CCK-8操作說明與檢測步驟

1、DOJINDC操作說明細(xì)胞活性檢測1. 在96孔板中接種細(xì)胞懸液 100 ml /孔。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 在37 C, 5% CO2 的條件下 。2. 向每孔參加 10 ml 的 CCK- 8溶液 注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響 值的讀 數(shù) 。3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)。4. 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。5. 如果暫時(shí)不測定值，打算以后測定的話，可以向每孔中參加10 ml 0.1 M HCI溶液或者1% w/vSDS 溶液， 并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。 在 24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變 化。細(xì)胞增殖 -毒性檢測1. 在96孔板中配制100 ml的細(xì)

2、胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng) 24小時(shí)在37C , 5% CO2 的條件下 。2. 向培養(yǎng)板參加10 ml不同濃度的待測物質(zhì)。3. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間例如: 6,12, 24 或48小時(shí) 。4. 向每孔參加10 ml CCK-8溶液注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù)。5. 將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 1-4 小時(shí)。6. 用酶標(biāo)儀測定在 450 nm 處的吸光度。7. 如果暫時(shí)不測定 O.D值，打算以后測定的話， 可以向每孔中參加 10 ml 0.1 M HCI溶液或者1% w/vSDS 溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。在24小時(shí)內(nèi)吸光度不會(huì)發(fā)生變化。注意：如

3、果待測物質(zhì)有氧化性或復(fù)原性的話，可在加 CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基，去掉藥物 的影響。 當(dāng)然藥物影響比較小的情況可以不更換培養(yǎng)基， 直接扣除培養(yǎng)基中參加藥物后的空 白吸收即可。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線1. 先用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)所制備的細(xì)胞懸液中的細(xì)胞數(shù)量，然后接種細(xì)胞。2. 按比例 例如： 1/2 比例 依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個(gè)細(xì)胞濃度梯度， 一般要做 3-5個(gè)細(xì) 胞濃度梯度，每組 3-6 個(gè)復(fù)孔。3. 接種后培養(yǎng)2-4小時(shí)使細(xì)胞貼壁，然后加 CCK-8試劑培養(yǎng)一定時(shí)間后測定 O.D值，制作出 一條以細(xì)胞數(shù)量為橫坐標(biāo) X軸，O.D值為縱坐標(biāo)Y軸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線可以 測定出未知樣品的細(xì)胞數(shù)量 使

4、用此標(biāo)準(zhǔn)曲線的前提條件是實(shí)驗(yàn)的條件要一致，便于確定細(xì)胞的接種數(shù)量以及參加 CCK-8后的培養(yǎng)時(shí)間。DOJINDO檢測步驟CCK-8檢測步驟1. 向各孔中參加100卩l(xiāng)細(xì)胞懸液。a2. 在37C下預(yù)孵育培養(yǎng)板。b3. 向各孔中參加各濃度的待測溶液 c10卩I4. 37C下孵育。5. 向各孔中參加10卩I的CCK-8溶液d。6. 37C下孵育1-4小時(shí)。e7. 測定450 nm處的OD值。a使用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基制備50,000-100,000個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。b建議使用CO2培養(yǎng)箱過夜預(yù)培養(yǎng)。c使用培養(yǎng)基或PBS來制備溶液。d如果待測溶液有復(fù)原性，測定不含細(xì)胞，但含有 CCK-8的待測溶液在450

5、nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，那么可以直接參加CCK-8，如果吸光度相對(duì)較大，那么需要除去培養(yǎng)基， 并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后參加新的100卩I 培養(yǎng)基和10卩I CCK-8進(jìn)行檢測。e白細(xì)胞可能需要培養(yǎng)較長時(shí)間?；盍τ?jì)算細(xì)胞活力* A加藥：=A加藥-A空白/A0加藥-A空白X 100 具有細(xì)胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A空白：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細(xì)胞的孔的吸光度A0加藥：具有細(xì)胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度 *細(xì)胞活力：細(xì)胞增殖活力或細(xì)胞毒性活力問答:1一個(gè)孔中應(yīng)接種多少個(gè)細(xì)胞?當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時(shí)，貼壁細(xì)胞的最小接種量至少為1,000個(gè)/孔1

6、00卩I培養(yǎng)基。檢測白細(xì)胞時(shí)的靈敏度相對(duì)較低，因此推薦接種量不低于2,500個(gè)/孔100使用24孔板或6孔板實(shí)驗(yàn)，請(qǐng)先計(jì)算每孔相應(yīng)的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%參加CCK-8溶液。2能否用384孔板進(jìn)行試驗(yàn)？可以。向各孔中參加培養(yǎng)基體積10%的CCK-8溶液，如果參加的 CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后參加培養(yǎng)基體積20%的量。3能否用24孔板進(jìn)行試驗(yàn)?4. 酚紅會(huì)影響檢測嗎？不會(huì)。 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計(jì)算時(shí)， 通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去， 因此 不會(huì)對(duì)檢測造成影響。5. CCK-8與胸苷結(jié)合檢測之間是否有相關(guān)性？有。然而，請(qǐng)注意由于 CCK-

7、8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同，因此結(jié)果可能不同。6. CCK-8能否檢測細(xì)菌細(xì)胞？可以檢測E.coli,但不能檢測酵母細(xì)胞。 向100卩I E.co培養(yǎng)液中參加10卩I CGK溶液，并培 養(yǎng) 1-4 個(gè)小時(shí)或過夜。7. CCK-8穩(wěn)定嗎？CCK-8在 0-5C下能夠保存至少 6個(gè)月，在-20C下避光可以保存1年。如果需要長期保存， 我們推薦-20 C的儲(chǔ)藏條件。8. 如果沒有 450 nm 的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片？還可使用 450 nm 到 490 nm 之間的濾光片。9如何減少由于CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差？可以在加樣前用培養(yǎng)基稀釋CCK-8試劑并混勻后

8、加樣。10. CCK-8是什么顏色？應(yīng)該是粉紅色。假設(shè)顏色不一樣，有可能會(huì)影響測定。11. CCK8能否對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色？不能。因?yàn)镃CK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽WST8,并通過電子載體 1Methoxy PMS將活細(xì)胞中的電子交換到培養(yǎng)基中的WST8上。由于生成的甲Q也是高度水溶性的，因此CCK8不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。12. CCK8檢測溶液對(duì)細(xì)胞是否有毒？CCK8溶液自身因?yàn)楦邼舛鹊?1Methoxy PMS的存在而具有一點(diǎn)毒性。 但是，加到培養(yǎng)基中的 CCK8是沒有毒性的，因?yàn)楸幌♂屃?0倍。因此，長時(shí)間的培養(yǎng)，如過夜或者培養(yǎng)數(shù)天是可以的。同一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液在 CCK8檢測后還可以用

9、于其他細(xì)胞增殖檢測，如結(jié)晶紫檢測，中 性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由于每種細(xì)胞對(duì)于 CCK8的耐受力都不同，因此在需要進(jìn)行 長時(shí)間培養(yǎng)時(shí)，先檢測一下細(xì)胞在參加CCK8培養(yǎng)后的活力。13. 在做加藥實(shí)驗(yàn)時(shí)，藥物對(duì)測定是否有影響？如何解決？有時(shí)會(huì)有影響。如果藥物具有復(fù)原性，會(huì)和CCK8發(fā)生顯色反響，增加吸光度。解決方法：首先要確認(rèn)藥物是否有吸收，在含有藥物的培養(yǎng)基中參加 CCK8測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養(yǎng)基加CCK8的吸光度高，那么證明藥物有影響，可在加CCK8之前更換培養(yǎng)基，去掉藥物的影響。14. 每次測定的數(shù)值不一樣，是什么原因？如何解決？可能會(huì)有以下幾個(gè)原因：

10、 1. 當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易枯燥揮發(fā)， 由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。 一般情況下， 最外一圈的孔只加培養(yǎng)基， 不作為測定孔用。 2.有可能會(huì)因?yàn)?CCK8沾在壁上而產(chǎn)生誤差，建議在參加CCK8后，輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。 3. 每孔的細(xì)胞數(shù)量過多或過少。請(qǐng)預(yù)先在 1,000100,000 個(gè)/孔范圍內(nèi)摸索條件。15. 如何設(shè)定空白對(duì)照？在不含細(xì)胞的培養(yǎng)基中參加CCK8培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定 450 nm的吸光度即為空白對(duì)照。在做加藥實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 時(shí)，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在不含細(xì)胞，參加藥物的培養(yǎng)基 中參加CCK8培養(yǎng)一定的時(shí)間，測定 450 nm的吸光度作為空白對(duì)

11、照。16. 哪些物質(zhì)會(huì)影響CCK8的測定？當(dāng)有復(fù)原性物質(zhì)存在時(shí)會(huì)影響CCK8的測定，例如含有維生素C的Glucose等一般培養(yǎng)基中的量不多，酚紅或血清不影響測定 。在有酚紅存在的情況下，會(huì)增加空白吸收，但不影 響測定，扣除空白吸收即可。17. 在實(shí)驗(yàn)中吸光度值太高，如果不能減少細(xì)胞數(shù)量，如何解決？可以縮短參加 CCK8后的培養(yǎng)時(shí)間。例如：可以把參加CCK8試劑后的培養(yǎng)時(shí)間由 2小時(shí)縮短為 1 小時(shí)。18. 設(shè)定參比波長的目的是什么？必須設(shè)定嗎？不一定要設(shè)定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設(shè)定參比波長的目的是為了取出由于樣 品混濁所帶來的吸收。19. 說明書上僅寫了 96 孔板的測定方法，

12、如果使用 24 孔板貨 12孔板，應(yīng)該加多少量 CCK-8 試劑？一般情況下建議參加 CCK-8試劑的量是培養(yǎng)基體積的 1/10。20. 在CCK-8顯色過程中，如何終止反響?有一下幾種方法96孔板：1、在顯色反響后，將培養(yǎng)板放置4C冰箱內(nèi)。2、每孔加10卩I 0.1 M HCL溶液。3、每孔加10卩I 1%w/v丨的SDS十二烷基硫酸鈉溶液。注意：反 應(yīng)停止后，應(yīng)在 24 小時(shí)之內(nèi)測定。21. 必須預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞嗎?不一定。如果要向保持細(xì)胞的最好狀態(tài)， 建議預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞。如果不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)， 細(xì)胞內(nèi)的 脫氫酶可能會(huì)不穩(wěn)定。 也有人不做細(xì)胞預(yù)培養(yǎng)， 但在做標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測時(shí)需要統(tǒng)一檢測條件。22. 如

13、果參加的藥物中含有金屬，是否會(huì)有影響?金屬對(duì)CCK-8顯色有影響。當(dāng)終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會(huì)抑制5%、15%、 90%的顯色反響，使靈敏度降級(jí)。如果終濃度是10 Mm 的話，將會(huì) 100%抑制。23. CCK-8試劑的保存條件？在避光條件下CCK-8試劑在4 C可保存一年。如果需要保存較長時(shí)間的話，推薦在-20C下保 存。但是CCK-8假設(shè)反復(fù)解凍和冰凍將會(huì)增加空白吸收，從而影響檢測結(jié)果，假設(shè)經(jīng)常使用可將試劑存放在 4 C冰箱內(nèi)保存。24. 預(yù)培養(yǎng)后，更換培養(yǎng)基需要細(xì)胞計(jì)數(shù)嗎？一般情況下用胰蛋白酶處理對(duì)數(shù)增長期的細(xì)胞， 用血球計(jì)數(shù)盤計(jì)數(shù)， 制備成一定濃度的細(xì)胞 懸液即可。如

14、果想要精密計(jì)數(shù)細(xì)胞的話，可以預(yù)培養(yǎng)后取培養(yǎng)基用血球計(jì)數(shù)盤進(jìn)行計(jì)數(shù)。25. CCK-8對(duì)于不同的細(xì)胞，靈敏度是否一樣？不一樣，懸浮細(xì)胞與貼壁細(xì)胞相比較難染色。對(duì)于貼壁細(xì)胞，一般參加CCK-8培養(yǎng)1-4小時(shí)吸光度已經(jīng)很高，但對(duì)于懸浮細(xì)胞那么可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的參加時(shí)間或增加細(xì)胞數(shù)量來解決。26. 懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞在數(shù)量上有何區(qū)別？懸浮細(xì)胞由于染色比較困那， 一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長培養(yǎng)時(shí)間。 貼壁細(xì)胞染色比較容 易，假設(shè)細(xì)胞數(shù)量過大，有時(shí)吸光度會(huì)超過酶標(biāo)儀的讀數(shù)。27. 應(yīng)該每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？建議每次做。雖然細(xì)胞是一樣的，但是細(xì)胞的狀態(tài)不一定一樣，對(duì)于狀態(tài)不一樣的細(xì)胞，建 議每次做標(biāo)準(zhǔn)曲線。 如果試劑的批號(hào)不一樣， 靈敏度可能會(huì)有輕微的差異， 對(duì)于不同的批號(hào) 建議分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線。28. 有時(shí)在藥物作用情況下， 細(xì)胞已經(jīng)死亡， 但是脫氫酶的活性還在， 是