中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心教案

1、中南大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心教案授課科目:醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)授課內(nèi)容:蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和進(jìn)展授課對(duì)象：臨床醫(yī)學(xué)七年制、八年制授課時(shí)數(shù)：4學(xué)時(shí)授課教師：授課地點(diǎn)：湘雅醫(yī)學(xué)院新教學(xué)區(qū)授課時(shí)間：授課教材：醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（21世紀(jì)高等院校教材），胡維新主編，北京：科學(xué)出版社，2007年2月，第一版；醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)（衛(wèi)生部8年制規(guī)劃教材），馮作化主編，北京：人民衛(wèi)生出版社，2005，第一版第九章蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和進(jìn)展一目的要求掌握：蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)的概念；常用蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)。熟悉：通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互

2、作用蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程。了解：蛋白質(zhì)組的發(fā)展史；蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用。2 講授重點(diǎn)：蛋白質(zhì)組學(xué)及功能蛋白質(zhì)組學(xué)的概念；常用蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)；通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程。3 講授難點(diǎn)：通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程。六、講授內(nèi)容第九章蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法和進(jìn)展一目的要求掌握：蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)的概念；常用蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)。熟悉：通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流

3、程。了解：蛋白質(zhì)組的發(fā)展史；蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用。2 講授重點(diǎn)：蛋白質(zhì)組學(xué)及功能蛋白質(zhì)組學(xué)的概念；常用蛋白質(zhì)組學(xué)研究基本技術(shù)的原理及優(yōu)缺點(diǎn)；通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程。3 講授難點(diǎn)：通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)；酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)流程。四、教學(xué)方法：多媒體教學(xué)五、教具：多媒體課件六、講授內(nèi)容（同八年制）人類(lèi)基因組序列（humangenomeproject,HGP揭示基因組的精細(xì)結(jié)構(gòu)，顯示了基因數(shù)量有限性和基因結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性，與生命現(xiàn)象的復(fù)雜性和多變性之間存在著巨大反差。促使人們認(rèn)

4、識(shí)到：基因只是遺傳信息的載體。基因組學(xué)在基因活性和疾病的相關(guān)性方面為人類(lèi)提供了有力根據(jù),但是基因的表達(dá)方式錯(cuò)綜復(fù)雜，同樣的一個(gè)基因在不同條件、不同時(shí)期可能會(huì)起到完全不同的作用。因此研究生命現(xiàn)象，闡釋生命活動(dòng)的規(guī)律，只了解基因組的結(jié)構(gòu)是不夠的，還須對(duì)生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者蛋白質(zhì)進(jìn)行更深入的探討。事實(shí)上對(duì)蛋白質(zhì)的數(shù)量、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、相互關(guān)系和生物學(xué)功能進(jìn)行全面深入的研究已成為生命科學(xué)研究的迫切需要和重要任務(wù)。以“蛋白質(zhì)組”（proteome）為研究對(duì)象的生命科學(xué)新時(shí)代已經(jīng)到來(lái)。第一節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)的概念及其發(fā)展史一、蛋白質(zhì)組學(xué)的概念蛋白質(zhì)組是澳大利亞學(xué)者Williams和Wilkins于1994年首先提出

5、,源于蛋白質(zhì)（protein）與基因組（genome兩個(gè)詞的雜合，指“一個(gè)細(xì)胞或一個(gè)組織基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)”。是對(duì)應(yīng)于一個(gè)基因組的所有蛋白質(zhì)構(gòu)成的整體，而不是局限于一個(gè)或幾個(gè)蛋白質(zhì)。同一基因組在不同細(xì)胞、不同組織中的表達(dá)情況各不相同，即使是同一細(xì)胞，在不同的發(fā)育階段、不同的生理?xiàng)l件甚至不同的環(huán)境影響下，其蛋白質(zhì)的存在狀態(tài)也不相同。因此，蛋白質(zhì)組是一個(gè)在空間和時(shí)間上動(dòng)態(tài)變化著的整體。而蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）是指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門(mén)新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與

6、細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律。研究?jī)?nèi)容主要包括：了解某種特定的細(xì)胞、組織或器官制造的蛋白質(zhì)種類(lèi)；明確各種蛋白質(zhì)分子是如何形成類(lèi)似于電路的網(wǎng)絡(luò)的；描繪蛋白質(zhì)的精確三維結(jié)構(gòu)，揭示其結(jié)構(gòu)上的關(guān)鍵部位與藥物結(jié)合并且決定其活性的部位。蛋白質(zhì)組概念的提出標(biāo)志著生命科學(xué)的一個(gè)嶄新時(shí)代蛋白質(zhì)組時(shí)代已經(jīng)開(kāi)始，它是繼基因組研究之后的又一“大學(xué)科”。即以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，在蛋白質(zhì)多肽譜和基因產(chǎn)物圖譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一門(mén)科學(xué)，是通過(guò)對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物蛋白質(zhì)進(jìn)行整體、動(dòng)態(tài)、定量水平上的研究來(lái)闡述環(huán)境、疾病、藥物等對(duì)細(xì)胞代謝的影響，并分析其主要作用機(jī)理、解釋基因表達(dá)調(diào)節(jié)的主要方式。要對(duì)“全部蛋白質(zhì)”進(jìn)行研究是非常困難的，功能蛋白

7、質(zhì)組學(xué)的提出解決了這一難題，其研究對(duì)象是功能蛋白質(zhì)組，即細(xì)胞在一定階段或與某一生理現(xiàn)象相關(guān)的所有蛋白質(zhì)，它是介于對(duì)個(gè)別蛋白質(zhì)的傳統(tǒng)蛋白質(zhì)化學(xué)研究和以全部蛋白質(zhì)為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)研究之間的層次，并把目標(biāo)定位在蛋白質(zhì)群體上，這一群體可大可小，從局部入手研究蛋白質(zhì)組的各個(gè)功能亞群體，以便把多個(gè)亞群體組合起來(lái)，逐步描繪出接近于生命細(xì)胞的“全部蛋白質(zhì)”的蛋白質(zhì)組圖譜。功能蛋白質(zhì)組學(xué)從理論和技術(shù)上使以“全部蛋白質(zhì)”為研究對(duì)象的蛋白質(zhì)組學(xué)更具體化，更易于從時(shí)、空、量效方面動(dòng)態(tài)、整體、深入地研究生理狀態(tài)下同一組織細(xì)胞在不同發(fā)育階段或同一組織細(xì)胞在不同個(gè)體間或同一基因組在不同組織細(xì)胞間，以及病理情況下同一疾

8、病的不同發(fā)展階段的蛋白質(zhì)表達(dá)模式和功能模式的變化，揭示一些重要的生命現(xiàn)象和一些重大疾病的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。二、蛋白質(zhì)組學(xué)的產(chǎn)生與發(fā)展20世紀(jì)中期以來(lái)，隨著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的提出和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的X射線(xiàn)解析，開(kāi)始了分子生物學(xué)時(shí)代，對(duì)遺傳信息載體DNA和生命功能的主要體現(xiàn)者蛋白質(zhì)的研究，成為生命科學(xué)研究的主要內(nèi)容。90年代初期，美國(guó)生物學(xué)家提出并實(shí)施了人類(lèi)基因組計(jì)劃，經(jīng)過(guò)各國(guó)科學(xué)家多年的努力，人類(lèi)基因組計(jì)劃取得了巨大成績(jī)，一些低等生物的DNA序列已被闡明，人類(lèi)DNA序列的框架圖已經(jīng)測(cè)定，迄今已測(cè)定的表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)幾乎覆蓋了人類(lèi)所有基因。在這樣的形勢(shì)下，生命科學(xué)已進(jìn)入了后基因組時(shí)代。在后基因組時(shí)

9、代，生物學(xué)研究的重點(diǎn)已從揭示生命所有遺傳信息轉(zhuǎn)移到在整體水平上對(duì)生物功能的研究。這種轉(zhuǎn)向的第一個(gè)標(biāo)志就是產(chǎn)生了一門(mén)稱(chēng)為功能基因組學(xué)的新科學(xué)。功能基因組學(xué)的主要任務(wù)是解析和綜合大量的遺傳信息，闡明基因遺傳信息與人類(lèi)生命活動(dòng)之間的聯(lián)系?；虻墓δ苁峭ㄟ^(guò)其產(chǎn)物mRNA和蛋白質(zhì)來(lái)體現(xiàn)的。近年來(lái)利用基因表達(dá)系列分析(serialanalysisofgeneexpressio，nSAGE)、微陣列(microarray)和DNA芯片(chip)等新技術(shù)研究mRNA水平上的基因活動(dòng)規(guī)律取得了較大進(jìn)展。但mRNA水平的基因表達(dá)狀況并不能完全代表蛋白質(zhì)水平的狀況，mRNA與蛋白質(zhì)間的相關(guān)系數(shù)僅為0.40.5,蛋

10、白質(zhì)才是生命功能的主要執(zhí)行者，它存在著翻譯后的加工修飾、轉(zhuǎn)移定位、構(gòu)象變化、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)與其它生物大分子相互作用等自身特點(diǎn)，難以從DNA和mRNA水平得到解答，從而促使人們從組織或細(xì)胞內(nèi)整體蛋白質(zhì)的組成、表達(dá)和功能模式去研究生命活動(dòng)的基本規(guī)律。自“蛋白質(zhì)組”概念提出并開(kāi)始從整體蛋白質(zhì)水平研究生命現(xiàn)象以來(lái)，蛋白質(zhì)組研究在國(guó)際上進(jìn)展十分迅速。不論是基礎(chǔ)理論，還是技術(shù)方法，都在不斷地進(jìn)步和完善。許多種細(xì)胞的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)已經(jīng)建立，相應(yīng)的國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)站也層出不窮，眾多的制藥廠和公司在巨大財(cái)力的支持和商業(yè)利益的誘惑下紛紛加入蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域，蛋白質(zhì)組研究的文章每年成倍增長(zhǎng)。1996年澳大利亞建立

11、了世界上第一個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心(AustraliaProteomeAnalysisFacility，APAF)，得到了政府部門(mén)的大力支持。同年丹麥、加拿大也先后成立了國(guó)家蛋白質(zhì)組研究中心，隨后美國(guó)、丹麥、瑞士、瑞典、英國(guó)、法國(guó)、意大利、日本和德國(guó)等也加入了蛋白質(zhì)組研究行列。國(guó)際著名學(xué)府如哈佛、斯坦福、耶魯、密西根、華盛頓大學(xué)、歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室、巴士德研究所、瑞士聯(lián)邦工業(yè)學(xué)院均擠身此類(lèi)研究。如美國(guó)國(guó)立癌癥研究院（NCI）投資1000萬(wàn)美元建立肺、直腸、乳腺、卵巢月中瘤的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。NCI和FDA共同投資數(shù)百萬(wàn)美元建立癌癥不同階段的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。英國(guó)建立三個(gè)蛋白質(zhì)組研究中心對(duì)已完成或即將

12、完成全基因組測(cè)序的生物體進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。獨(dú)立完成人類(lèi)基因組測(cè)序的Celera公司投資上億美元獨(dú)自啟動(dòng)了全面鑒定和分類(lèi)匯總?cè)祟?lèi)組織、細(xì)胞和體液中的蛋白質(zhì)及其異構(gòu)體，構(gòu)建新一代的蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)的工作，以幫助研究者更深入了解細(xì)胞生理和病理過(guò)程，并為藥物的開(kāi)發(fā)選擇靶分子。1997年召開(kāi)了第一次國(guó)際“蛋白質(zhì)組學(xué)”會(huì)議，預(yù)測(cè)21世紀(jì)生命科學(xué)的重心將從基因組學(xué)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)組學(xué)，為生命科學(xué)和醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的研究帶來(lái)了新的生機(jī)。1998年在美國(guó)舊金山召開(kāi)了第二屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議，參加者大都來(lái)自各大藥廠和公司。1999年1月在英國(guó)倫敦舉行了應(yīng)用蛋白質(zhì)組會(huì)議。1999年5月在日本召開(kāi)的國(guó)際電泳會(huì)議上，約三分之一的

13、文章與蛋白質(zhì)組有關(guān)。我國(guó)也于1998年啟動(dòng)了蛋白質(zhì)組學(xué)研究。1998年在中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所舉辦了兩次全國(guó)性的蛋白質(zhì)組學(xué)研討會(huì)，并在此基礎(chǔ)上，提出了功能蛋白質(zhì)組學(xué)的研究戰(zhàn)略。科技部已將疾病蛋白質(zhì)組研究列入我國(guó)“973”計(jì)劃項(xiàng)目和“863”計(jì)劃項(xiàng)目；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)也將“蛋白質(zhì)組研究”列為重點(diǎn)項(xiàng)目。我國(guó)在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白質(zhì)組研究方面取得了較大的進(jìn)展，并且于2003成立了中國(guó)人類(lèi)蛋白質(zhì)組組織（CHHUPO）。并分別于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召開(kāi)了中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)首屆、第二屆及第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)，于2004年10月在中國(guó)北京召開(kāi)了第三屆國(guó)際蛋白質(zhì)組學(xué)會(huì)議

14、。因此，蛋白質(zhì)科學(xué)及技術(shù)已經(jīng)成為21世紀(jì)生命科學(xué)與生物技術(shù)的重要戰(zhàn)略前沿，是生命科學(xué)突破與生物技術(shù)創(chuàng)新的必由之路，并且成為生命科學(xué)與生物技術(shù)引領(lǐng)自然科學(xué)與技術(shù)的龍頭。第二節(jié)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法概述蛋白質(zhì)組研究比基因組研究更復(fù)雜和困難，一方面，蛋白質(zhì)的數(shù)目大大超過(guò)基因的數(shù)目。人基因組有2.54.0萬(wàn)個(gè)編碼基因，而其表達(dá)的蛋白質(zhì)可達(dá)十幾萬(wàn)或更多；另一方面，基因是相對(duì)靜態(tài)的，一種生物僅有一個(gè)基因組，而蛋白質(zhì)是動(dòng)態(tài)的，即隨時(shí)間和空間而變化，同時(shí)還有著復(fù)雜的翻譯后修飾。組成蛋白質(zhì)的氨基酸有20種，加上修飾的氨基酸則更多，而DNA僅4種核苷酸組成。因此，發(fā)展高通量、高靈敏度、高準(zhǔn)確性的研究技術(shù)平臺(tái)是現(xiàn)在乃至

15、相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的主要任務(wù)。最初的蛋白質(zhì)組學(xué)主要是研究蛋白質(zhì)組的組成成分，即蛋白質(zhì)組表達(dá)模式(expressionprofile)。蛋白質(zhì)組表達(dá)模式研究的支撐技術(shù)主要有雙向凝膠電泳和以質(zhì)譜為代表的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)及生物信息學(xué)。隨著學(xué)科的發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究范圍不斷擴(kuò)展，蛋白質(zhì)組功能模式的研究不斷深入。蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的研究已成為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要部分。一、蛋白質(zhì)組表達(dá)模式的研究方法(一)蛋白質(zhì)組研究中的樣品制備通?？刹捎眉?xì)胞或組織中的全蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。也可以進(jìn)行樣品預(yù)分級(jí)，即采用各種方法將細(xì)胞或組織中的全體蛋白質(zhì)分成幾部分，分別進(jìn)行蛋白質(zhì)組研究。

16、樣品預(yù)分級(jí)的主要方法包括根據(jù)蛋白質(zhì)溶解性和蛋白質(zhì)在細(xì)胞中不同的細(xì)胞器定位進(jìn)行分級(jí)，如專(zhuān)門(mén)分離出細(xì)胞核、線(xiàn)粒體或高爾基體等細(xì)胞器的蛋白質(zhì)成分。樣品預(yù)分級(jí)不僅可以提高低豐度蛋白質(zhì)的上樣量和檢測(cè)，還可以針對(duì)某一細(xì)胞器的蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。對(duì)臨床組織樣本進(jìn)行研究，尋找疾病標(biāo)記，是蛋白質(zhì)組研究的重要方向之一。但臨床樣本都是各種細(xì)胞或組織混雜，而且狀態(tài)不一。如腫瘤組織中，發(fā)生癌變的往往是上皮類(lèi)細(xì)胞，而這類(lèi)細(xì)胞在腫瘤中總是與血管、基質(zhì)細(xì)胞等混雜。所以，常規(guī)采用的癌和癌旁組織或腫瘤與正常組織進(jìn)行差異比較，實(shí)際上是多種細(xì)胞甚至組織蛋白質(zhì)組混合物的比較。最近在組織水平上的蛋白質(zhì)組樣品制備方面已有新的進(jìn)展，如采用激光

17、捕獲顯微切割(lasercapturemicrodissection，LCM)方法可直接在顯微鏡下從組織切片中精確分離特定的細(xì)胞或細(xì)胞群。(二)蛋白質(zhì)組研究中的樣品分離利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量通過(guò)雙向凝膠電泳(two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)的方法將各種蛋白質(zhì)區(qū)分開(kāi)來(lái)是最主要的基于膠的蛋白質(zhì)組學(xué)分離技術(shù)。雙向凝膠電泳(2-DE)技術(shù)于1975年首先由OFarrell等創(chuàng)立,其原理是第一向在高壓電場(chǎng)下對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行等電聚焦(IEF),再在第一向垂直方向上進(jìn)行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。第一向的IEF電泳，經(jīng)歷了從最初的載體兩性電解

18、質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳到80年代固相pH梯度等電聚焦電泳(immobilizedpHgradient:,IPG)的發(fā)展過(guò)程。盡管傳統(tǒng)的OFarrell系統(tǒng)雙向電泳有較高的分辨率，曾報(bào)道可以分離到約1000多種蛋白質(zhì)，但這種系統(tǒng)仍存在不少問(wèn)題，如重復(fù)性，特別是第一向因陰極漂移而丟失堿性蛋白質(zhì)，載體兩性電解質(zhì)pH梯度不穩(wěn)定，受電場(chǎng)和時(shí)間影響大，脲在低溫下容易在毛細(xì)管中析出影響聚合及蛋白質(zhì)分離等。1982年由Bjellgvist等發(fā)展并完善了固相pH梯度等電聚焦技術(shù)，G?rg(1997)等成功地將之應(yīng)用于雙向電泳的第一向分離，從而克服了載體兩性電解質(zhì)陰極漂移等許多缺點(diǎn)而得以建立非常穩(wěn)定的可以隨意精確

19、設(shè)定的pH梯度。由于可以建立很窄的pH范圍(如0.05U/cm)，對(duì)特別感興趣的區(qū)域可在較窄的pH范圍內(nèi)做第二輪分析，從而大大提高了分辨率及重復(fù)性。第二向SDS-PAGE有垂直板電泳和水平超薄膠電泳兩種做法，可分離10100kD分子量的蛋白質(zhì)。目前在一張雙向電泳圖譜上已可以分離到近萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)，并且該方法具有高靈敏度和高分辨率、便于計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像分析處理、可很好地與質(zhì)譜分析匹配等優(yōu)點(diǎn)，因而這仍是目前分離蛋白質(zhì)組分的最好方法，故而已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究不可缺少的核心技術(shù)。但隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究工作的深入，常規(guī)的2-DE已顯出其本身固有的局限性，因此對(duì)2-DE技術(shù)也仍在不斷完善和改進(jìn)之中，或者探索新的

20、途徑和思路以補(bǔ)充目前所使用的常規(guī)2-DE技術(shù)，如Pharmacia公司推出了2DE-MS自動(dòng)化系統(tǒng)以及大通量的2-DE技術(shù)，在第二向電泳中發(fā)展了6-12塊膠同時(shí)電泳的Ettan系統(tǒng)，從而加快電泳速度和電泳的重復(fù)性，并推出了自動(dòng)取點(diǎn)、酶解，以使2-DE膠上所有樣品的酶解和轉(zhuǎn)移能平行化進(jìn)行。前面已提到2-DE技術(shù)由于其高分辨率而得到廣泛應(yīng)用，但其有難以克服的缺點(diǎn)，如極酸、極堿性蛋白質(zhì)，疏水性蛋白質(zhì)，極大蛋白質(zhì)、極小蛋白質(zhì)以及低豐度蛋白質(zhì)用此種技術(shù)難于有效分離。而且此技術(shù)路線(xiàn)采用的膠內(nèi)酶解過(guò)程也費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，難于與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。為彌補(bǔ)雙向凝膠電泳技術(shù)的缺陷，促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究，目前發(fā)展了許多新型

21、高分辨率、高通量、高峰容量的分離分析的非凝膠技術(shù)，如液相色譜法(liquidchromatography，LC)、毛細(xì)管電泳技術(shù)(capillaryelectrophoresisCE)等得到發(fā)展并在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，這些非凝膠技術(shù)的應(yīng)用簡(jiǎn)化了蛋白質(zhì)組研究步驟，又可與質(zhì)譜聯(lián)用實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，是2-DE技術(shù)路線(xiàn)的有效補(bǔ)充。其中液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS/MS)是近幾年來(lái)發(fā)展迅速的新方法。蛋白質(zhì)混合物直接通過(guò)液相色譜分離以代替2-DE的分離，然后進(jìn)入MS系統(tǒng)獲得肽段分子量，再通過(guò)串聯(lián)MS技術(shù)，得到部分序列信息，最后通過(guò)計(jì)算機(jī)聯(lián)網(wǎng)查詢(xún)、鑒定蛋白質(zhì)。Opiteck等首次報(bào)道多維色譜技術(shù)(LC/LC-M

22、S/MS)，該技術(shù)根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)，即帶電性及疏水性不同，用MS分離多肽復(fù)合物。Link等利用蛋白質(zhì)復(fù)合物直接分析(DALPC)方法對(duì)酵母80S核糖體的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離鑒定，其含有的78個(gè)蛋白質(zhì)中的71個(gè)得到準(zhǔn)確分離和鑒定，而在相同條件下，2-DE只得到了56個(gè)蛋白質(zhì)。Washburn等在多維LC-MS/MS的基礎(chǔ)上又應(yīng)用一種多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)(multidimensionalproteinidentficationtechnology)成功分離和鑒定出酵母的1484種蛋白質(zhì)，特別包括了一些在2-DE膠中難以獲得的低豐度蛋白質(zhì)。但目前多維LC-MS/MS技術(shù)主要作為2-DE-MS技術(shù)的補(bǔ)充，

23、尚不能取代2-DE在分離蛋白質(zhì)中的核心地位。進(jìn)一步研究和完善2-DE技術(shù)，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究仍具有重要戰(zhàn)略意義。(三)蛋白質(zhì)組研究中的樣品分析鑒定對(duì)分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的又一重要內(nèi)容，常用的鑒定技術(shù)有蛋白質(zhì)微量測(cè)序、氨基酸組成分析等，但這些方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不易實(shí)現(xiàn)高通量分析。一種新的蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)質(zhì)譜(MS)法受到了人們的重視和應(yīng)用，它是目前蛋白質(zhì)組研究中發(fā)展最快，也最具活力和潛力的技術(shù)。其基本原理是樣品分子離子化后，根據(jù)離子間質(zhì)荷比(m/z)的差異來(lái)分離并確定樣品的分子量。質(zhì)譜在20世紀(jì)初就已經(jīng)產(chǎn)生，多用于無(wú)機(jī)物或小分子有機(jī)物的鑒定，直到80年代末隨著“軟電離”技術(shù)的出現(xiàn)而進(jìn)

24、入生物大分子(如蛋白質(zhì))的鑒定領(lǐng)域。所謂“軟電離”是指樣品分子電離時(shí)保留整個(gè)分子的完整性，不會(huì)形成碎片離子。軟電離質(zhì)譜用于大分子的鑒定，主要有以下特點(diǎn)：靈敏度高、快速、能同時(shí)提供樣品的精確分子量和結(jié)構(gòu)信息、既可定性又可定量、并能有效地與各種色譜聯(lián)用來(lái)分析復(fù)雜體系。目前用于蛋白質(zhì)鑒定的質(zhì)譜主要有兩種：電噴霧質(zhì)譜(electrosprayionizationmassspectrometr，yESI-MS)和基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeofflightmassspectrometry，MALDI-TOF

25、MS)。而以此為基礎(chǔ)鑒定和注釋蛋白質(zhì)主要通過(guò)兩種路線(xiàn)，一種是通過(guò)肽質(zhì)譜指紋圖(peptidemassfingerprinting，PMF)和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配的路線(xiàn)，進(jìn)行這種分析的質(zhì)譜儀首選是MALDI-TOF質(zhì)譜儀，另一種是通過(guò)測(cè)出樣品中部分肽段二級(jí)質(zhì)譜信息或氨基酸序列標(biāo)簽和數(shù)據(jù)庫(kù)搜尋匹配的路線(xiàn)，適合于進(jìn)行這種分析的儀器主要是電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜儀。通過(guò)質(zhì)譜對(duì)雙向凝膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行鑒定的實(shí)驗(yàn)路線(xiàn)蛋白質(zhì)組研究中雙向電泳技術(shù)（2-DE）仍然是分離蛋白質(zhì)的主導(dǎo)技術(shù)，對(duì)2-DE膠上蛋白質(zhì)點(diǎn)的鑒定，目前普遍認(rèn)為MALDI-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行PMF分析是合適的第一步。而MALDI-TOF質(zhì)譜儀由于其靈敏度高（可達(dá)

26、fmol），分析速度快，譜圖簡(jiǎn)單易于解析以及受緩沖液、鹽份的干擾小等諸多優(yōu)點(diǎn)，非常適合于進(jìn)行PMF分析。對(duì)于那些數(shù)據(jù)庫(kù)比較完善的蛋白質(zhì)組樣品，在較好的儀器分析狀態(tài)下，2-DE膠上的蛋白質(zhì)點(diǎn)通過(guò)PMF方法鑒定的成功率可達(dá)50以上。目前很多廠家都在MALDI-TOF質(zhì)譜儀上配有自動(dòng)數(shù)據(jù)搜尋分析軟件，不僅使儀器能直接給出蛋白質(zhì)鑒定的結(jié)果而且使分析的通量大大增加，一臺(tái)儀器一天之內(nèi)分析數(shù)百個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)已不是很困難的事。然而單靠PMF路線(xiàn)來(lái)鑒定蛋白質(zhì)并非總能獲得成功，經(jīng)常有獲得的肽質(zhì)譜指紋圖在數(shù)據(jù)庫(kù)中得不到可靠的匹配的情況。其可能的原因有（1）由于樣品量太少，PMF圖的信噪比太低，因而輸入庫(kù)中搜尋的數(shù)據(jù)質(zhì)量

27、不好；（2）2-DE膠上所取的一個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)并非單一蛋白質(zhì)，所獲得的PMF圖實(shí)際上是兩個(gè)以上蛋白質(zhì)PMF圖的混合圖；（3）操作中角蛋白或其他蛋白質(zhì)的污染；（4）該蛋白質(zhì)發(fā)生了較多的轉(zhuǎn)譯后修飾，數(shù)據(jù)庫(kù)中未有記載；（5）所用胰蛋白酶質(zhì)量不夠好，蛋白酶自酶解片段多；（6）所分析的蛋白質(zhì)是一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有的未知的新蛋白質(zhì)；（7）有些生物材料的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)規(guī)模太小。因而在上述情況下，為了要對(duì)PMF方法未能鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定，可通過(guò)其他質(zhì)譜技術(shù)獲得該蛋白質(zhì)一段或數(shù)段多肽的串聯(lián)質(zhì)譜信息或序列標(biāo)簽（sequencetag并將其輸入數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行搜尋來(lái)鑒定該蛋白質(zhì)。當(dāng)前進(jìn)行這一工作的質(zhì)譜儀多用電噴霧串行質(zhì)譜儀。尤

28、其普遍的是ESI-離子肼和ESI三級(jí)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，采用MALDI-TOF質(zhì)譜儀的源后裂解功能（PSD），也能獲得多肽片段離子的信息并推導(dǎo)出序列，但成功率一般低于ESI-MS/MS。近年研究中發(fā)展起來(lái)的基質(zhì)輔助激光解吸附電離串行飛行時(shí)間（MALDI-TOF/TOF）質(zhì)譜技術(shù)能更進(jìn)一步提高蛋白質(zhì)序列標(biāo)簽測(cè)定的通量和準(zhǔn)確性。與此同時(shí)，儀器的自動(dòng)化和相關(guān)實(shí)驗(yàn)的整合使通過(guò)質(zhì)譜鑒定的技術(shù)更加高通量化。但要精確鑒定某一蛋白質(zhì)通常還得聯(lián)合幾種鑒定技術(shù)。最近，國(guó)外建立了一種將MALDI-MS技術(shù)直接應(yīng)用于組織切片或印片的方法，即組織切片或印片原位質(zhì)譜分析技術(shù)，取得了較滿(mǎn)意的結(jié)果。當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的核心技

29、術(shù)就是雙向凝膠電泳質(zhì)譜技術(shù)，即通過(guò)雙向凝膠電泳將蛋白質(zhì)分離，然后利用質(zhì)譜對(duì)蛋白質(zhì)逐一進(jìn)行鑒定。對(duì)于蛋白質(zhì)鑒定而言，高通量、高靈敏度和高精度是三個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。一般的質(zhì)譜技術(shù)難以將三者合一，而最近發(fā)展的新型質(zhì)譜如兩級(jí)飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（MALDI-TOF/TOF）、傅里葉轉(zhuǎn)換回旋共振質(zhì)譜（FTMS）使蛋白質(zhì)鑒定的靈敏性、可靠性和通量進(jìn)一步提高，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)準(zhǔn)確和大規(guī)模的鑒定。另外，表面增強(qiáng)激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)在臨床蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)應(yīng)用基因芯片的設(shè)計(jì)理念，把層析、質(zhì)譜等技術(shù)合理應(yīng)用于蛋白芯片的檢測(cè)，它不需進(jìn)行蛋白質(zhì)的雙向電泳，能快速、簡(jiǎn)便

30、地鑒定少量生物樣本（組織和細(xì)胞抽提物、血液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)上清等）中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。該技術(shù)在尋找腫瘤標(biāo)志物方面已展現(xiàn)廣闊的前景，如基于SELDI-TOF-MS蛋白質(zhì)芯片分析的卵巢癌、乳腺癌等腫瘤的血清診斷模式已建立。（四）蛋白質(zhì)組學(xué)研究的生物信息學(xué)生物信息學(xué)是隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃、計(jì)算機(jī)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)技術(shù)的發(fā)展而誕生的一門(mén)新興學(xué)科，是蛋白質(zhì)組學(xué)的一個(gè)重要的技術(shù)平臺(tái)。生物信息學(xué)研究生物信息的采集、加工、分析、存儲(chǔ)、傳播等各個(gè)方面，它通過(guò)綜合應(yīng)用數(shù)學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、工程科學(xué)以及生物學(xué)的技術(shù)來(lái)分析大量而復(fù)雜的生物學(xué)數(shù)據(jù)而揭示生物學(xué)的奧秘。生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的一個(gè)不可缺少的部分，其在蛋白質(zhì)組學(xué)中的研

31、究有兩個(gè)重要應(yīng)用：一是構(gòu)建和分析雙向凝膠電泳圖譜，二是數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索與構(gòu)建。蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)是蛋白質(zhì)組研究水平的標(biāo)志和基礎(chǔ)。瑞士的SWISS-PROT擁有目前世界上最大，種類(lèi)最多的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。丹麥、英國(guó)、美國(guó)等也都建立了各具特色的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)。目前應(yīng)用最普遍的數(shù)據(jù)庫(kù)是NRDB和dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)。NRDB由SWISS-PROT和GENPETP等幾個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)組成。dbEST是由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NationalCentreforBiotechnologyInformation，NCBI)和歐洲生物信息學(xué)研究所(EuropeanBioinformaticsInstitute，EBI）共同編輯

32、的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)，包括許多生物體的表達(dá)序列標(biāo)簽（expressedsequencetagsEST）。用肽序列標(biāo)簽（PST）或部分序列信息最適合查尋dbEST數(shù)據(jù)庫(kù)。最近有報(bào)道強(qiáng)調(diào)用蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)查尋EST數(shù)據(jù)庫(kù)以鑒定研究者最感興趣的未知蛋白質(zhì)的重要性，表明人類(lèi)EST數(shù)據(jù)庫(kù)能滿(mǎn)足用質(zhì)譜數(shù)據(jù)快速識(shí)別哺乳動(dòng)物多蛋白質(zhì)復(fù)合物的要求。生物信息學(xué)的發(fā)展已給蛋白質(zhì)組研究提供了更方便有效的計(jì)算機(jī)分析軟件；特別值得注意的是蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定軟件和算法發(fā)展迅速，如SWISS-PROT、Rockefeller大學(xué)、UCSF等都有自主的搜索軟件和數(shù)據(jù)管理系統(tǒng)。最近發(fā)展的質(zhì)譜數(shù)據(jù)直接搜尋基因組數(shù)據(jù)庫(kù)使得質(zhì)譜數(shù)據(jù)可直接進(jìn)行基

33、因注釋、判斷復(fù)雜的拼接方式。隨著基因組學(xué)的迅速推進(jìn)，會(huì)給蛋白質(zhì)組研究提供更多更全的數(shù)據(jù)庫(kù)。另外，對(duì)肽序列標(biāo)記的從頭測(cè)序軟件也十分引人注目。（五）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的深入發(fā)展，人們已不再滿(mǎn)足對(duì)一個(gè)混合體系中的蛋白質(zhì)進(jìn)行簡(jiǎn)單的定性分析，要求更加準(zhǔn)確的定量分析。為此，有人提出了“定量蛋白質(zhì)組學(xué)”的概念。定量蛋白質(zhì)組學(xué)，就是把一個(gè)基因組表達(dá)的全部蛋白質(zhì)或一個(gè)復(fù)雜體系中所有的蛋白質(zhì)進(jìn)行精確的定量和鑒定。這一概念的提出，標(biāo)志著蛋白質(zhì)組學(xué)研究已從對(duì)蛋白質(zhì)的簡(jiǎn)單定性向精確定量方向發(fā)展，并且成為當(dāng)前蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組研究和基因組研究相比最大的不同和難點(diǎn)之一是定量，而蛋白質(zhì)表達(dá)量的

34、差異又是影響生物功能的重要因素。蛋白質(zhì)組定量技術(shù)現(xiàn)在還處于起步階段，也面臨很多難點(diǎn)：首先，對(duì)低豐度蛋白質(zhì)檢測(cè)的困難顯然阻礙對(duì)這些蛋白質(zhì)的定量。其次，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)量差異很小，如在50%以下時(shí)，精確定量成為瓶頸。另外，生物體系中蛋白質(zhì)表達(dá)瞬時(shí)變化的捕捉是樣品制備中需要關(guān)注的問(wèn)題，總之，蛋白質(zhì)組定量技術(shù)的研究和應(yīng)用還任重道遠(yuǎn)。目前定量蛋白質(zhì)組研究策略主要有：基于雙向凝膠電泳的定量蛋白質(zhì)組研究策略和基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究策略等。1基于雙向凝膠電泳的定量蛋白質(zhì)組研究策略雙向凝膠電泳（2-DE）作為蛋白質(zhì)組學(xué)的主要技術(shù)伴隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展而發(fā)展，是目前唯一能分離展示大量蛋白質(zhì)并進(jìn)行蛋白質(zhì)定量分析

35、的一種方法，具有高通量、重復(fù)性好、分辨率極高、敏感性較高等優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)分離和定量數(shù)千種甚至上萬(wàn)種蛋白。雖然它有許多不盡如人意的地方,但依然是蛋白質(zhì)組研究的一個(gè)重要手段，在蛋白質(zhì)分離和定量分析中顯示其獨(dú)特的魅力。在傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳上比較兩種存在差異表達(dá)的蛋白質(zhì)組樣品時(shí)，要將其總蛋白分別展現(xiàn)在不同的凝膠上。由于雙向凝膠電泳重復(fù)性的問(wèn)題，每種樣品通常需做多次電泳，以獲得圖像的電子“平均值”，從而使二者間的比較更有把握。同時(shí)，考馬斯亮藍(lán)與銀染蛋白質(zhì)點(diǎn)定量上線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍較窄，為蛋白質(zhì)點(diǎn)的精確定量比較帶來(lái)限制。熒光差異顯示雙向電泳（F-2D-DIGE）是在傳統(tǒng)雙向凝膠電泳基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的定量分析凝膠蛋白

36、質(zhì)點(diǎn)的新方法，其優(yōu)點(diǎn)是可以在同一塊凝膠上比較兩種不同來(lái)源或不同處理的蛋白質(zhì)組表達(dá)，能比較精確地在較寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)對(duì)研究者感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量，因此成為一種有較好應(yīng)用前景的定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。該方法首先將待比較的幾個(gè)樣品的總蛋白分別用兩種不同的熒光標(biāo)記試劑（Cy2、Cy3或Cy5）進(jìn)行標(biāo)記，然后將不同熒光染料標(biāo)記的幾種待比較蛋白質(zhì)等量混合，上樣進(jìn)行雙向電泳，2-DE凝膠在成像儀上用不同的波長(zhǎng)激發(fā)，分別將樣品的熒光圖譜成像，用2D分析軟件進(jìn)行定量分析，對(duì)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)用MALDI-TOF-MS或ESI-MS進(jìn)行鑒定。熒光差異顯示雙向電泳（亦稱(chēng)熒光差示雙向電泳）與傳統(tǒng)的雙向凝膠電泳最大的差別在

37、于前者采用了熒光試劑來(lái)標(biāo)記蛋白質(zhì)并通過(guò)熒光成像以獲取電泳圖像。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可以在同一塊凝膠上比較兩種不同來(lái)源或不同處理樣本的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，能在較寬的動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)精確地對(duì)感興趣的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。2基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組研究策略由于不同蛋白質(zhì)和多肽在質(zhì)譜儀中離子化能力不同，質(zhì)譜儀檢測(cè)得到的信號(hào)對(duì)來(lái)自單一樣品的蛋白質(zhì)并不具有定量功能，所以從質(zhì)譜圖中不能得到量的信息。但是對(duì)于具有相同離子化能力的蛋白質(zhì)或多肽，可以通過(guò)比較質(zhì)譜峰的強(qiáng)度（或峰面積）得到待比較蛋白質(zhì)的相對(duì)量。根據(jù)這一原理發(fā)展了基于生物質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法。Oda和Gygi等人最先利用此原理，用一種質(zhì)量標(biāo)簽標(biāo)記一種狀態(tài)下的蛋白質(zhì)

38、，然后與另一種狀態(tài)下沒(méi)有標(biāo)記的蛋白質(zhì)混合起來(lái)，進(jìn)行質(zhì)譜分析，通過(guò)比較某蛋白質(zhì)沒(méi)有標(biāo)記的峰和標(biāo)記后峰的強(qiáng)弱，就得到這種蛋白質(zhì)在兩種狀態(tài)下表達(dá)量的變化。這里經(jīng)常用到的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)就是穩(wěn)定同位素（如2D、13C、18O和15N）標(biāo)記的小分子，這些小分子必須滿(mǎn)足一定的條件：不同樣品來(lái)源的肽段標(biāo)記后化學(xué)性質(zhì)是相同的；若與高效液相色譜聯(lián)用，標(biāo)記后肽段的保留時(shí)間要盡可能相同。二、蛋白質(zhì)組功能模式的研究方法蛋白質(zhì)功能模式的研究是蛋白質(zhì)組研究的最終目標(biāo)。其主要研究目標(biāo)是要揭示蛋白質(zhì)組成員間的相互作用、相互協(xié)調(diào)的關(guān)系，并深入了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的相互關(guān)系，以及基因結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系。蛋白質(zhì)翻譯后修飾和蛋白質(zhì)

39、-蛋白質(zhì)相互作用的研究已成為蛋白質(zhì)組學(xué)的重要部分。近年來(lái)，隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展，發(fā)展了許多有效的功能蛋白質(zhì)組研究方法，如酵母雙雜交系統(tǒng)、噬菌體展示、生物傳感芯片質(zhì)譜、基因工程和蛋白質(zhì)工程中的突變表達(dá)分析、核磁共振成像、X線(xiàn)晶體衍射分析、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。（一）蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，對(duì)生物體器官、組織或細(xì)胞的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)組學(xué)的一項(xiàng)重要任務(wù)。蛋白質(zhì)在翻譯中或翻譯后會(huì)在氨基酸鏈上共價(jià)結(jié)合各種非肽類(lèi)基團(tuán)，形成翻譯后修飾，這些修飾能影響蛋白質(zhì)的物理、化學(xué)性質(zhì)、折疊狀態(tài)、構(gòu)象分布、穩(wěn)定性以及活性，而且翻譯后修飾本身可作為一個(gè)

40、附加功能基團(tuán)發(fā)揮作用。生物體能迅速對(duì)體內(nèi)環(huán)境變化和外界環(huán)境刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，這些反應(yīng)過(guò)程靠復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)，其中大多數(shù)調(diào)控機(jī)制是由蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化所介導(dǎo)的。而蛋白質(zhì)本身的構(gòu)象變化常常是通過(guò)變構(gòu)效應(yīng)和蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上發(fā)生的各種共價(jià)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)的。蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括:糖基化、二硫鍵的配對(duì)、甲基化、乙?；?、羧基化、焦谷氨酸化、蛋白質(zhì)降解、S-硝酸化以及ADP核糖基化等二十多種，是蛋白質(zhì)行使正常生理功能所必需的。有些修飾基團(tuán)只出現(xiàn)在蛋白的N端，與氨基酸種類(lèi)無(wú)關(guān)；有些卻只出現(xiàn)在某幾個(gè)氨基酸殘基上，與氨基酸位置無(wú)關(guān)；還有些修飾現(xiàn)象既與氨基酸種類(lèi)有關(guān)，又與其位置有關(guān)。這些修飾基團(tuán)會(huì)影響蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量

41、和等電點(diǎn)，使其在雙向電泳膠上偏離其理論位置。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾與其活性及功能狀態(tài)有關(guān)，也與蛋白質(zhì)所在細(xì)胞的種類(lèi)和生命周期相關(guān)。完全理解特定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系需要掌握多方面的信息，而不僅僅是它的氨基酸序列，翻譯后修飾也是非常重要的信息。但是目前蛋白質(zhì)翻譯后修飾的研究面臨著以下困難：其一、被翻譯后修飾的蛋白質(zhì)經(jīng)常只是很少的拷貝數(shù)，因此修飾肽的檢測(cè)需要高靈敏度的方法；第二、蛋白質(zhì)翻譯后修飾要求在確定其修飾位點(diǎn)和修飾數(shù)目的同時(shí)進(jìn)行定量分析；第三、蛋白質(zhì)多肽之間的鍵經(jīng)常是脆弱的，很難找到一定的條件使得在修飾狀態(tài)下進(jìn)行處理和電離；第四、已經(jīng)有超過(guò)400種蛋白質(zhì)翻譯后修飾被發(fā)現(xiàn)，且所有可能修飾蛋白質(zhì)序列

42、的測(cè)定工作是巨大的。所以，盡管二維凝膠電泳和質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組技術(shù)不斷完善，但是從整體上了解蛋白質(zhì)的翻譯后修飾正面臨著巨大的挑戰(zhàn)。隨著質(zhì)譜技術(shù)的靈敏度和準(zhǔn)確度的大大提高，質(zhì)譜已經(jīng)成為分析蛋白質(zhì)翻譯后修飾的中堅(jiān)力量，目前蛋白質(zhì)翻譯后的修飾的解析主要采用電噴霧（ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸電離（MALDI）兩種質(zhì)譜技術(shù)。蛋白質(zhì)的糖基化和磷酸化修飾在生命活動(dòng)中具有重要的調(diào)控作用，是最常見(jiàn)、最重要的共價(jià)修飾方式，是目前蛋白質(zhì)組中翻譯后修飾研究的熱點(diǎn)。（二）蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)生命的基本過(guò)程就是不同功能蛋白質(zhì)在時(shí)空上有序和協(xié)同作用的結(jié)果。越來(lái)越多的研究顯示：細(xì)胞中絕大多數(shù)的酶和調(diào)控過(guò)程是以蛋白質(zhì)復(fù)合體或多蛋

43、白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)的。另外，細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及病原體感染和免疫反應(yīng)等都是蛋白質(zhì)相互識(shí)別和相互作用的結(jié)果。由于生命活動(dòng)的過(guò)程與蛋白質(zhì)的相互作用密不可分，因此，蛋白質(zhì)相互作用的研究成為了功能蛋白質(zhì)組學(xué)的重要內(nèi)容，現(xiàn)就蛋白質(zhì)相互作用研究的主要方法簡(jiǎn)介如下。1酵母雙雜交系統(tǒng)細(xì)胞中含有多種蛋白質(zhì)，其中包括許多蛋白質(zhì)體系，如多酶復(fù)合體、多肽激素與受體，酶和底物蛋白等，通過(guò)直接分離的方法獲得某種細(xì)胞蛋白并對(duì)其進(jìn)行研究是一個(gè)非常棘手的問(wèn)題。但是我們知道，任何細(xì)胞蛋白質(zhì)都是由染色體上的相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄出mRNA并進(jìn)行翻譯的產(chǎn)物，細(xì)胞cDNA文庫(kù)在理論上含有編碼細(xì)胞全部蛋白質(zhì)的基因，因此，將細(xì)胞cDNA文庫(kù)插入適當(dāng)?shù)娜?/p>

44、合表達(dá)載體，即可獲得一個(gè)細(xì)胞蛋白質(zhì)文庫(kù)，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因的遺傳操作便可間接研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，確證和篩選已知蛋白質(zhì)的完整配體并闡明其生物學(xué)特性。1989年Field和Song等人在酵母細(xì)胞中設(shè)計(jì)了一種巧妙的、新的分析蛋白質(zhì)相互作用的方法酵母雙雜交系統(tǒng)（yeasttwo-hybridsystem）。酵母雙雜交系統(tǒng)是以真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)和活性特點(diǎn)為基礎(chǔ)的。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)基本相似，由一個(gè)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA-bindingdomain，BD）和一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（transcriptionalactivatingdomain，AD）組成，這兩個(gè)區(qū)域?qū)τ谵D(zhuǎn)錄激活因子的

45、功能均是不可缺少的。酵母蛋白GAL4就是一個(gè)典型的轉(zhuǎn)錄激活因子，能轉(zhuǎn)錄活化酵母半乳糖苷酶（galactosidase）GAL1和GAL10基因。GAL4由881個(gè)氨基酸組成，N端1147位氨基酸含細(xì)胞核定位序列（NLS）和與酵母GAL1基因啟動(dòng)子上游激活序列（upstreamactivationsequenceofGAL1,UASg）結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。UASg由4個(gè)17bp位點(diǎn)組成，每個(gè)17bp位點(diǎn)均能與GAL4BD區(qū)結(jié)合。GAL4C端768881位氨基酸含GAL1轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域相互獨(dú)立但功能上又互相依賴(lài)，它們之間只有通過(guò)某種方式結(jié)合在一起才具有完整的轉(zhuǎn)錄因子活性。根據(jù)GAL4的這一

46、特點(diǎn),研究者分別構(gòu)建了含GAL4BD和AD的兩個(gè)酵母融合蛋白表達(dá)載體，并經(jīng)過(guò)遺傳學(xué)操作建立了含特殊基因型、適用于雙雜交體分析的酵母菌株。這些菌株含UASG/GAL1/報(bào)道基因（LacZ、His3或Leu2）,缺失了內(nèi)源性編碼GAL4蛋白及其抑制蛋白GAL80的基因，突變了編碼色氨酸（Trp）,亮氨酸（Leu）和組氨酸（His）的基因，這樣酵母本身不能對(duì)GAL1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在缺乏Trp、Leu和His的培養(yǎng)中不能生長(zhǎng)，Leu、Trp和His成為選擇轉(zhuǎn)化酵母菌株的標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)中，將靶蛋白X基因克隆在酵母BD表達(dá)載體，能在酵母菌中表達(dá)由GAL4BD區(qū)和靶蛋白X組成的融合蛋白，將待篩選蛋白Y基因（或c

47、DNA文庫(kù)基因）插入至AD表達(dá)載體，它能表達(dá)由GAL4AD區(qū)和蛋白Y組成的融合蛋白，然后將兩個(gè)表達(dá)融合蛋白的載體轉(zhuǎn)入含報(bào)道基因的酵母菌株，如靶蛋白X和待篩選蛋白Y能相互結(jié)合，則GAL4的BD和AD區(qū)重建為具有功能的轉(zhuǎn)錄激活因子，活化報(bào)道基因UASG/GAL1/LacZ轉(zhuǎn)錄，陽(yáng)性菌落顯示明顯的Galactosidase活性，出現(xiàn)蘭色菌斑，從而達(dá)到從cDNA文庫(kù)中隨機(jī)篩選靶蛋白配體的目的（圖9-2）。除顏色篩選外，營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選也應(yīng)用較多，通過(guò)在缺乏相應(yīng)氨基酸（如Leu、His）的培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)與否來(lái)判斷報(bào)道基因UASG/GAL1/His3或Leu2是否表達(dá)。酵母雙雜交系統(tǒng)篩選相互作用蛋白流程圖酵

48、母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用具有如下主要特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：不僅能篩選（識(shí)別）已知蛋白質(zhì)的配體，而且能快速獲得蛋白質(zhì)的編碼基因，使蛋白質(zhì)表現(xiàn)型和基因型之間完美的聯(lián)系起來(lái)；可以篩選cDNA文庫(kù)中編碼的、與已知蛋白質(zhì)作用的成分；在細(xì)胞內(nèi)研究蛋白質(zhì)間相互作用，蛋白質(zhì)可保持天然構(gòu)象，能真實(shí)反應(yīng)體內(nèi)蛋白質(zhì)間相互作用情況，且可免受實(shí)驗(yàn)操作的影響；該方法是通過(guò)對(duì)編碼蛋白質(zhì)的基因進(jìn)行操作而間接研究蛋白質(zhì)間的相互作用，因此省去了分離靶蛋白這個(gè)非常棘手的問(wèn)題；該方法敏感性高，能檢測(cè)到較弱的一過(guò)性的蛋白質(zhì)之間相互作用。正由于此項(xiàng)技術(shù)具有上述優(yōu)點(diǎn)，使之廣泛用到分析蛋白之間的相互作用，至今，利用這一系統(tǒng)已證實(shí)和篩選出了大量具

49、有相互作用的蛋白質(zhì)，而且發(fā)現(xiàn)了許多新基因。近年來(lái)，在酵母雙雜交系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，又出現(xiàn)了酵母三雜交系統(tǒng)（yeastthree-hybridsystem）和酵母反向雙雜交系統(tǒng)（yeastreversetwo-hybridsystem）。酵母三雜交系統(tǒng)和反向雙雜交系統(tǒng)作為雙雜交系統(tǒng)的有益補(bǔ)充，在研究蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著日益重要的作用。酵母三雜交系統(tǒng)主要用于研究多蛋白質(zhì)復(fù)合體之間的相互作用，反向雙雜交系統(tǒng)可發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)間的結(jié)合解離，主要用于從大量突變體中直接篩選出導(dǎo)致蛋白質(zhì)間相互作用減弱的突變位點(diǎn)，以及發(fā)現(xiàn)可導(dǎo)致已知蛋白質(zhì)間特異相互作用發(fā)生解離的肽類(lèi)或其它小分子物質(zhì)。酵母雙雜交系統(tǒng)研究蛋白質(zhì)相互作用也存

50、在如下缺點(diǎn)：許多靶蛋白與GAL4BD融合后，具有轉(zhuǎn)錄激活報(bào)道基因的功能，從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果；如果蛋白質(zhì)需要通過(guò)翻譯后修飾才能發(fā)生相互作用，而這種特定的翻譯后修飾在酵母細(xì)胞中又不發(fā)生，則導(dǎo)致假陰性結(jié)果；它只能研究在核內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的相互作用，而且融合蛋白質(zhì)的構(gòu)建可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)本身的活性或折疊狀態(tài)，這些因素亦可導(dǎo)致假陰性結(jié)果。2噬菌體表面顯示技術(shù)噬菌體顯示技術(shù)（phagedisplay）是一種噬菌體表面表達(dá)篩選技術(shù)，該技術(shù)的建立基于下列三個(gè)基本因素：在噬菌體pin和pu衣殼蛋白的N端插入外源基因（待篩基因）編碼的蛋白，形成的融合蛋白，表達(dá)在噬菌體顆粒的表面；同時(shí)其保持的外源蛋白天然構(gòu)象也能被相

51、應(yīng)的抗體或受體識(shí)別；利用固定于固相支持物（如酶標(biāo)板）的篩選分子（抗體或受體），采用適當(dāng)?shù)挠H和篩選法（panning），洗去非特異結(jié)合的噬菌體，最終從噬菌體文庫(kù)中篩選出能結(jié)合篩選分子的目的噬菌體；外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面，而其編碼基因作為噬菌體載體（噬菌粒）基因組的一部分可通過(guò)分泌型噬菌體的單鏈DNA測(cè)序推導(dǎo)出來(lái)，使得表達(dá)蛋白（表型）和編碼基因（基因型）之間有機(jī)地聯(lián)系在一起。噬菌體顯示技術(shù)應(yīng)用范圍非常廣泛，主要應(yīng)用范圍包括：篩選與特異抗體或受體相互作用的蛋白質(zhì)。研究抗體或受體的結(jié)合位點(diǎn)；構(gòu)建隨機(jī)肽庫(kù)、抗體庫(kù)和蛋白文庫(kù)；改造和提高蛋白質(zhì)、酶和抗體的生物學(xué)和免疫學(xué)特性；研究新型多肽藥物、疫

52、苗和抗體；研究涉及到蛋白質(zhì)與核酸相互作用的生物學(xué)過(guò)程和新型的基因治療導(dǎo)向系統(tǒng)等。噬菌體顯示技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用具有如下主要優(yōu)點(diǎn)：可在細(xì)菌外完成對(duì)外源多肽、蛋白質(zhì)和抗體的研究并方便地獲得目的分子DNA序列。高度的選擇性，每一次親和篩選出的噬菌體感染大腸桿菌后，該噬菌體可得到1000倍甚至更多的擴(kuò)增，幾次循環(huán)后，可得到相互作用的序列；可以構(gòu)建大的噬菌體文庫(kù)，親和純化可在高濃度（103噬菌體/ml）下進(jìn)行；以往對(duì)生物大分子的相互作用研究需要對(duì)篩選分子結(jié)構(gòu)有詳細(xì)了解，而此項(xiàng)技術(shù)克服了研究蛋白質(zhì)相互作用的這種限制，這也是其得以廣泛運(yùn)用的直接原因。但該技術(shù)也存在著一些局限性，包括：多價(jià)展示中對(duì)于肽段大小

53、的限制；外源蛋白質(zhì)在宿主細(xì)菌中有時(shí)無(wú)法正確折疊或修飾；構(gòu)建的融合蛋白有可能會(huì)影響到蛋白質(zhì)本身的活性。3基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法蛋白質(zhì)鑒定是研究蛋白質(zhì)相互作用的重要步驟，而質(zhì)譜（massspectrometry,MS）分析技術(shù)的引入是蛋白質(zhì)鑒定中最重要的技術(shù)突破，它具有高通量、靈敏、準(zhǔn)確、自動(dòng)化等特點(diǎn)，已逐步取代傳統(tǒng)的Edman降解測(cè)序和氨基酸組成分析，成為蛋白質(zhì)鑒定的核心技術(shù)，已廣泛用于二維電泳、色譜分離的蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)復(fù)合體的鑒定。基于質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用的基本步驟主要由三個(gè)部分組成：靶蛋白制備，蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化，蛋白質(zhì)復(fù)合體的質(zhì)譜鑒定。蛋白質(zhì)復(fù)合體的純化方法主要有傳統(tǒng)的

54、親和層析和免疫共沉淀，以及新型的串聯(lián)親和純化（TAP）和生物傳感器技術(shù)（如Biacore技術(shù)）。根據(jù)純化蛋白質(zhì)復(fù)合體的方法的不同，可將基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)相互作用研究方法分為以下幾種。（1）親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)親和層析是一種傳統(tǒng)的純化蛋白質(zhì)復(fù)合體、研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。其基本原理是將某種蛋白質(zhì)以共價(jià)鍵固定在基質(zhì)（如瓊脂糖）上作為誘餌，讓含有與之相互作用的蛋白質(zhì)的細(xì)胞裂解液通過(guò)層析柱，先用低鹽溶液洗脫下未結(jié)合的蛋白質(zhì)，然后用高鹽溶液或SDS溶液洗脫結(jié)合在柱子上的蛋白質(zhì)，最后用多維液相色譜耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MDLC-ESI-MS/MS)鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。這種方法成功的先決條件是能夠得到足夠多的保持

55、生物活性的重組靶蛋白作為誘餌(bait)，以及獲得足夠量、純度高的與誘餌相互作用的蛋白質(zhì)用于質(zhì)譜鑒定。獲得純度高的相互作用蛋白質(zhì)的一個(gè)簡(jiǎn)單方法是利用含靶蛋白的融合蛋白，常用的為谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase，GST)融合蛋白,可以在谷胱甘肽-瓊脂糖(agarose柱子上純化相互作用蛋白質(zhì)。其它的還有蛋白A融合蛋白,可在含IgG的柱子上純化，含少數(shù)幾個(gè)組氨酸肽段的融合蛋白可在鎳柱上純化。親和層析耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)研究蛋白質(zhì)相互作用具有如下主要優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高：在高濃度靶蛋白存在的條件下，能檢測(cè)到微弱的蛋白質(zhì)相互作用；細(xì)胞裂解物中的所有蛋白質(zhì)與靶蛋白的結(jié)合機(jī)會(huì)均等；適應(yīng)

56、于檢測(cè)多亞基蛋白質(zhì)之間的相互作用。但是，運(yùn)用這種方法研究蛋白質(zhì)相互作用會(huì)碰到內(nèi)源性誘餌蛋白的表達(dá)以及非特異結(jié)合蛋白質(zhì)的干擾等問(wèn)題。(2)免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)免疫共沉淀是研究蛋白質(zhì)相互作用的一種非常有效方法，它以細(xì)胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，采用抗靶蛋白抗體與細(xì)胞總蛋白進(jìn)行免疫共沉淀(immuno-precipitation,IP)純化包括靶蛋白及其結(jié)合蛋白的免疫復(fù)合物，凝膠電泳將蛋白復(fù)合物分離后，應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白。抗體可以是單克隆，也可以是多克隆。如被分析的靶蛋白質(zhì)加上一個(gè)抗原決定簇標(biāo)簽(如FLAQ)，則可應(yīng)用抗FLAQ抗體進(jìn)行免疫共沉淀，免除對(duì)每一種被分析的靶蛋白均需制備其抗體的麻煩。至今該方法已對(duì)許多相互作用的蛋白進(jìn)行了成功的鑒定。我們采用免疫共沉淀耦聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞系中的p53相互作用蛋白進(jìn)行了研究。首先，用抗p53抗體分別與鼻咽癌細(xì)胞系HNE1和HNE2的總蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫共沉淀富集p53結(jié)合蛋白；一維聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)對(duì)免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)彳T分離；從膠中切取p53結(jié)合蛋白條帶、膠內(nèi)酶解后進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜(LC-ESI-MS/MS)分析，