乙型肝炎病毒顆粒超離純化

1、1乙型肝炎病毒顆粒超離純化2常用離心機(jī)簡介 BECKMAN HITACHI SORVALL HEREUS EPPENDORF3低速離心: 6,000rpm以下4高速離心: 25,000rpm以下5超速離心: 30,000rpm以上67891.離心力2.相對離心力(RCF)3.沉降速度4.沉降系數(shù)(S)5.沉降時間和沉清因子(K)離心場中的基本物理概念1011 離心力 F=ma=m2r : 角速度(弧度rad/秒 ) =(2RPM)/ 60 r: 離心半徑12 相對離心力(RCF) 同一顆粒在離心時同地球的重力相比較后得到的值 RCF=離心力/重力=m2r/mg=2r/g =1.12r(RPM/

2、1000)21314 沉降速度V 在離心力場的作用下,單位時間內(nèi)沉淀物運(yùn)動的距離V= d2(p-m) 2r 18(f/f0)V大小與顆粒直徑(d2)成正比V與顆粒密度同介質(zhì)密度差(p-m) 成正比V與外加離心場(2r)成正比 當(dāng)顆粒密度等于介質(zhì)密度時,沉降速度接近于零V與介質(zhì)粘滯度成反比,粘滯度增加速度減慢V與顆粒形狀有關(guān).顆粒偏離球形越大f/f0的摩擦比也越大,速度越慢15 沉降系數(shù)(S) Svedberg 定義:單位離心力作用下的沉降速度 物理意義: 被測顆粒達(dá)到極限速度時所需要 的時間.單位為秒.1S單位=10-13seconds 沉降系數(shù)與物質(zhì)的質(zhì)量、形狀、密度等因素有關(guān),也受溫度,水

3、化密度,pH的影響,在實際工作中通過實驗測定. 蛋白質(zhì)：1-100S 核酸：10-1000S 病毒：100-1000S 細(xì)胞核：106-107S 完整細(xì)胞：107-108S 原核核糖體70S(30S,50S) 16 沉清因子k和沉降時間tK 因子主要由轉(zhuǎn)子決定。離心時，影響所需的沉降時間。離心分離某一物質(zhì)所需的離心時間t=K/S 試管中，分離所需的時間與距離成正比。K因子小，分離所需的時間更短。K因子還受轉(zhuǎn)速影響，轉(zhuǎn)速高，時間短。17各種離心方法 沉降速度法 差速離心法 速度區(qū)帶離心法 特點:主要按顆粒大小,形狀不同分離 沉降平衡法 密度梯度離心法（預(yù)制梯度，自成梯度） 特點:以顆粒的密度差分

4、離,與大小、形狀無關(guān)18差速離心法 原理：通過不斷增加相對離心力的辦法，使一個非均勻混合液內(nèi)的不同大小、形狀的顆粒分步沉淀。19 溶解的細(xì)胞（組織勻漿液） 600g 離心10min 沉淀（細(xì)胞核） 上清液（含細(xì)胞膜、線粒體 、溶酶體 核糖體、可溶性蛋白） 10000g離心10min 沉淀 上清液（細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體） （核糖體、可溶性蛋白） 100000g離心3h 沉淀 上清液 （核糖體） （可溶性蛋白）20速度區(qū)帶離心法 原理：在離心管預(yù)先裝入密度梯度材料（如蔗糖，CsCl 等），樣品鋪在梯度液頂部。同梯度液一起離心，利用各顆粒在梯度液中的沉降速度不同，使具有相同沉降速度的顆粒處于同一梯

5、度層內(nèi)，達(dá)到分離目的。21密度梯度離心法(預(yù)制梯度) 在離心之前在管中預(yù)先形成線性或非線性梯度,將樣品加入離心管中,經(jīng)長時間平衡離心,使樣品顆粒按其密度不同在梯度液中分布,這時顆粒密度等于周圍介質(zhì)的密度p=m22密度梯度離心法(離心自成) 利用某些重金屬鹽(如Cscl 等)同樣品均勻混合,長時間離心.在離心場的作用下,重金屬鹽重新分布,最后形成由管底密度高到液面密度低的密度梯度.此時,樣品中原先均勻分布的病毒顆粒隨周圍介質(zhì)密度的變化而上浮下沉,最終進(jìn)入與自身浮力密度相同的特定位置,只要轉(zhuǎn)速、溫度不變,則延長離心時間也不能改變這些顆粒的成帶位置.23 各類超速離心機(jī)轉(zhuǎn)子最高轉(zhuǎn)速允許離心管內(nèi)平均密

6、度為1.2g/cm3,超過該密度 ,減速 rpm實際= 1.2/實際密度rpm maxl 轉(zhuǎn)子超過壽命也要減速使用轉(zhuǎn)速限制24HBV顆粒分離 1 .差速離心分離:HBV 陽性血清用緩沖液對 倍稀釋,4000rpm離心30min后,棄細(xì)胞碎片等大沉淀塊.上清液再經(jīng)40000rpm離心3hr,使病毒顆粒沉淀,得到粗病毒液. 2.速度區(qū)帶分離:在離心管中加入70%(w/v)蔗糖2ml,上加20%(w/v)蔗糖4ml,將粗病毒液加在梯度液頂部,于30,000rpm離心4hr. 收集20%與70%(w/v)蔗糖中間混濁的中間層.25 3.預(yù)制梯度等密度離心分離:制備1.0-1.27g/ml/蔗糖密度梯度液,SW41 轉(zhuǎn)頭100,000g離心24小時后,分部收集.選擇合并密度1.2-1.24g/ml管作電鏡觀察.26預(yù)制梯度等密度離心分離: 石蠟油 樣品0.5ml 30% 蔗糖2ml 40% 蔗糖2ml 50% 蔗糖2ml 60% 蔗糖2ml 70% 蔗糖1ml 27 梯度液的密度測定1.微量取樣器法 精密加樣器, 萬分之一或十萬分之一秤 恒溫,用純水作對照.2.比重稱法3.折光儀法(A