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認(rèn)證類型：個(gè)人認(rèn)證

認(rèn)證主體：王**（實(shí)名認(rèn)證）

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IP屬地：天津 上傳時(shí)間：2022-03-17 格式：DOC 頁(yè)數(shù)：14 大小：337KB 積分：28 舉報(bào) 版權(quán)申訴

1、精品文檔基因定點(diǎn)突變?nèi)ヂ砸?、定點(diǎn)突變的目的把目的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。二、定點(diǎn)突變的原理定點(diǎn)突變是指通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因組，也可以是質(zhì)粒）中引入所需變化（通常是表征有利方向的變化），包括堿基的添加、刪除、點(diǎn)突變等。 定點(diǎn)突變能迅速、 高效的提高 DNA所表達(dá)的目的蛋白的性狀及表征，是基因研究工作中一種非常有用的手段。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間的復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是實(shí)驗(yàn)室中改造/ 優(yōu)化基因常用的手段。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其功能，二者之間的關(guān)系是蛋白質(zhì)組研究的重點(diǎn)之一。 對(duì)某個(gè)已知基因的特定堿基進(jìn)行定點(diǎn)改變、缺失或者插入，

2、可以改變對(duì)應(yīng)的氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)， 對(duì)突變基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行研究有助于人類了解蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，探討蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) / 結(jié)構(gòu)域。而利用定點(diǎn)突變技術(shù)改造基因：比如野生型的綠色熒光蛋白（ wtGFP）是在紫外光激發(fā)下能夠發(fā)出微弱的綠色熒光，經(jīng)過(guò)對(duì)其發(fā)光結(jié)構(gòu)域的特定氨基酸定點(diǎn)改造，現(xiàn)在的 GFP能在可見光的波長(zhǎng)范圍被激發(fā)（吸收區(qū)紅移），而且發(fā)光強(qiáng)度比原來(lái)強(qiáng)上百倍， 甚至還出現(xiàn)了黃色熒光蛋白，藍(lán)色熒光蛋白等等。定點(diǎn)突變技術(shù)的潛在應(yīng)用領(lǐng)域很廣， 比如研究蛋白質(zhì)相互作用位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)、改造酶的不同活性或者動(dòng)力學(xué)特性，改造啟動(dòng)子或者 DNA作用元件， 提高蛋白的抗原性或者是穩(wěn)定性、活性、研究蛋白的晶體結(jié)

3、構(gòu)，以及藥物研發(fā)、基因治療等等方面。通過(guò)設(shè)計(jì)引物，并利用 PCR將模板擴(kuò)增出來(lái)，然后去掉模板，剩下來(lái)的就是我們的PCR產(chǎn)物， 在 PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化，篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。三、引物設(shè)計(jì)原則引物設(shè)計(jì)的一般原則不再重復(fù)。突變引物設(shè)計(jì)的特殊原則：（ 1）通常引物長(zhǎng)度為2545 bp，我們建議引物長(zhǎng)度為3035 bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12 bp 。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，因?yàn)橐镏辽僖?1-12 個(gè) bp 才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少12 個(gè)

4、bp，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。（ 2）如果設(shè)定的引物長(zhǎng)度為30 bp，接下來(lái)需要計(jì)算引物的Tm值，看是否達(dá)到78（ GC含量應(yīng)大于40%）。（ 3）如果 Tm值低于 78，則適當(dāng)改變引物的長(zhǎng)度以使其Tm值達(dá)到 78（ GC含量應(yīng)大于 40%）。（ 4）設(shè)計(jì)上下游引物時(shí)確保突變點(diǎn)在引物的中央位置。（ 5）最好使用經(jīng)過(guò)純化的引物。Tm 值計(jì)算公式： Tm=0.41× (% of GC) 675/L+81.5。1 歡迎下載精品文檔注： L：引物堿基數(shù)；% of GC ：引物 GC含量。四、引物設(shè)計(jì)實(shí)例以 GCG ACG為例：5 -CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACT

5、TATTGCGG-3（ 1）首先設(shè)計(jì)30 bp 長(zhǎng)的上下游引物，并將A (T) 設(shè)計(jì)在引物的中央位置。Primer #1: 5 -CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3Primer #2: 5 -GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（ 2）引物 GC含量為 40%，L 為 30，將這兩個(gè)數(shù)值帶入 Tm值計(jì)算公式，得到其 Tm=75.5 （Tm=0.41× 40-675/30+81.5 ）。通過(guò)計(jì)算可以看出其 Tm低于 78，這樣的引物是不合適的，所以必須調(diào)整引物長(zhǎng)度。（ 3）重新調(diào)整引物長(zhǎng)度。Primer #1: 5 - CCTC

6、CTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3Primer #2: 5 - CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3在引物兩端加 5mer（斜體下劃線處） ，這樣引物的 GC含量為 45.7%，L 值為 35，將這兩個(gè)數(shù)值帶入 Tm值計(jì)算公式，得到其 Tm為 80.952 （ Tm=0.41× 47.5-675/35+81.5 ），這樣的引物就可以用于突變實(shí)驗(yàn)了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和 buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所

7、以要用那些GCbuffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。除了使用基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價(jià)格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq 酶、 Takara 的 PrimeSTARTM HS DNApolymerase 。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI 酶， DpnI 能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而 PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以 DpnI 酶能夠特異

8、性地切割模板（質(zhì)粒） 而不會(huì)影響 PCR產(chǎn)物，從而去掉模板留下 PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI 處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)，就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。七、如何拿到質(zhì)粒直接把通過(guò) DpnI 處理的 PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序，驗(yàn)證突變結(jié)果。2 歡迎下載精品文檔八、圖示九、定點(diǎn)突變操作步驟A 誘導(dǎo)突變基因 （ PCR反應(yīng)）以待突變的質(zhì)粒為模板， 用設(shè)計(jì)的引物及 Muta-direct ?酶進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)，誘導(dǎo)目的基因突變。1

9、.設(shè)計(jì)點(diǎn)突變引物。 注 參考引物設(shè)計(jì)指導(dǎo)2.準(zhǔn)備模板質(zhì)粒 DN A+DH5 菌株）作為宿主菌。在+ 注 用 dam型菌株（例如end 型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對(duì)突變效率沒有影響。提取質(zhì)粒DNA時(shí)我們建議您使用本公司的質(zhì)粒提純?cè)噭┖小?. 選項(xiàng) 對(duì)照反應(yīng)體系（ 50 l 反應(yīng)體系）10× Reaction Buffer5 lpUC18control plasmid （ 10ng/ l ，total2 l20ng）Control primer mix（ 20pmol/ l ）2 ldNTP mixture（ each 2.5mM）2 ldH2O38 lMuta-direct? E

10、nzyme1 l4.樣品反應(yīng)體系（50 l 反應(yīng)體系）。3 歡迎下載精品文檔10× Reaction Buffer5 lSample plasmid （ 10ng/ l ，total2 l20ng）Sample primer (F)（ 10pmol/ l ）1 lSample primer (R)（ 10pmol/ l ）1 ldNTP mixture（ each 2.5mM）2 ldH2O38 lMuta-direct ? Enzyme1 l5. PCR 反應(yīng)條件 注 按如下參數(shù)設(shè)置 PCR擴(kuò)增條件。CyclesTemperatureReaction Time1cycle9530s

11、ec15cycle9530sec551min721min per plasmid Kb6. PCR 擴(kuò)增反應(yīng)完成后冰育 5 分鐘，然后置于室溫（避免反復(fù)凍融）。 注 按下列提供的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當(dāng)突變點(diǎn)位點(diǎn)超過(guò)4 個(gè)時(shí)會(huì)發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。MutationCycles12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB突變質(zhì)粒選擇PCR反應(yīng)結(jié)束后使用Mutazyme?酶消化甲基化質(zhì)粒從而選擇突變質(zhì)粒DNA。1. 準(zhǔn)備 PCR反應(yīng)產(chǎn)物2. 加入 1 l （ 10U/ l ） Mutazyme?酶 37溫育 1 小時(shí)。 注 當(dāng)質(zhì)粒 DNA用

12、量過(guò)多時(shí)Mutazyme?酶可能發(fā)生與樣品反應(yīng)不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請(qǐng)嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作。如果突變率低， 可以適當(dāng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間或增加 Mutazyme?酶用量。C 轉(zhuǎn)化反應(yīng)完畢后在質(zhì)粒DNA上會(huì)產(chǎn)生缺口，當(dāng)把這個(gè)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入E.coli中時(shí)請(qǐng)選擇+型菌dam株，例如 DH5 。1. 將 10l 樣品加到 50 l 感受態(tài)細(xì)胞里，然后放置在冰上30分鐘。4 歡迎下載精品文檔2. 接下來(lái)可以參照一般的轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。序列分析通常當(dāng) LB 平板上出白色菌落則表明發(fā)生了突變。為了證實(shí)這一結(jié)果，我們建議對(duì)白色單菌落進(jìn)行測(cè)序分析。先講最簡(jiǎn)單的一個(gè)點(diǎn)的定點(diǎn)突變技術(shù)，其它較長(zhǎng)片段的突變

13、，刪除， 插入技術(shù)以后會(huì)慢慢奉上：在做實(shí)驗(yàn)之前，我們首先要搞清楚實(shí)驗(yàn)的目的和實(shí)驗(yàn)的原理。實(shí)驗(yàn)的目的應(yīng)該比較明確吧：就是要把自己的基因上面的一個(gè)堿基換成另外一個(gè)堿基。一般情況下我們會(huì)有幾種可能使我們需要這樣去做：第一： 我們吊出來(lái)的基因有點(diǎn)突變， 相信這可能是大家經(jīng)常會(huì)遇到的問(wèn)題?；蚝貌蝗菀椎醭鰜?lái)，并裝進(jìn)了自己的載體，卻發(fā)現(xiàn)有一兩個(gè)堿基跟自己的預(yù)期序列或所有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)不匹配，然后暴昏。大家實(shí)驗(yàn)室里面還是用Taq 酶為主吧， Pfu 這樣的高保真酶大家應(yīng)該用得不多吧，Taq酶的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)都很明顯：優(yōu)點(diǎn)就是擴(kuò)增效能強(qiáng)，缺點(diǎn)就是保真性差，其錯(cuò)配機(jī)率是比較高的，相關(guān)數(shù)字忘了，大家可以去網(wǎng)上查那個(gè)數(shù)字

14、，不過(guò)感覺如果是2000bp 的基因，如果擴(kuò)四五十個(gè)循環(huán)的話，很大機(jī)率會(huì)出現(xiàn)點(diǎn)突變，當(dāng)然這也跟具體PCR體系里的 Buffer有很大關(guān)系，詳細(xì)情況這里就不討論了。第二： 要研究基因的功能， 在基因上自己選定位置更換堿基的保守序列，或者改造成不同的亞型，總之就是要人工改造堿基序列符合自己的實(shí)驗(yàn)需要，相信這也是那些研究基因的人經(jīng)常的一種思路吧。對(duì)于第一種情況： 我們首先要分析出現(xiàn)堿基不匹配的位置是不是重要的位置，如果不是很重要， 大可不必管它， 比如說(shuō)是三聯(lián)密碼子的最后一位，堿基的改變并沒有引起相應(yīng)氨基酸的改變，那么一般情況下也可以不去理它。另外，在NCBI 上人類的基因的版本一直在變化，也就是說(shuō)

15、同一個(gè)基因有不同的版本，或者稱不同的亞型，其堿基序列有些許的差異，只要自己克隆出來(lái)的堿基序列與其中一個(gè)相匹配，一般也就可以不做定點(diǎn)突變了。如果有時(shí)間沒錢，那干脆重新 PCR然后再克隆進(jìn)自己的載體了，不過(guò)最好換個(gè)保真性好一點(diǎn)的酶如PFU，或者 PCR循環(huán)數(shù)低一點(diǎn)， 不過(guò)這些東西有時(shí)候也得靠運(yùn)氣啦。實(shí)在不行的話再來(lái)做定點(diǎn)突變。對(duì)于第二種情況：這種情況下一般也就只能做定點(diǎn)突變了。接下來(lái)開始聊一聊定點(diǎn)突變的原理吧，那個(gè)Stratagene試劑盒！上面有一個(gè)說(shuō)明書，說(shuō)得好像很正規(guī)， 不過(guò)上面好多都是什么專利啊什么注意之類的話，看都不看， 我們簡(jiǎn)明扼要地只講實(shí)驗(yàn)方面， 通過(guò)設(shè)計(jì)引物， 并利用 PCR將模板

16、擴(kuò)增出來(lái)， 然后去掉模板， 剩下來(lái)的就是我們的 PCR產(chǎn)物，在 PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個(gè)點(diǎn)變過(guò)來(lái)了，然后再轉(zhuǎn)化， 篩選陽(yáng)性克隆，再測(cè)序確定就行了。大家馬上就會(huì)想到幾個(gè)問(wèn)題了：第一：引物怎么設(shè)計(jì)呢？第二：模板怎么去掉呢？第三：怎么拿到質(zhì)粒呢？。5 歡迎下載精品文檔對(duì)于第一個(gè)問(wèn)題：怎么設(shè)計(jì)引物？我只能講一些原則，并舉一些例子。引物設(shè)計(jì)的原則其它貼子上都有講，這里就不重復(fù)了：不過(guò)這種突變引物要加上一個(gè)原則：一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長(zhǎng)度至少為11-12basepair 。若兩邊引物太短了，很可能會(huì)造成突變實(shí)驗(yàn)失敗，大家應(yīng)該都知道，引物至少要11-12個(gè) base pair

17、 才能與模板搭上，而這種突變 PCR要求兩邊都能與引物搭上，所以兩邊最好各設(shè)至少 12 個(gè) base pair ，并且合成多一條反向互補(bǔ)的引物。這么說(shuō)大家可能不是很清楚，那我就舉個(gè)例子吧：X71661.1 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 960 現(xiàn)有序列 TATCAGGAGGAATTTGAGCACTTTCAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAG 924 * *|-deletionX71661.1 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAA

18、TATTTGAGAGTGTAGGAGAT 1020現(xiàn)有序列 AAGGGCCACCCCGACCTCCAAGGGCAGCCTGCGGAGGAAATATTTGAGAGTGTAGGAGAT（上面 984 為目的序列， 下面為現(xiàn)有序列： 我們發(fā)現(xiàn)有一個(gè) A 堿基的缺失， 其直接結(jié)果是在表達(dá)蛋白時(shí)后面的氨基酸全部錯(cuò)配）我們以它為中心設(shè)計(jì)引物： 兩邊各至少 12 個(gè)堿基，左邊由于含有較多的 A 造成引物 GC% 含量過(guò)低，故拉長(zhǎng)引物使 GC%含量不至過(guò)低，也使引物退火溫度升高。故合成引物 CAACAAGAATTGGATAAAAAAAAAGAGGAATTCCAGAAG并合成反向互補(bǔ)引物CTTCTGGAATTC

19、CTCTTTTTTTTTATCCAATTCTTGTTG其實(shí)也不一定要反向互補(bǔ)序列，只要反向引物也是兩邊都有大于12 個(gè)堿基，同時(shí)符合引物設(shè)計(jì)的原則就行了。引物合成公司有很多家，大家可以去尋找，不同廠家的引物在價(jià)錢質(zhì)量上有一些差別，不過(guò)價(jià)錢一般都是一塊多一個(gè)堿基，合成時(shí)間約為一周。這樣的結(jié)果是PCR時(shí)把整個(gè)質(zhì)粒都給擴(kuò)出來(lái)了，得到的 PCR產(chǎn)物是一條鏈完整，另一鏈有缺刻的PCR產(chǎn)物對(duì)于第二個(gè)問(wèn)題：怎么去掉模板呢？再簡(jiǎn)單的方法就是用DpnI 酶，DpnI 能夠識(shí)別甲基化位點(diǎn)并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質(zhì)粒，從大腸桿菌里提出來(lái)的質(zhì)粒一般都被甲基化保護(hù)起來(lái)（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株）

20、，而 PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以 DpnI 酶能夠特異性地切割模板（質(zhì)粒）而不會(huì)影響PCR產(chǎn)物， 從而去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質(zhì)粒時(shí)那些菌株一定不能是甲基化缺陷株，不會(huì)那么湊巧吧，哈哈。關(guān)于第三個(gè)問(wèn)題：直接把通過(guò)DpnI 處理的 PCR產(chǎn)物拿去做轉(zhuǎn)化就行了，呵呵，然后再篩選出陽(yáng)性克隆，并提出質(zhì)粒，拿去測(cè)序（這個(gè)就不用我多說(shuō)了吧），驗(yàn)證突變結(jié)果，一般都沒問(wèn)題的啦，我做了幾十個(gè)突變了，到目前為止還沒有做不出來(lái)的，呵呵，不要砸我啊。6 歡迎下載精品文檔下面講一下具體的實(shí)驗(yàn)步驟以及一些實(shí)驗(yàn)中要注意的事情：1、 根據(jù)現(xiàn)有基因設(shè)計(jì)引物；2、 合成引物并準(zhǔn)備好模板；3、 PCR，4、 DpnI

21、處理酶切產(chǎn)物；5、 轉(zhuǎn)化酶切產(chǎn)物；6、 篩選 陽(yáng)性克??；7、 送測(cè)序并測(cè)全長(zhǎng)。最后就是慶祝啦，呵呵，沒什么復(fù)雜的。引物和質(zhì)粒都準(zhǔn)備好后，當(dāng)然就是做PCR嘍，不過(guò)對(duì)于PCR的酶和 buffer，不能用平時(shí)的，我們做PCR把整個(gè)質(zhì)粒擴(kuò)出來(lái)，延伸長(zhǎng)度達(dá)到幾個(gè)K，所以要用那些GCbuffer或擴(kuò)增長(zhǎng)片段的 buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來(lái)擴(kuò)增，防止引進(jìn)新的突變。那種 Quick change試劑盒分為幾種不同的類型什么 QuikChange? Site-DirectedMutagenesisKit 標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖小?QuikChange?XL Site-Directed Mutage

22、nesis Kit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖校?>8kb）從原理上是一樣的，只是 PCR的酶和 BUFFER不一樣， 后面用了比較適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的酶和BUFFER罷了，沒什么特別的東西。另外，DpnI 處理的時(shí)間最好長(zhǎng)一點(diǎn)，最少一個(gè)小時(shí)吧，最好能有兩三個(gè)小時(shí)，因?yàn)槿绻０逄幚淼貌桓蓛?，哪怕只有那么一點(diǎn)點(diǎn)，模板直接在平板上長(zhǎng)出來(lái)， 就會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。實(shí)驗(yàn)板長(zhǎng)出來(lái)的菌有兩種可能一種是質(zhì)粒 DPNI 沒處理干凈長(zhǎng)出來(lái)的（模板），一種是 PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化出來(lái)的（突變體）不過(guò)這兩種菌長(zhǎng)得一模一樣_ ，即使提出質(zhì)粒來(lái)也是一樣 （酶切和 PCR都無(wú)法區(qū)分），除了測(cè)序，是分不出來(lái)的，做 PCR時(shí)也最好做一個(gè)負(fù)對(duì)

23、照（不加引物） ，實(shí)驗(yàn)管由于 PCR時(shí)有引物，所以在DNPI處理前里面既含有模板又含有PCR產(chǎn)物，而對(duì)照管由于 PCR時(shí)沒放引物，所以在DPNI處理前里面只有模板。如果兩者都拿去 DNPI處理就能夠證明模板已經(jīng)被去除干凈。若實(shí)驗(yàn)順利的話應(yīng)該是：正對(duì)照長(zhǎng)菌負(fù)對(duì)照不長(zhǎng)菌。如果出現(xiàn)正負(fù)對(duì)照都長(zhǎng)菌，那么就是DpnI 沒處理好，如果正負(fù)對(duì)照都不長(zhǎng)菌， 那么有兩種可能，一種是PCR陰性，也就是說(shuō)PCR出問(wèn)題了，另外一個(gè)可能就是轉(zhuǎn)化出問(wèn)題了。要搞清楚是哪個(gè)問(wèn)題，跑膠說(shuō)明不了問(wèn)題，那就做個(gè)轉(zhuǎn)化的對(duì)照，拿試劑盒的對(duì)照實(shí)驗(yàn)去試感受態(tài)，馬上就能知道轉(zhuǎn)化有沒問(wèn)題。如果正對(duì)照很多菌，負(fù)對(duì)照有幾個(gè)菌，那么就是DPNI處理

24、得不干凈，這個(gè)時(shí)候就得靠運(yùn)氣了_大家有什么問(wèn)題我們可以繼續(xù)討論。另外，如果大家既沒有 DpnI 酶也沒有好的 PCR酶和 BUFFER的話，那也有其它辦法進(jìn)行定點(diǎn)突變，只是麻煩一點(diǎn)，如果大家有需要的話，我會(huì)把方法貼上來(lái)。7 歡迎下載精品文檔對(duì)于多點(diǎn)突變技術(shù)及較長(zhǎng)片段的缺失插入技術(shù)，同樣的， 如果大家有需要的話，我會(huì)把方法貼上來(lái)。不過(guò)，如果你有錢的話，那就去買那個(gè)試劑盒吧，其中QuikChange? Site-DirectedMutagenesis Kit標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)突變?cè)噭┖小?QuikChange? XL Site-Directed Mutagenesis Kit長(zhǎng)模板單點(diǎn)突變?cè)噭┖校?>8

25、kb）的原理我上面已經(jīng)說(shuō)了，只是補(bǔ)充了一些我認(rèn)為的注意事項(xiàng)。如果你更有錢的話，那么你可以叫其它公司幫你做定點(diǎn)突變服務(wù)，大約是改一個(gè)點(diǎn)1000 元左右。如果有需要我可以提供公司的聯(lián)系方式。下面我以一個(gè)例子為例來(lái)講100 個(gè) bp 以下的堿基插入缺失或者改變實(shí)驗(yàn)方案。其實(shí)這種方案并不是那么好的，只不過(guò)考慮到大家一般都沒有TYPEII 限制性內(nèi)切酶或者UDG andNTHIII （另外兩種方法） ，所以才打算先介紹這種方法。首先先說(shuō)明一點(diǎn)，這種方法在原理上存在一定成功機(jī)率，也就是說(shuō)有運(yùn)氣成分。而定點(diǎn)突變則一般都是百分之百成功的，而這種 100bp 以下的插入缺失或者堿基改變可能要測(cè)幾個(gè)克隆才能挑到一

26、個(gè)好的克隆，大家如果要用請(qǐng)慎重考慮。同樣的，我只變那幾十個(gè)堿基，并沒有改變載體及其它地方，所以我還是依賴于DPNI酶。舉例：Homo sapiens FzE3是一個(gè)人類基因，其含有32 個(gè)氨基酸的信號(hào)肽MRDPGAAAPLSSLGLCALVLALLGALSAGAGA，后面是成熟肽QPYHGEKGISVPDHGFCQPISIPLCTDIAYNQTILPNLLGHTNQEDAGLEVHQFYPLVKVQCSPELRFFLCSMYAPVCTVLDQAIPPCRSLCERARQGCEALMNKFGFQWPERLRCENFPVHGAGEICVGQNTSDGSGGPGGGPTAYPTAPYLPDLPFTA

27、LPPGASDGRGRPAFPFSCPRQLKVPPYLGYRFLGERDCGAPCEPGRANGLMYFKEEERRFARLWVGVWSVLCCASTLFTVLTYLVDMRRFSYPERPIIFLSGCYFMVAVAHVAGFLLEDRAVCVERFSDDGYRTVAQGTKKEGCTILFMVLYFFGMASSIWWVILSLTWFLAAGMKWGHEAIEANSQYFHLAAWAVPAVKTITILAMGQVDGDLLSGVCYVGLSSVDALRGFVLAPLFVYLFIGTSFLLAGFVSLFRIRTIMKHDGTKTEKLEKLMVRIGVFSVLYTVPATIVLACYFYE

28、QAFREHWERTWLLQTCKSYAVPCPPGHFPPMSPDFTVFMIKYLMTMIVGITTGFWIWSGKTLQSWRRFYHRLSHSSKGETAV，想在信號(hào)肽和成熟肽之間插入一個(gè)FLAG標(biāo)簽并在標(biāo)簽前面加上一個(gè)Leucine 。即在信號(hào)肽和成熟肽之間插入一段序列：TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG（一共三十個(gè)bp）、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：信號(hào)肽：ATGCGGGACCCCGGCGCGGCCGTTCCGCTTTCGTCCCTGGGCTTCTGTGCCCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGCGCACTGTCCGCGGGCGCCGGGGCG成熟肽：CAGCCGTACC

29、ACGGAGAGAAGGGCATCTCCGTGCCGGACCACGGCTTCTGCCAGCCCATCTCCATCCCGCTGTGCACGGACATCGCCTACAACCAGACCATCCTGCCCAACCTGCTGGGCCACACGAACCAAGAGGACGCGGGCCTCGAGGTGCACCAGTTCTACCCGCTGGTGAAGGTGCAGTGTTCTCCCGAACTCCGCTTTTTCTTATGCTCCATGTATGCGCCCGTGTGCACCGTGCTCGATCAGGCCATCCCGCCGTGT。8 歡迎下載精品文檔CGTTCTCTGTGCGAGCGCGCCCGCCAGGGCTGCGA

30、GGCGCTCATGAACAAGTTCGGCTTC CAGTGGCCCGAGCGCCTGCGCTGCGAGAACTTCCCGGTGCACGGTGCGGGCGAGATCTGC GTGGGCCAGAACACGTCGGACGGCTCCGGGGGCCCAGGCGGCGGGCCCACTGCCTACCCT ACCGCGCCCTACCTGCCGGACCTGCCCTTCACCGCGCTGCCCCCGGGGGCCTCAGATGGC AAGGGGCGTCCCGCCTTCCCCTTCTCATGCCCCCGTCAGCTCAAGGTGCCCCCGTACCTG GGCTACCGCTTCCTGGGTGAGCGCGATTGT

31、GGCGCCCCGTGCGAACCGGGCCGTGCCAAC GGCCTGATGTACTTTAAGGAGGAGGAGAGGCGCTTCGCCCGCCTCTGGGTGGGCGTGTGG TCCGTGCTGTGCTGCGCCTCGACGCTCTTTACCGTTCTCACGTACCTGGTGGACATGCGG CGCTTCAGCTACCCAGAGCGGCCCATCATCTTCCTGTCGGGCTGCTACTTCATGGTGGCC GTGGCGCACGTGGCCGGCTTCTTTCTAGAGGACCGCGCCGTGTGCGTGGAGCGCTTCTCG GACGATGGCTACCGCACGGTGGCGC

32、AGGGCACCAAGAAAGAGGGCTGCACCATCCTCTTC ATGGTGCTCTACTTCTTCGGCATGGCCAGCTCCATCTGGTGGGTCATTCTGTCTCTCACT TGGTTCCTGGCGGCCGGCATGAAATGGGGCCACGAAGCCATCGAGGCCAACTCGCAGTAC TTCCACCTGGCCGCGTGGGCCGTGCCCGCCGTCAAGACCATCACTATCCTGGCCATGGGC CAGGTAGACGGGGACCTGCTGAACGGGGTGTGCTACGTTGGCTTCTCCAGTGTGGACGCG CTGCGGGGCTTCGTGCTGGC

33、GCCTCTGTTCGTCTACTTCTTCATAGGCACGTCCTTCTTG CTGGCCGGCTTCGTGTCCTTCTTCCGTATCCGCACCATCATGAAACACGACGGCACCAAG ACCGAGAAGCTGGAGAAGCTCATGGTGCGCATCGGCGTCTTCAGCGTGCTCTACACAGTG CCCGCCACCATCGTCCTGGCCTGCTACTTCTACGAGCAGGCCTTCCGCGAGCACTGGGAG CGCACCTGGCTCCTGCAGACGTGCAAGAGCTATGCCGTGCCCTGCCCGCCCGGCCACTTC CCGCCCATGAGCCCC

34、GACTTCACCGTCTTCATGATCAAGTGCCTGATGACCATGATCGTC GGCATCACCACTGGCTTCTGGATCTGGTCGGGCAAGACCCTGCAGTCGTGGCGCCGCTTC TACCACAGACTTAGCCACAGCAGCAAGGGAGAGACCGCGGTATGA插入序列TTAATGGACTACAAAGACGATGACGACAAG通過(guò)引物 3 端大于或等于18 個(gè)堿基的匹配使引物與模板質(zhì)粒搭配，再通過(guò)引物5 端的序列來(lái)補(bǔ)上那三十個(gè)堿基，先用 PNK酶把引物磷酸化，再用下面這兩條引物把整個(gè)質(zhì)粒給擴(kuò)增出來(lái)， 上游和下游引物就剛好把那三十個(gè)堿基給補(bǔ)上了，再參照引物的設(shè)計(jì)原則做一些潤(rùn)色，細(xì)心的朋友可以具體分析一下這兩條引物。擴(kuò)出來(lái)后再用DPNI 酶把模板質(zhì)粒去掉，再用連接酶把PCR產(chǎn)物的兩端連接起來(lái)（雖然是平端連接，可是由于是同一條PCR產(chǎn)物的兩端連接，效率會(huì)很高） ，轉(zhuǎn)化后，測(cè)序驗(yàn)證，OK。設(shè)計(jì)引物forward primer:GGACTACAAAGACGATGACGACAAGCAGCCGTACCACGGAGAGAAG88.5reserve primer: ATTAACGCCCCGGCGCCCGCGGACAGT86.9但是由于引物的合成是由3 端向 5 端合成，而且每