的插入序列，再轉(zhuǎn)化新的宿主細胞，檢測是否仍為陽性克隆。7 .用質(zhì)粒自然分選法（NaturalSegregation篩除只含有AD-文庫雜合子的克隆7-1.將初步得到的陽性克隆接種SD/-Trp/-Ura液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)1-2天，含有HIS3編碼序列的BD-靶質(zhì)粒在含有外源His培養(yǎng)基中，將以10%-20%左右的頻率隨機丟失。C孵育2-3天。-2.將上述克隆，轉(zhuǎn)鋪固體培養(yǎng)基SD/-Trp/-Ura,307-3.再挑

9、取生長的單克隆，轉(zhuǎn)入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培養(yǎng)基中，篩選His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文庫雜合子的重組子。7-4,將His表型缺陷的克隆轉(zhuǎn)化固體誘導培養(yǎng)基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura,以驗證AD-文庫能否直接激活報告基因的表達，棄去陽性克隆，保留陰性克隆。8 .酵母雜合試驗(YeastMating)1定真陽性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其對應的YM4271宿主細胞中分別轉(zhuǎn)入相應的質(zhì)粒或文庫DNA,通過雜合實驗確篩選pLexA-靶DNA與pB42AD-文庫確實具有相互作用的真陽性克隆。質(zhì)粒1(inYM4271)質(zhì)粒2(inEGY4

10、8)LacZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生長pLexA-靶DNApB42AD白不能生長pLexApB42AD-文庫白不能生長pLexA-靶DNApB42AD-文庫藍真陽性pLexA-LampB42AD-文庫白不能生長9,陽性克隆的進一步篩選和確證9-1,擴增初步確定的陽性克隆，抽提酵母DNA。該DNA為混合成份，既含有酵母基因組DNA,也含有3種轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。9-2,將上述DNA電轉(zhuǎn)化E.coliKC8宿主菌。由于在大腸桿菌中，具有不同復制起始調(diào)控序列的質(zhì)粒不相容；同時利用營養(yǎng)缺陷型篩選。因此，在M9/SD/-Trp培養(yǎng)基上，只有含有AD-文庫質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌才能生長，將其擴增、

11、并抽提質(zhì)粒DNA,酶切鑒定。9-3,用pLexA-靶DNA與pB42AD-庫DNA對應、共轉(zhuǎn)化只含有報告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板擴增，并與后面的誘導板形成對照，說明報告基因的表達與誘導AD融合蛋白的表達有關，再確證LacZ、Leu報告基因的表達。9-4,擴增與靶DNA相互作用的文庫DNA,進行序列分析及進一步的結(jié)構(gòu)、功能研究。10.對雙雜交系統(tǒng)陽性結(jié)果的進一步研究10-1,用不同的雙雜交系統(tǒng)驗證10-1-1,將載體pLexA與pB42AD互換后進行雙雜交實驗。10-1-2,選擇不同的雙雜交系統(tǒng)，如：以GAL4轉(zhuǎn)錄激活子為基礎的雙雜交系統(tǒng)。10-1-3,

12、將文庫質(zhì)粒移碼突變后，再與靶質(zhì)粒作用，報告基因是否仍能被激活。-半乳糖甘酶水平，比較作用強度變化。P10-1-4,去除或突變特定結(jié)合位點，定量檢測10-2,用試劑盒提供的引物測定插入片段的DNA序列，證明其編碼區(qū)域。10-3,用其它的檢測方法，如：親和色譜法或免疫共沉淀法來證明雙雜交系統(tǒng)篩選的蛋白之間的具有相互作用。10-4,進一步研究靶蛋白與篩選蛋白之間的功能關系構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的擴增1.自-80C冰箱取出含有cDNA文庫的甘油菌，置于冰浴中緩慢化凍。2,用新鮮的LB培養(yǎng)液在1,5ml離心管中將上述甘油菌1:106和1:108稀釋。1H加入90%取稀釋菌液各1090mm);37c

13、倒置培養(yǎng)過夜或30c培養(yǎng)24-36hr,計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。4LB培養(yǎng)液在1.5ml離心管中振蕩混勻，涂布LB/Amp平板(4,確定待擴增的cDNA文庫?度(cfu/ml)=克隆數(shù)X108(1:10崎釋)或克隆數(shù)X1010(1:108釋)。5,按照150mm),共100塊；37c倒置培養(yǎng)過夜。圾-4X104cfu/平板的濃度，涂布LB/Amp平板(6,在超凈工作臺上，在所有生長菌落的平板上加適量LB培養(yǎng)液，將菌落刮下，轉(zhuǎn)入2000mlLB/Amp培養(yǎng)液中，37c振蕩培養(yǎng)2-4hr。7,留取適量培養(yǎng)菌液以50%無菌甘油稀釋至25%終濃度，分裝，保存于-80C。8.其余培養(yǎng)菌液離心8000xg

14、x10min4c收集細菌；用質(zhì)粒DNA純化試劑盒大量抽提質(zhì)粒DNA。LB液體培養(yǎng)基，121C,15lb/in2滅菌15minA, bacto-Tryptone10.0gB, bacto-YeastExtract5,0gC, NaCl10.0gD, ddH2O-1000ml1 LB固體培養(yǎng)平板為含有1.5%瓊脂(Agar)LB培養(yǎng)基。2 *LB/Amp培養(yǎng)基為含有Ampg/ml的LB培養(yǎng)基。N50-100構(gòu)建于AD載體的cDNA文庫的純化1,質(zhì)粒DNA提取緩沖液名稱緩沖液配方g/mlRNaseMP1懸浮緩沖液50mMTris-HCl(pH8,0);10mMEDTA;100AP2裂解緩沖液200m

15、MNaOH;1%SDSP3中和緩沖液3,0MKac(pH5.5)QBT平衡緩沖液750mMNaCl;50mMMOPS(pH7.0);15%異丙醇；0.15%TritonX-100QC洗滌緩沖液1,0MNaCl;50mMMOPS(pH7,0);15%異丙醇QF洗脫緩沖液1.25MNaCl;50mMTris-HCl(pH8.5);15%異丙醇2,培養(yǎng)菌液離心6000xgx10min4,C,每500ml培養(yǎng)物(下同)的沉淀重懸于50mlP1緩沖液。3,加入50mlP2緩沖液，倒置4-6次混勻，室溫孵育5min。4,加入4c預冷的50mlP3緩沖液，快速倒置4-6次混勻，冰浴30min(其間再倒置混勻

16、4-6次)。5,將上述混合液再倒置混勻，離心12000xgx30min4；C,保留上清。6,上清再離心12000xgX15min4,C,留上清。7 .將上清液上樣于經(jīng)35mlQBT緩沖液平衡的QIAGEN-tip層析柱。8 .以100mlQC緩沖液洗滌層析柱2次。9 .以35mlQF緩沖液洗脫吸附于層析柱上的DNA。10,以0,7倍體積異丙醇沉淀DNA,離心12500xgx30min4,C,小心去除上清。11,以7ml70%乙醇洗滌沉淀DNA,離心12500xgx10min4C,小心去除上清。12,將沉淀的質(zhì)粒DNA溶于5mlTE(pH8,0)緩沖液，轉(zhuǎn)移至新的無菌離心管中，用2.5倍體積無水

17、乙醇；1/10體積3.0MNaAc(pH5.2),于-20C靜置過夜。13.離心12500xgx20min4；C,去除上清，沉淀用70%乙醇洗滌，超凈臺風干。1),保存于-20C。%/管(用于1次轉(zhuǎn)化反應，約40由4.干燥的DNA溶于適量體積TE,定量，分裝100-200構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞1.將酵母菌EGY48(p8op-lacZ)接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr,至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，115C,10lb/in

18、2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC. 10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD. 20xHis5.0mlE. 20xLeu5.0mlF. 20xTrp5.0mlG. ddH2O100.0ml2.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD,至OD600=0.2-0.3(約50ml),30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5(約3hr)。YPD液體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15minA. Polypepton6.0gB. bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O-

19、300ml3 .室溫離心5000xgx5min,棄上清；加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1XTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。4 .準備下列試劑2X轉(zhuǎn)化反應10XTE10XLiAc50%PEGddH2OlT/120T15JA.1XTE/LiAc0.15ml15l/960T120B.PEG/LiAc1.20ml120H/900C.1XTE1.00ml1005.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA,振蕩混勻。Hg)3-5A.pLexA-X(0.1B. 10mg/mll-SpermDNA*(0.1mg)10*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20C。l用1

20、XTE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，振蕩混勻。抬.每管加入100lW.各加入600PEG/LiAc,振蕩混勻，30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。l%.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42c熱休克15min,迅速插入冰浴。9.室溫離心13000xgx10se其量棄上清；以0.3ml1乂TE懸沉淀細胞，涂布SD/-Ura,-His固體培養(yǎng)板，30c倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura,-His固體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC. 10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)20.0mlD.

21、20xLeu10.0mlE. 20xTrp10.0mlF. Agar4.00gG. ddH2O90-100mm)g200.0ml鋪8-10塊平板(附表1.不同規(guī)模轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale轉(zhuǎn)化反應2011(1) SD液體培養(yǎng)基擴增酵母菌100ml100ml300ml(2) YPD液體培養(yǎng)基擴增酵母菌300mla300mla1000mlaTE或ddH2O洗滌酵母細胞15mlc25-50mlb500mla(4)準備A.1xTE/LiAc緩沖液1.5mld1.0mld8.0mlcB. PEG/LiAc緩沖液12.0mlc6.0mlc100.0

22、mlbC. 1xTEI沖液6.0mlc10.0mlc10.0mlc(5)分裝A.DNA-BDvectorgdx/20.2-1.0mgc、0.1gd0.1-0.5mgMgX2010-50也.ADvector0.1C.l2.0ml/lx20200SpermDNA(10mg/ml)10世91xTE/LiAc重懸感受態(tài)細胞1.5mlc1.0mlc8.0mlblx201.0ml8.0mP酵母感受態(tài)細胞100(7)PEG/LiAc緩沖液0.6mlx205.0ml60.0mll7.0mlJlX20700DMSO70(9)室溫離心后棄上清13000xgx10se2000xgx5mir2000xgx5min(1

23、0)1XTE重懸感受態(tài)細胞0.3mlx26.0ml10.0ml150mmx50*50mmx30<te0mmx20有甫固體選擇培養(yǎng)基平板注：*即為“構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞”*在不同容積的無菌離心管中進行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:1.5ml文庫cDNA轉(zhuǎn)化含有DNA-BD載體的酵母感受態(tài)細胞1 .以生長于SD/-Ura,-His固體培養(yǎng)板上的含有構(gòu)建于DNA-BD載體的目的DNA及報告基因(p8op-lacZ)的酵母菌EGY48作為宿主菌，制備酵母感受態(tài)細胞。2 .將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura，-His液體培養(yǎng)基中，

24、緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura,-His液體培養(yǎng)基中，30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr,至OD600>1.0。SD/-Ura,-His液體培養(yǎng)基,115C,10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC. 10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD. 20xLeu5.0mlE. 20xTrp5.0mlF. ddH2O-100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD,至OD600=0.2-0.3(約50ml),30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5(約3h

25、r)。YPD液體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15minA. Polypepton6.0gB. bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O-300ml4 .室溫離心5000xgx5min,棄上清；加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1XTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。5 .準備下列試劑1X轉(zhuǎn)化反應10XTE10XLiAc50%PEGddH2OlH/800U100MA.1xTE/LiAc1.0ml100l4.8ml/6005B.PEG/LiAc6.0ml600C.1xTE10.0ml1.0ml/9.0ml6.取1

26、.0ml用1XTE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，加入下列成份，振蕩混勻。l-g)40-A.pB42AD-Library(50-1008. 10mg/mll-HerringDNA*(2.0mg)200*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20C。7.加入6.0mlPEG/LiAc,振蕩混勻，30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)30min。l%.加入700DMSO緩和倒置混勻。42c熱休克15min,迅速插入冰浴。9 .室溫離心2000xgx5min,盡量棄上清。10 .以6.0ml100mm,每稀釋度各x2)30c倒置培養(yǎng)3-5天，確定轉(zhuǎn)化效率在2X106cfu以上有效。©稀

27、釋不同倍數(shù)，涂布SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)板(卜1xTE重懸沉淀細胞，取10150mmx30),30C倒置培養(yǎng)3-5天。©涂布SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)板(以11.按每板200SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15min稍冷卻后鋪板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)200.0mlD.20xLeu100.0mlE. Agar40.00gF. ddH2O150mm)g2000.0ml鋪30塊平板(12 .在超凈工作臺上，在所有生長

28、菌落的平板上各加5mlTE(pH7.0)緩沖液，將菌落刮下。13 .離心棄上清，加入10-20mlTE緩沖液重懸沉淀菌，加入等體積的無菌65%甘油-MgSO4緩沖液，混勻，分裝1.0ml/管，保存于4C1周或-80C1年以上。65%甘油-MgSO4緩沖液：65%甘油；100mMMgSO4;25mMTris-HCl(pH8.0)A.甘油65.00mlB. MgSO4?7H2O2.465gC. 2.0MTris-HCl(pH8.0)1.25mlD.ddH2O-100.00ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的篩選1.經(jīng)過選擇培養(yǎng)基篩選的含有DNA-BD載體、文庫DNA及報告基因的酵母感受態(tài)細胞，用無菌TE稀

29、釋至1:1041:106和1:108等不同濃度。90mm),30c倒置培養(yǎng)3-5天，計數(shù)平板上單克隆菌落數(shù)。虬涂布SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)板(N2.取上述稀釋菌液各1003 .確定待進一步鑒定的酵母菌滴度(cfu/ml)=克隆數(shù)X105(1:104釋)、克隆數(shù)X107(1:106釋)或克隆數(shù)X109(1:108釋)。4 .按照以前實驗確定的文庫轉(zhuǎn)化效率的5-10倍的總量、0.5-2X106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固體誘導培養(yǎng)板，30c倒置培養(yǎng)3-5天。5 .挑取顯藍色的菌落，再接種于SD/-Ura,-His，-Trp

30、固體培養(yǎng)基以及SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固體誘導培養(yǎng)基，以進一步確證。SD/Gal/Raf/-Ura,-His,-Trp,-Leu固體誘導培養(yǎng)基A. SD/Gal/Raf3.79gB. 10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlC. Agar2.00gD. ddH2O85.0ml滅菌(115C,10lb/in2)15min,冷卻至50C,加入下列成份后鋪板E. 10xBU10.0mlF. 20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm)琳甫5-6塊平板(10xBU緩沖?C121C,15lb/in2滅菌15minA.Na2HPO4?12

31、H2O9.30gB. NaH2PO4?2H2O3.90gC. ddH2O-100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA的提取1.挑取經(jīng)過酵母選擇/誘導培養(yǎng)基初步鑒定的酵母單菌落，接種于5.0-10.0mlSD/-Trp液體培養(yǎng)基，30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)20hr。SD/-Trp液體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC. 10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD. 20XHis5.0mlE. 20xLeu5.0ml

32、F. 20xUra5.0mlG. ddH2O100.0ml2.室溫離心5000xgx1min,棄上清，收菌。l酵母裂解液，振蕩重懸沉淀酵母菌。P3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl(pH8.0);1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB. 10%SDS10.0mlC. NaCl0.58gD. Tris0.12gE. EDTANa2?2H2O0.04gF. 1.0MHCl調(diào)pH8.0G. ddH2O-100.0ml4 .加入下列試劑，充分振蕩5min;液氮凍存10min,室溫復融；再充分振蕩5min。A

33、.經(jīng)酸處理的玻璃珠(Sigma)0.20gB.苯酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)0.2ml5 .室溫離心12000xgX10min,將上清轉(zhuǎn)移至新的.5ml離心管中，加入下列試劑，于-70C凍存30-60min。A.3MNaAc(1/10l切20lB.無水乙醇(2.5V)5006 .離心12500xgX10mir4C,棄上清；70%乙醇洗滌沉淀，于37c烘箱或超7臺干燥DNA;將干燥的沉淀DNA重溶于l無菌ddH2O中，保存于-20Co20-30酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的鑒定-酵母質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化大腸桿菌1.在冰浴條件下，取待轉(zhuǎn)化DNAl感受態(tài)細胞中，混勻。氣)，加入100H(5pg-0.5N

34、1.0QF,200恩將上述混合液加入間距0.1cm的樣品杯中，電轉(zhuǎn)化（1.8kV,2金。3 .迅速加入1ml新鮮的LB培養(yǎng)液，混勻，轉(zhuǎn)入1.5ml離心管中，37c恒溫，150rpm振蕩孵育30-60min。4 .將上述轉(zhuǎn)化反應液涂布M9/DO（-Trp）固體培養(yǎng)板，37c倒置培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)（16-22hr）。5 .按常規(guī)方法擴增上述陽性轉(zhuǎn)化菌，堿裂解法少量抽提質(zhì)粒DNA,酶切篩選AD載體上含有插入片段的陽性克隆，保存其于25%甘油，待進一步驗證。M9/DO-Trp固體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15minA.葡萄糖1.2gB. Agar6.0gC. 5XM9緩沖液60mlD. 10

35、xDO（-His,-Leu,-Trp,-Ura）30mlE. 20XHis15mlF. 20xLeu15mlG. 20xUra15mlH. ddH2O165ml冷卻至50c左右，加入下列成份，混勻鋪板I. 1.0MThiamine-HCl（Vit.B1）0.3mlJ. 100mg/mlAmp0.3ml90-100mm）唯甫10-15塊平板（大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（電轉(zhuǎn)化）1 .挑取LB固體培養(yǎng)基上生長的E.coliKC8單菌落，接種于5mlLB液體培養(yǎng)基中，37c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)過夜（約12-14hr）。2 .將2.5ml新鮮菌液接種于500mlSOB培養(yǎng)液中，37c恒溫，250r

36、pm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.5-0.6（約2.5-3hr）。SOB液體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15minA. bacto-Tryptone10.00gB. bacto-YeastExtract2.50gC. NaCl0.25gD. KCl0.09gE. MgCl2?6H2O1.02gF. ddH2O-500.0ml3 .將培養(yǎng)菌液收集于離心管中，冰水浴15-20min。4 .離心6000xgx10min4,棄盡上清；以5ml預冷的無菌ddH2O重懸沉淀菌；再加入500ml預冷的無菌ddH2O洗滌細菌。5 .重復上述步驟1次，以充分去除培養(yǎng)基中殘余的鹽離子成份。6 .用40-50

37、ml預冷的無菌10%甘油重懸沉淀細菌，轉(zhuǎn)移至50ml無菌離心管中；離心6000xgx10min4,棄盡上清；重復此步驟1次。7 .以等體積（約1.5-2.0ml）預冷的無菌10%甘油重懸上述沉淀的感受態(tài)細胞，分裝0.5ml/管（5-6次轉(zhuǎn)化反應），保存于-80C備用。酵母雙雜合系統(tǒng)陽性克隆的確證1 .以含有報告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作為轉(zhuǎn)化宿主菌。2 .將酵母宿主菌接種于5.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，緩振打散菌落，然后轉(zhuǎn)入95.0mlSD/-Ura液體培養(yǎng)基中，30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)16-18hr,至OD600>1.0。SD/-Ura液體培養(yǎng)基，1

38、15C,10lb/in2滅菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC. 10xDO(-His,-Leu,-Trp,-Ura)10.0mlD. 20XHis5.0mlE. 20xLeu5.0mlF. 20xTrp5.0mlG. ddH2O100.0ml3.將上述新鮮培養(yǎng)菌液接種于300mlYPD,至OD600=0.2-0.3（約50ml）,30c恒溫，250rpm振蕩培養(yǎng)至OD600=0.4-0.5（約3hr）。YPD液體培養(yǎng)基，115C,10lb/in2滅菌15minA. Polypepton6.0gB. bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6

39、.0gD.ddH2O-300ml4 .室溫離心5000xgx5min,棄上清；加入15-25mlddH2O重懸洗滌沉淀酵母細胞，離心棄上清，沉淀用1XTE/LiAc重懸后，即為酵母感受態(tài)細胞。5 .準備下列試劑20X轉(zhuǎn)化反應10XTE10XLiAc50%PEGddH2Ol/1.2mlT150A.1XTE/LiAc1.5ml150B. PEG/LiAc12.0ml1.2ml1.2ml9.6ml/C. 1xTE10.0ml1.0ml/9.0ml6.分裝待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA。A.pLexAlg)3-5orpLexA-X(0.1Hg)3-5B.pB42AD-Y(0.1C.10mg/mlSperml-DNA*(0.1mg)10*新配制時水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20Co力.每管加入100250rpm振蕩培養(yǎng)30min。l用1XTE/LiAc重懸的酵母感受態(tài)細胞，振蕩混勻。l均.各加入600PEG/LiAc,振蕩混勻，30c恒溫,l田.各加入70DMSO緩和倒置混勻。42c熱休克15min,迅速插入冰浴。10.室溫離心13000xgx10sec,盡量棄上清；%.3ml1xTE懸沉淀細胞，涂布SD/-Ura,-His,-Trp固體培養(yǎng)板，30c倒置培養(yǎng)3-5天。SD/-Ura,-His,-Trp