真核細(xì)胞RNA的分離和鑒定

1、真核細(xì)胞 RNA 的分離和鑒定中國藥科大學(xué) 09419綜述:RNA 分離純化技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ), 高質(zhì)量的 RNA 是許多分子生物學(xué)成 功與否的關(guān)鍵。然而,真核細(xì)胞內(nèi)大部分 RNA 均與蛋白質(zhì)結(jié)合,以核蛋白形式存在, RNA 酶廣泛存在細(xì)胞中, 組織細(xì)胞中還有脂溶性及酸溶性小分子物質(zhì)存在。 故對于真核細(xì)胞而言, 有效破碎、 有效地使核蛋白復(fù)合體變性、 對內(nèi)源 RNA 酶的有效抑制、 有效地將 RNA 從 DNA 和蛋白混合物中分離、對于多糖含量高的樣品還牽涉到多糖雜質(zhì)的有效除去等是 RNA 提取 過程中的關(guān)鍵點。 TRIZOL REAGENT 是一種新型總 RNA 抽提試劑,可以直

2、接從細(xì)胞或組 織中提取總 RNA 。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞并抑制細(xì)胞釋放出的 核酸酶。 TRIZOL 在破碎和溶解細(xì)胞時能保持 RNA 的完整性,因此對純化 DNA 及標(biāo)準(zhǔn)化 RNA 的生產(chǎn)十分有用。本次實驗通過利用 TRIZOL 試劑提純 RNA.關(guān)鍵字:真核細(xì)胞 RNA ;蟾蜍卵細(xì)胞; TRIZOL 法;甲基綠 -吡羅紅染色液實驗?zāi)康?學(xué)習(xí)和掌握用 TRIZOL 法來提取真核細(xì)胞 RNA 的原理和操作技術(shù)。了解定性鑒定 RNA 的原理和方法。實驗原理:根據(jù)成熟雌蟾蜍體內(nèi)含大量卵細(xì)胞且可以方便獲取,細(xì)胞內(nèi)含核酸豐富,沒有其它組 織器官等的干擾等優(yōu)點以確定蟾蜍卵細(xì)胞為實驗

3、所需的真核細(xì)胞。 通過 TRIZOL 溶液中變性 劑破碎真核細(xì)胞, 然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提 RNA , 再利用 RNA 不溶于異丙醇的性質(zhì)將 自身析出,達(dá)到分離提純的目的。TRIzol 的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞,使細(xì)胞中的蛋白,核酸物質(zhì) 解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì),但不能完全抑制 RNA 酶活性,因此 TRIzol 中還加入了 8-羥基喹啉、 異硫氰酸胍、 -巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源 RNase (RNA 酶 。 0.1%的 8-羥基喹啉可以抑制 RNase ,與氯仿聯(lián)合使用可增強抑制作用。異硫氰酸胍屬于解 偶劑, 是一類強力的蛋白質(zhì)變性劑, 可溶解蛋白質(zhì)并

4、使 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu) 消失, 導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu) 降解,核蛋白迅速與核酸分離。-巰基乙醇的主要作用是破壞 RNase 蛋白質(zhì)中的二硫鍵。 甲基綠吡羅紅為堿性染料,它分別能與細(xì)胞內(nèi)的 DNA 、 RNA 結(jié)合呈現(xiàn)不同顏色。 當(dāng) 甲基綠與吡羅紅作為混合染料時,甲基綠與染色質(zhì)中 DNA 選擇性結(jié)合顯示綠色或藍(lán)色;吡 羅紅與核仁、細(xì)胞質(zhì)中的 RNA 選擇性結(jié)合顯示紅色。其原因可能是兩種染料的混合染液中 有競爭作用, 同時兩種核酸分子都是多聚體, 而其聚合程度有所不同。 甲基綠易與聚合程度 高的 DNA 結(jié)合呈現(xiàn)綠色。 而吡羅紅則與聚合程度較低的 RNA 結(jié)合呈現(xiàn)紅色 (但解聚的 DNA 也能和派洛寧結(jié)合呈現(xiàn)紅

5、色 。即 RNA 對派洛寧親和力大,被染成紅色,而 DNA 對甲基綠 親和力大,被染成綠色。實驗材料:(一 試劑1. 甲基綠吡羅紅染料:染色劑 A 液的兩種配制方法第一種方法:取吡羅紅甲基綠粉 1g ,加入到 100mL 蒸餾水中溶解,然后用濾紙過 濾,將濾液放入棕色瓶中備用。第二種方法:取甲基綠 2g 溶于 98mL 蒸餾水中,取吡羅紅 G 5g 溶于 95mL 蒸餾水 中。取 6mL 甲基綠溶液和 2mL 吡羅紅溶液加入到 16mL 蒸餾水中,即為 A 液,放入棕色 瓶中備用。 (注意:用于核酸染色的是吡羅紅 G ,請不要錯買吡羅紅 B 。 染色劑 B 液的配制方法 B 液是一種緩沖液,由

6、乙酸鈉和乙酸混合而成。先取乙酸 鈉 16.4g ,用蒸餾水溶解至 1000mL 備用;再取乙酸 12mL ,用蒸餾水稀釋至 1000mL 備 用。取配好的乙酸鈉溶液 30mL 和稀釋的乙酸 20mL ,加蒸餾水 50mL ,配成 pH 為 4.8的 B 液(緩沖液 。染色劑的配制 染色劑是由 A 液、 B 液混合配制而成的。取 A 液 20mL 和 B 液 80mL 混合,就是實驗中所用的吡羅紅甲基綠染色劑。應(yīng)該注意的是該試劑應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用。2. TRIZOL 試劑(Invitrogen 公司購買3. 75%乙醇4. 氯仿5. 異丙醇6.Nacl (0.14m/l(二器材2. 冰浴3.研缽4. 燒

7、杯5. 量筒6. 試管7. 玻棒8. 膠頭滴管 99. 離心管10. 天平實驗方法:制備勻漿:以班級為單位,稱取大概 10g 蟾蜍卵細(xì)胞(23保存 ,于研缽(可置于冰浴鍋上 中,根據(jù) 1030mg組織細(xì)胞加 1ml trizol 試劑的量加入其中,快速研磨,制備勻漿。實 驗二人合作為一組,每組取大概 10ml 勻漿。RNA 的提取:定性試驗:取 2支干凈試管,一管加入 1.5ML RNA 溶液(將 RNA 顆粒狀的沉淀溶于2ML0.14/NACL溶液中 , 另一管加入蒸餾水 1.5ML , 像兩管中加入 3M 甲基綠 -吡羅紅染色 劑,溶液變成紅色為陽性反應(yīng)。實驗結(jié)果:利用 TRIZOL 法可成功提取的 RNA ,并使得甲基綠 -吡羅紅染色劑顯紅色。實驗注意事項:TRIzol 對人體有害,使用時應(yīng)戴一次性手套,注意防止濺出。由于本科生實驗室里的為普通離心機,轉(zhuǎn)速不高,故可適當(dāng)延長離心時間。離心后,注意上清液和沉淀的取舍以及對 RNA 層的小心吸取,否則將導(dǎo)致 RNA 樣品中 有 DNA 污染。還有見實驗書 38頁參考文獻(xiàn):吳艷華,蘭州大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版 ,生物組織總 RNA 的高