低溫乙醇法從人血清中提取免疫球蛋白

1、低溫乙醇法從人血清中提取免疫球蛋白一、 實驗?zāi)康睦玫蜏匾掖挤◤娜搜逯蟹蛛x出免疫球蛋白（Ig），并獲得副產(chǎn)物血清白蛋白。二、 實驗原理（1）低溫乙醇法Cohn6法：美國哈佛大學(xué)··COHN教授研究組，在短短兩年建立了低溫乙醇分段提取法。方法原理：往蛋白水溶液中加入中溶性有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮等，主要是降低水分子的活度，降低溶液的介電常數(shù)，從蛋白分子周圍排斥水分子，使蛋白分子之間通過極性基團(tuán)的相互作用，在范德華力作用下，發(fā)生凝聚。不過由于有機(jī)溶劑存在，降低了蛋白分子表面憎水基團(tuán)的作用，因而引起蛋白分子聚集的主要極性基團(tuán)的相互電荷之間的引力。（文獻(xiàn)20）分離過程中，二法通過五

2、個因素的變動(五變系統(tǒng))，使很多血漿蛋白質(zhì)得以分離。這五個因素及其各自的作用是；乙醇：使蛋白質(zhì)分子“脫水”；pH值；蛋白質(zhì)在等電點時易于沉淀；電解質(zhì)濃度：在低離子濃度下，對蛋白質(zhì)溶解度有較大影響；蛋白質(zhì)濃度：濃度越低，其沉淀作用越小；溫度：在低溫下，可避免乙醇對蛋白質(zhì)的變性作用。同時，蛋白質(zhì)溶解為吸熱反應(yīng)，溶解度隨溫度上升而增高。經(jīng)實驗得知，利用低溫乙醇法能將血清蛋白分成六個組分（），其中免疫球蛋白IgG主要存在于+中，白蛋白Alb主要存在于中。(2) Cohn氏9法；該法對Cohn氏6法的組分+作進(jìn)一步分離和提純，可獲得組分l，2，3(YG)，組分一1(同種凝集素)，組分2(凝血酶原)，組分

3、3(血漿酶原)等產(chǎn)品。其工藝流程見圖:第1 / 8頁乙醇法生產(chǎn)中所用的乙醇是通過予冷、慢速攪拌滴入的。其體積可按下式計算：式中V所需乙醇體積；V0原來溶液體積；C 1原來溶液乙醇濃度；C2所需達(dá)到乙醇濃度；C3加入乙醇的濃度。三、 材料和試劑3.1 血清：100 mL3.2 相關(guān)試劑：95%乙醇，pH 4. 0醋酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，3 mol/L NaCl溶液，1 mol/L NaHCO3 ，生理氯化鈉溶液，麥芽糖，3.3 實驗儀器：四、 方法與步驟基本思路：第2 / 8頁血清的初處理利用Cohn6法得到組分+利用Cohn9法得到IgGIgG沉淀的保存（濃縮蛋白液或凍干品）

4、Ig物理性狀及生化檢定（蛋白含量、純度、免疫活性、穩(wěn)定性）4.1 血清的初處理（文獻(xiàn)4，名詞.txt中關(guān)于血清的部分）（1）將血清從冷凍箱（-5C至-20）取出后，先置于2-8冰箱使之溶解（2）在室溫下使之全溶。以上操作注意隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。（3）熱滅活（目的是為了去除血清中補(bǔ)體等對熱敏感的物質(zhì)，通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量，故省略）。4.2 低溫乙醇法提取Ig及副產(chǎn)物Alb（生物制品基礎(chǔ)摘錄45，文獻(xiàn)4、17）（1）量取血清體積100 mL，攪拌降溫至04，將血清調(diào)pH 7.2，調(diào)節(jié)NaCl濃度至0.14 mol/L，加乙醇至8%，加入乙醇的時間控制在6

5、090 min；從加乙醇開始起為反應(yīng)體系降溫，保持反應(yīng)溫度在-2-4；加完乙醇后取樣測pH值，調(diào)節(jié)pH值為7.2；繼續(xù)攪拌1 h，靜置30 min；3000 r/min離心10 min，去除上清，收集沉淀并稱取質(zhì)量。（2）沉淀中加入04的注射用水，加水量為沉淀質(zhì)量的7倍，持續(xù)攪拌直至成為均勻的蛋白漿；取樣測pH值，蛋白漿中加磷酸鹽緩沖液在-5，調(diào)pH 6.97.1，加0.05 mol/LNaCl，加乙醇至25%，從加乙醇開始起為反應(yīng)體系降溫，保持反應(yīng)溫度在-5；加完乙醇后取樣測pH值，調(diào)節(jié)pH值為6.97.1；繼續(xù)攪拌1 h，靜置30 min；3000 r/min離心10 min，去除上清，收

6、集沉淀并稱取質(zhì)量，沉淀即為免疫球蛋白。（3） 將上述操作所得清夜在-5，調(diào)節(jié)pH至4.8，加乙醇至40%，加后反應(yīng)30 min，攪拌1 h，進(jìn)行離心，離心速度小于8000 r/min，取沉淀干燥，即為粗提取的副產(chǎn)物Alb。4.3 Ig沉淀的保存（1）蛋白液的濃縮方法用04生理氯化鈉溶液溶解沉淀，加量為沉淀質(zhì)量的10倍，攪拌至完全溶解；取樣測pH值，蛋白溶液中加入1 mol/L HCl，調(diào)節(jié)pH值為3. 604. 40。將聚乙二醇(PEG， 即carbowax4000W )用pH 值7.27.4、0.01 molL的PBS配成30溶液，將裝有蛋白液的透析袋浸入，在冰箱內(nèi)濃縮512 h，一般可濃縮

7、至原體積的1/31/20。用過的PEG在蒸發(fā)除去水分后可以重復(fù)利用。（2）冷凍真空干燥4.4 Ig物理性狀及生化檢定（文獻(xiàn)22）（1）蛋白含量的測定：紫外吸收法（生物制品基礎(chǔ)摘錄8，文獻(xiàn)25）將PEG 濃縮后的待測蛋白質(zhì)溶液稀釋10倍，使其光密度在02-20之間， 在波長280 nm 和260 nm處以00175 mol/L、pH 值6.7的磷酸緩沖溶液作空白對照， 分別測得待測樣品的光密度值(OD280 和OD260)。應(yīng)用280 nm 和260 nm 的吸收差法經(jīng)驗公式直接計算出蛋白質(zhì)濃度。計算公式為蛋白質(zhì)濃度=(145 OD280-0.74 OD260)x稀釋倍數(shù)（2）Ig純度分析：SD

8、S-PAGE電泳（生物制品基礎(chǔ)摘錄911，文獻(xiàn)25） 在厚度為1 mm 的垂直電泳板上進(jìn)行不連續(xù)電泳，樣品的加樣量為5L。電泳過程中，濃縮膠部分保持電流15 mA，進(jìn)入分離膠后，電流為25 mA 。電泳結(jié)束后，將膠片用含有33 甲醇和12三氯乙酸的固定液固定4 h，然后用考馬斯亮藍(lán)(CBB)G-250染色液(含有1.05 mmol/L的CBBG-250，1.0 mol/L 硫酸，10 mol/L 的NaOH ，12%的TcA)染色3 h。染色結(jié)束后，用蒸餾水對膠片進(jìn)行洗脫，直至底色基本脫去為止。采用表1所示標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)：（3）Ig各組分含量測定：SephadexG-200凝膠柱層析法（文獻(xiàn)22）

9、（4）Ig免疫活性的測定：？（5）Ig的穩(wěn)定性檢驗：IgG制品置57±0.5水浴保溫4 h后,無凝膠化和絮狀物（文獻(xiàn)22）（6）Ig固體總量測定：用以計算純度或某一成分的單位含量。干烤恒重法（生物制品基礎(chǔ)摘錄14）（7）多聚體含量測定：用HPLC法需要注意的幾個地方：在低溫乙醇法白蛋白生產(chǎn)中，影響收率的幾個重要因素：A、必須緩慢加入；B、邊加邊攪拌；C、避免產(chǎn)生泡沫。使蛋白的溶解度呈一個光滑的曲線（1）乙醇是蛋白沉淀劑，也是蛋白變性劑，故沉淀反應(yīng)在低溫進(jìn)行。單純從防止變性出發(fā)，溫度越低越好，但不能低于冰點，還要兼顧各種蛋白在不同溫度的溶解性不同，溫度過低也影響分離結(jié)果，必須通過系統(tǒng)試

10、驗，優(yōu)選出最適的工藝參數(shù)。（2）往水溶液中加乙醇時是放熱反應(yīng)，必須有高效的制冷系統(tǒng)，但不能使溫度升高，還要使其降低。隨著乙醇濃度的增高，溫度變化并非一條直線，當(dāng)濃度在0-20范圍內(nèi)逐漸增加時，溫度急劇上升，當(dāng)濃度超過20，再增加時，溫度幾乎不再變化。故在加乙醇時從02030，特別是0-10的階段必須緩慢，超過30時即可加速。（3）除乙醇的濃度外，pH及u極為重要，一般情況下，pH越接近iep，u越低，蛋白越容易沉淀。精確調(diào)整pH及u的值，可在較低的乙醇濃度下，達(dá)到分離蛋白的目的。PH測定使用玻璃電極，應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)條件下2225測得數(shù)值。用生理鹽水稀釋至乙醇濃度不再影響pH值。（4）蛋白濃度太高，由

11、于其沉淀現(xiàn)象，使分離發(fā)生困難，太低則沉淀聚集時間長，而且加大容器體積，一般以2.53.0為宜。（5）沉淀的分離與再溶解，造成一種條件，使一種蛋白溶解，也使另一種蛋白沉淀，即使兩者溶解度相差100-1000倍。一般條件下，離心或沉淀呈糊狀，固體濕重最多達(dá)2530，其余為母液，欲提高純度和收率，須用少量洗滌液洗滌沉淀，或?qū)⒊恋砣芙庠俜磸?fù)沉淀。沉淀加適量的溶解液應(yīng)易于溶解，溶解后如再有少量不溶物，可再加一些溶解液如仍不溶解，不溶物多為變性蛋白，應(yīng)過濾除去。五、 實驗記錄六、 實驗中可能出現(xiàn)的問題以及解決方案6.1 等電點共沉淀，影響純度6.2 產(chǎn)生多聚體或聚合物，失去免疫活性（文獻(xiàn)19）附圖二：實驗室凍干制品的制備實驗室制備凍干品的簡單裝置如圖(a)，樣品干燥時，先在培養(yǎng)皿內(nèi)鋪成薄層（厚度不超過1cm的液體），置于低溫冰箱內(nèi)凍固。另在真空干燥器內(nèi)用二個培養(yǎng)皿分別旋轉(zhuǎn)固體氫氧化鈉和五氧化二磷，真空干燥器上端抽氣管通過五氧化二磷干燥管與真空泵相連。當(dāng)放進(jìn)待干燥的凍塊后，立即封閉干燥器，開動真空泵，經(jīng)510小